材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.doczj.com/doc/cf15336685.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定 邵基伦环境工程专业 摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。 本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌．研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的结构和性质变化。结果表明，在25-28℃，pH7．5～8.5，D0 2-5mg／L，氨氮浓度100—150mg ／L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-[g(MLSS)/h]和10.1mg(NH4-N)-[g(MLSS)/h]的硝化细菌培养物．在这种富集培养过程中，硝化细菌培养物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随培养方法不同表现出明显差异。
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml
琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧
实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征； 确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征： 普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小 麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气 伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽 革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠 2）菌株：致病性大肠杆菌菌株 3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天： 1.）处死小鼠，无菌解剖 2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化； 3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h； 4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征； 第二天 5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。 甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。 柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。 第三天 １.观察现象，滴定检验
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基
肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。
（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与
JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文（设计） 题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定 学院：生物科学与工程学院 姓名： 学号： 专业：生物工程 年级： 指导教师：职称： 二0一一年五月
摘要 目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。 关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定
Abstract Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria. Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。