食品中蔗糖的测定方法酶－比色法
食品中蔗糖的测定方法，一般采用盐酸水解法。由于盐酸水解蔗糖过程中，还有其他
糖类被水解为还原糖，导致测定结果偏高。本标准采用的酶-比色法是在检索了近20年148
篇国外文献的基础上，经过反复实验、验证而制定的。由于酶法具有高度的专一性(β-果
糖苷酶只能催化蔗糖转化为葡萄糖和果糖)，灵敏度高，操作简便，因此测定结果准确。
蔗糖酶解后的产物-葡萄糖的测定方法，与GB／T 16285－96保持一致。
食品中蔗糖的测定方法GB／T 16286-96
酶－比色法
1 范围
本标准规定了用酶－比色法测定食品中蔗糖的方法，适用于各类食品中蔗糖的测定。
本标准最低检出限量为0.04μg(蔗糖)／mL(试液)。
2 原理
在β－果糖苷酶(β－FS)催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶(GOD)
在有氧条件下，催化β－D－葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D －葡萄糖酸－δ－
内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4 －氨基安替比林和苯酚生成红
色醌亚胺。在波长505nm处测定醌亚胺的吸光度，计算食品中蔗糖的含量。
β－FS
C12H22O11＋H2O ────> C6H12O6(G) ＋C6H12O6(F)
GOD
C6H12O6(G) ＋O2────> C6H10O6＋H2O2
POD
H2O2＋C6H5OH ＋C11H13N3O ────> C6H5NO ＋H2O
3 试剂
3.1 组合试剂盒
1号瓶：内含β－果糖苷酶(fructosidase)400U(活力单位)、柠檬酸、柠檬酸三钠；
2号瓶：内含0.2mol／L 磷酸盐缓冲液(pH＝7.6) 200mL，其中含4 －氨基安替比
林0. 00154mol／L；
3号瓶：内含0.022mol／L苯酚溶液200mL；
4号瓶：内含葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)800U(活力单位)、过氧化物酶(辣根，peroxidase)2000U(活力单位)。
1、2、3、4号瓶须在4℃左右保存。
3.2 酶试剂溶液
3.2.1 将1号瓶中的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为66mL，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使
酶完全溶解。此溶液即为β－果糖苷酶试剂，其中柠檬酸(缓冲溶液)浓度为0.1mol／L，
pH＝4.6。在4 ℃左右保存，有效期一个月。
3.2.2 将2号瓶与3号瓶中的溶液充分混合。
3.2.3 将4号瓶中的酶溶解在，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使酶完全溶解，
即为葡萄糖氧化酶－过氧化物酶试剂溶液。在4℃左右保存，有效期一个月。
3.3 0.085mol／L亚铁氰化钾溶液
称取3.7g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O，GB1273，分析纯]，溶于100mL 重蒸馏水中，摇匀。
3.4 0.25mol／L硫酸锌溶液
称取7.7g硫酸锌(ZnSO4·7H2O，GB666，分析纯)，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。
3.5 0.1mol／L氢氧化钠溶液
称取0.4g氢氧化钠(GB629，分析纯)，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。
3.6 蔗糖标准溶液
称取经100±2℃烘烤2h的蔗糖(HG3－1001，分析纯)0.4000g，溶于重蒸馏水中，定容
至100mL，摇匀。将此溶液用重蒸馏水稀释V10.00 －－>V100，即为400μg／mL蔗糖标准
溶液。
4 仪器和设备
实验室常规仪器及下列各项：
4.1 研钵或粉碎机。4.2 分析筛。4.3 组织捣碎机。4.4 恒温水浴锅。4.5 可见光分光光度计。
4.6 微量移液管:1.00mL，精度0.01mL。
5 试样的制备5.1 固体样品
粉末状样品: 取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
颗粒状样品：取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎，或用研钵研细，通过100
目分析筛，置于密闭的玻璃容器内。
新鲜水果、蔬菜等固体样品：取有代表性的可食部分至少200g，用组织捣碎机捣碎，
置于密闭的玻璃容器内。
5.2 糊状样品取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
5.3 固液体样品取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。
5.4 液体样品取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。
6 试液的制备
6.1 不含蛋白质的试样
用100mL烧杯称取试样(5.1～5.4) 0.5～10g(精确至0.0001g)，加少量重蒸馏水，转移
到250mL容量瓶中，用重蒸馏水定容至刻度。摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初的滤液30mL，即为试液。
试液中蔗糖含量大于2000μg／mL时，应适当增加定容体积。
6.2 含蛋白质的试样
用100mL烧杯称取试样(5.1～5.4) 0.5～10g(精确至0.0001g)，加少量重蒸馏水，转移
到250mL容量瓶中，加入0.085mol／L 亚铁氰化钾溶液(3.3)5mL、0.25mol／L 硫酸锌溶液(3.4)5mL和0.1mol／L氢氧化钠溶液(3.5)10mL，使蛋白质沉淀。用重蒸馏水定容至刻度，
摇匀后用快速滤纸过滤。弃去最初滤液30mL，即为试液。
试液中蔗糖含量大于2000μg／mL时，应适当增加定容体积。
7 分析步骤
7.1 标准曲线的绘制
用微量移液管取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL蔗糖标准溶液(3.6)，分别置
于10mL 比色管中，各加入1.0mL β－果糖苷酶试剂溶液(，摇匀，在36±1℃水浴锅
中恒温20min。取出后加入3mL葡萄糖氧化酶－过氧化物酶试剂溶液(，在36±1℃
水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL。用1cm比色皿，以蔗糖标准溶液含量为0.00 的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505nm处测定各比色管内溶液的
吸光度。
以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
7.2 试液吸光度的测定
用微量移液管取0.20～5.00mL (依试液中蔗糖的含量而定) 试液(6.1～6.2)，置于10mL
比色管中。以下按7.1步骤操作；但须用等量试液(6.1～6.2)调整分光光度计零点。
测出试液吸光度后，在标准曲线上查出对应的蔗糖含量。
8 分析结果的表述
食品中蔗糖的含量以质量百分率表示，按下式计算：
C 1 C
x ＝━━━━━━×━━━━━━━×100 ＝━━━━━━━━━━━
V 2 1000×1000 V 2
m ×━━━m ×━━━×10000
V 1 V 1
式中：x ──样品中蔗糖的含量，质量百分率，％；
C ──标准曲线上查出的试液中蔗糖含量，μg；
实验八甘蔗汁中总糖及蔗糖含量的测定（费林法） 一、原理 蔗糖的测定常以还原糖的测定为基础，样品经前处理后，加入稀盐酸，在加热条件下使蔗糖水解转化为还原糖，再以斐林试剂法测定试样水解后的总还原糖量（即食品中的总糖）及水解前的还原糖量（食品原有的还原糖），两者之差再乘以校正系数0.95即为蔗糖量。 二、操作步骤： 1、样品处理 准确吸取10.00mL甘蔗汁移入100m L容量瓶中。缓慢加入5mL乙酸锌溶液及5mL10.6%亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置后过滤，弃去初滤液，收集滤液，即样品处理液。 2、标定碱性酒石酸铜溶液（费林试剂）： （1）准确吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液及5.00mL乙液，置于150mL锥形瓶中。 （2）加水10mL，加入玻璃珠数粒。 （3）从滴定管滴加约9mL葡萄糖（转化糖）标准溶液，2min内加热至沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去，记录消耗葡萄糖标准溶的总体积。 （4）同时平行操作三份，取其平均值。 3、水解前样品中还原糖含量的测定： 取样品处理液，按还原糖法测定水解前的还原糖含量。（同实验七） 4、样品总糖量的测定： （1）吸取10.00mL样品处理液置于100mL容量瓶中。 （2）加入6mol/L 盐酸5mL，在68～70℃水浴加热15min。 （3）迅速冷却后加2滴指示剂，用20% NaOH中和（甲基红指示剂：溶液颜色由红变黄；酚酞指示剂：由无色变浅粉红色），加水至刻度，混匀，按还原糖法测定水解后的总还原糖含量。（同实验七）
三、实验记录及处理： 碱性酒石酸铜溶液的标定 10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖(转化糖)的质量mg。 葡萄糖标准溶液蔗糖标准溶液（转化糖） 标准溶液浓度 ρ,mg／ml 标定所耗标液的 体积V，ml 1 2 3 平均 1 2 3 平均 10mL碱性酒石酸 铜相当于葡萄糖 （转化糖）的质 量F，mg 公式:F1= ρ1× V1公式:F2 = ρ2× V2/0.95 食品中还原糖含量测定 水解前（试样原有还原糖）水解后(总糖) 试样量，ml 稀释过程 试样定容总体 积V，ml 样液预测总消 耗量V0，ml 样液正式滴定 总消耗量V1 ，ml 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 测得还原糖含 量，% 公式： 样品中还原糖 含量R1，% 总糖含量R2,% （以转化糖计） 蔗糖的含量，% 公式：蔗糖% = (R2-R1)×0.95 100 1000 V V m F % 计） 还原糖（以葡萄糖 1 ? ? ? = 或转化糖
发酵液中蔗糖的检测方法 参考依据：GB/T16265--2008GB/T5009.8-----2008 第一法：酶水解（酶电极法） 蔗糖的测定方法，一般采用盐酸水解法。由于盐酸水解蔗糖过程中，还有其他糖类被水解为还原糖，导致测定结果偏高。本标准采用的酶-比色法是在检索了近20年148篇国外文献的基础上，经过反复实验、验证而制定的。由于酶法具有高度的专一性(β-果糖苷酶只能催化蔗糖转化为葡萄糖和果糖)，灵敏度高，操作简便，因此测定结果准确。 1范围 本标准规定了用酶电极法测定发酵液中蔗糖的方法，适用于各类发酵液中蔗糖的测定。 本标准最低检出限量为0.04μg(蔗糖)／mL(试液)。 2原理 在β－果糖苷酶(β－FS)催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下，催化β－D－葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D－葡萄糖酸－δ－内酯和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。 β－FS C12H22O11＋H2O C6H12O6(G)＋C6H12O6(F) GOD C6H12O6(G)＋O2────>C6H10O6＋H2O2 由上述反应公式可知，一分子蔗糖水解产生一分子葡萄糖和一分子果糖，检测出葡萄糖的含量即为蔗糖含量。 3试样的制备 3.1按发酵罐无菌操作取样大约10毫升，取5ml放入离心管，离心除去菌体。’ 3.2用微量移液管取1.00mL上述离心上清液置于试管中，加入1.0mLβ－果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在36±1℃水浴锅中恒温20min。 3.3按照葡萄糖酶电极分析仪操作说明标定电极。 3.4取步骤3.2中的水解液500微升放入样品位，按照仪器操作说明进行测定。 第二法酸水解 1原理 样品经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，蔗糖容易被酸水解，水解后产生等量的D-葡萄糖和D-
三乙胺含量的测定
三乙胺含量的测定 参考标准（方法）：GB/T23964 1.实验原理 用毛细管柱气相色谱法分离和定量测定，从而得到三乙胺、乙胺、二乙胺和乙醇的质量分数。 2.适用范围 适用于工业三乙胺含量的测定。 3.试剂 3.1氢气：体积分数≥99.99% 3.2空气：不含腐蚀性杂质，使用前脱油、脱水 3.3氮气：体积分数≥99.99% 4.仪器 4.1自动进样器：带1μL进样针 4.2毛细管柱：SE-30，30m×0.53mm×7.0μm 4.3气相色谱仪：Aglient7890A,带FID检测器 5.测定步骤 5.1气相检测条件 5.1.1炉温：60℃ 5.1.2进样口温度：280℃ 5.1.3检测器温度：280℃ 5.1.4氮气：恒流，5.9ml/min,分流比50:1 5.1.5进样量：1μL 5.2峰的确定 用同样的操作条件分析已知的参考标准混合样品。以其保留时间来确认样品峰。
6.计算及结果表示 采用面积归一法定量计算各组分的质量分数。 7.允许差 两次平行测定的三乙胺含量的绝对差值不大于0.1%，杂质含量的绝对差值不大于0.02%。 8.注意事项 无 三乙胺中水分含量的测定 参考标准（方法）：GB/T23964 1实验原理 样品中水分与电解液中的碘和二氧化硫发生定量反应，反应式为： I2+SO2+H2O→2HI+SO3 2I—-2e=I2 参加反应的碘分子数等于水的分子数，而电解生成的碘与所消耗的电量成正比。根据法拉第定律，用测量消耗的电量得出水的量。 2试适用范围 适用三乙胺中水分含量的测定 3.试剂 电解液：默克专用试剂 4.仪器 4.1卡尔费林水分测定仪：瑞士万通 4.2天平：精确至0.0001g 4.3微量进样器：50μL 5.测定步骤
食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准__。 第一法高效液相色谱法 3 原理 试样中的乳糖、蔗糖经提取后，利用高效液相色谱柱分离，用示差折光检测器或蒸发光散射检测器检测，外标法进行定量..。 4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 乙腈。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 标准溶液 4.3.1 乳糖标准贮备液（20 mg/mL）：称取在94 ℃±2 ℃烘箱中干燥2 h的乳糖标样2 g （精确至0.1 mg），溶于水中，用水稀释至100 mL 容量瓶中。放置4 ℃冰箱中。 4.3.2 乳糖标准工作液：分别吸取乳糖标准贮备液（4.3.1）0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈（4.1）定容至刻度。配成乳糖标准系列工作液，浓度分别为0 mg/mL，2 mg/mL，4 mg/mL，6 mg/mL，8 mg/mL，10 mg/mL。 4.3.3 蔗糖标准溶液（10 mg/mL）：称取在105 ℃±2 ℃烘箱中干燥2 h 的蔗糖标样1 g （精确到0.1 mg），溶于水中，用水稀释至100mL 容量瓶中。放置4 ℃冰箱中。。。 4.3.4 蔗糖标准工作液：分别吸取蔗糖标准溶液（4.3.3）0 mL，1 mL，2 mL，
GB 5009.9-85 食品中淀粉的测定方法 本标准适用于各类食品中淀粉含量的测定。 第一法酶水解法 1 原理 样品经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用淀粉酶水解成双糖,再用盐酸将双糖 水解成单糖,最后按还原糖测定，并折算成淀粉。 2 试剂 2.1 0.5%淀粉酶溶液: 称取淀粉酶0.5g，加100mL水溶解,加入数滴甲苯或三氯甲烷, 防止长霉，贮于冰箱中。 2.2 碘溶液:称取 3.6g碘化钾溶于20mL水中,加入1.3g碘,溶解后加水稀释至100mL。 2.3 乙醚。 2.4 85%乙醇。 其余试剂同GB 5009.8—85《食品中蔗糖的测定方法》第2章。 3 操作方法 3.1 样品处理 称取2～5g样品,置于放有折叠滤纸的漏斗内，先用50mL乙醚分5次洗除脂肪，再用 约100mL 85％乙醇洗去可溶性糖类,将残留物移入250mL烧杯内，并用50mL 水洗滤纸及 漏斗,洗液并入烧杯内,将烧杯置沸水浴上加热15min，使淀粉糊化,放冷至60℃以下，加 20mL淀粉酶溶液,在55～60℃保温1h，并时时搅拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液,应不显现 蓝色,若显蓝色,再加热糊化并加20mL淀粉酶溶液，继续保温，直至加碘不显蓝色为止。 加热至沸,冷后移入250mL容量瓶中，并加水至刻度,混匀,过滤,弃去初滤液。取50mL滤 液,置于250mL锥形瓶中,加5mL6N盐酸,装上回流冷凝器,在沸水浴中回流1h,冷后加2滴甲 基红指示液,用20%氢氧化钠溶液中和至中性,溶液转入100mL容量瓶中,洗涤锥形瓶,洗液 并入100mL容量瓶中,加水至刻度，混匀备用。 3.2 测定 按GB 5009.7-85《食品中还原糖的测定方法》4.2操作。同时量取50mL水及与样品 处理时相同量的淀粉酶溶液，按同一方法做试剂空白试验。 4 计算
8.5.14 蔗糖 仪器和设备：恒温水浴锅（65℃） 容量瓶（200mL、250mL） 移液管（5mL、50mL） 滴定管（50mL） 锥形瓶（500mL） 加热板或火炉（有三脚架和石棉网） 分析天平 秒表 试剂：盐酸（SG＝1.103） 盐酸（0.5M） 氢氧化钠（4M） 酚酞指示剂（1％） 费林氏试剂（A和B） EDTA溶液（4％） 浮石粉末 甲基蓝溶液（1％） 液体石蜡 玻璃珠 8.5.14.1 测量方法 （a）准确称量接近10g糖浆。 （b）用蒸馏水将糖浆转移至一250mL容量瓶中，加入10mL EDTA（4％）溶液，然后加蒸馏水至刻线。 （c）用称液管移取25mL稀释糖液，放入一200mL容量瓶（1）中，用来测定转化糖总含量。 8.5.14.1.1 酸转化处理和转化糖总含量的测定 （a）在容量瓶（1）中加入约30mL蒸馏水，然后将其浸入恒温水浴锅（65℃）中，加热10min。 （b）加入10mL盐酸（SG＝1.103），混合均匀。 （c）静置30min。 （d）将糖液调至中性：加入一滴酚酞，逐滴加入4M氢氧化钠溶液，直至糖液呈粉红色（一般需要16.5mL氢氧化钠）。然后逐滴加入盐酸（0.5M），直至指示剂粉红色恰好消失（需要的盐酸量一般不超过0.5mL）。加蒸馏水至刻线，混合均匀。 （e）分别用两移液管移取5mL费林氏试剂甲液和5mL费林氏试剂乙液放入同一500mL 锥形瓶，加入少量浮石粉末，4滴液体石蜡和3颗玻璃珠。 （f）用D的稀释转化糖浆装满滴定管，然后从滴定管中滴加15mL糖液至E的锥形瓶内，然后将其放在加热板上，加热直至沸腾（开始加热至溶液开始沸腾耗时不能超过2.25min）。（g）待溶液沸腾10～15s后，观察溶液的颜色，如果仍与费林试剂接近，则表明溶液中还有大量费林试剂未被还原，需要加入更多的糖汁。从滴定管中继续往锥形瓶中加糖汁。每加5mL糖汁后，让溶液沸腾几秒后，观察溶液颜色。若溶液颜色仍与费林试剂溶液接近，则继续加入糖汁直至试剂的原始颜色消失。 （h）加入3、4滴四甲基蓝溶液，从滴定管继续往锥形瓶加入糖液直至指示剂完全退色，即糖液恢复为亮橘色。 （i）在滴定过程中手要始终扶住滴定管旋钮，滴定结束时滴定管读数可近似认为是滴定消耗的糖液量。
关于旋光法测定蔗糖转化反应的实验报告 篇一：旋光法测定蔗糖转化反应的速率常数实验报告 旋光法测定蔗糖转化反应的速率常数实验报告 一、实验名称：旋光法测定蔗糖转化反应的速率常数二、实验目的 1、了解旋光仪的基本原理，掌握旋光仪的正确使用方法； 2、了解反应的反应物浓度与旋光度之间的关系； 3、测定蔗糖转化反应的速率常数。 三、实验原理 蔗糖在水中水解成葡萄糖的反应为： C12H22O11+H20→ C6H12O6+C6H12O6 蔗糖葡萄糖果糖 为使水解反应加速，反应常以H3O+为催化剂，故在酸性介质中进行水解反应中。在水大量存在的条件下，反应达终点时，虽有部分水分子参加反应，但与溶质浓度相比认为它的浓度没有改变，故此反应可视为一级反应，其动力学方程式为： lnC=-kt+lnC0（1） 式中：C0为反应开始时蔗糖的浓度；C为t时间时的蔗糖的浓度。当C=0.5C0时，t可用t1/2表示，即为反应的半衰期。 t1/2=ln2/k
上式说明一级反应的半衰期只决定于反应速率常数k，而与起始无关，这是一级反应的一个特点。 本实验利用该反应不同物质蔗比旋光度不同，通过跟踪体系旋光度变化来指示lnC与t的关系。在蔗糖水解反应中设β1、 β2、β3分别为蔗糖、葡萄糖和果糖的旋光度与浓度的比例常数C12H22O11(蔗糖)+H20→ C6H12O6 (葡萄糖)+C6H12O6 (果糖) t=0C0β1 0 0 α= C0β1 t=t Cβ1 ( C -C0)β2 ( C -C0)β3αt=Cβ1+( C -C0)β2+ ( C -C0)β3 t=∞0β2C0 β2C0 α∞=β2C0+β2C0 由以上三式得： ln(αt-α∞)=-kt+ln(α0-α∞) 由上式可以看出，以ln(αt-α∞) 对t 作图可得一直线，由直线斜率即可求得反应速度常数k 。四、实验数据及处理： 1. 蔗糖浓度：0.3817 mol/L HCl浓度：2mol/L 2. 完成下表：=-1.913 表1 蔗糖转化反应旋光度的测定结果 五、作lnt~ t图，求出反应速率常数k及半衰期t1/2 求算过程： 由计算机作图可得斜率=-0.02 既测得反应速率常数k=0.02 t1/2 =ln2/k=34.66min 六、讨论思考： 1．在测量蔗糖转化速率常数的，选用长的旋光管好？还是短的旋光管好？答：选用较长的旋光管好。根据公式〔α〕＝
饮料中总糖的测定 测定总糖通常以还原糖的测定方法为基础，将食品中的非还原性双糖，经酸水解成还原性单糖，再按还原糖的测定法测定，测出以转化糖的总糖量。 若需要单纯测定食品中的蔗糖量，可分别测定样品水解前的还原糖量及水接后的还原糖量，两者的差再乘以校正系数0.95就是蔗糖量，即1g转化糖量相当于 0.95g蔗糖量。 1.原理 样品除去蛋白质后，加入稀盐酸，在加热条件下使蔗糖水解转化为还原糖，再以直接滴定法或高锰酸钾法测定。还原糖测定原理是根据还原糖可以还原碱性酒石酸铜，生成氧化亚铜这一特性来决定的。碱性酒石酸铜溶液时有甲乙液混合而成。试剂甲为硫酸铜溶液，试剂乙为氢氧化钠与酒石酸钾钠的混合液。甲乙两中溶液的混合液与还原糖作用，在加热滴定时产生红色氧化亚铜，滴定终点可以借助次甲基兰做指示剂。次甲
基兰在碱性溶液中（加热至沸腾）可被还原成无色。 2.仪器 ！）恒温水浴箱 2）其他仪器同还原糖的测定 3试剂 1）6mol/L盐酸溶液 2）甲基红指示剂：称取0.1g甲基红溶于100Ml60%(体积分数)乙醇中。 3）200g/L氢氧化钠溶液 4）1mg/ml葡萄糖标准溶液：精密称取1.0000 g经过99℃士l℃干燥至恒量的纯葡萄糖，加水溶后移入1000 mL容量瓶中，加入5 mL盐酸 (防止微生物生长)，用水稀释到1000 mL。 5）碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000毫升 6）碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000毫升，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。
蔗糖的测定方法 1.原理样品经除去蛋白质后，蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。 2.适用范围GB5009.8-85。本方法适合于所有食物样品蔗糖的检测。 3.仪器（1）滴定管（2）25ml古式坩埚或G4垂融坩埚（3）真空泵（4）水浴锅 4.试剂除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 4.1 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 4.2 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 4.3 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 4.4 碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g 硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀释至500ml，用精制石棉过滤。 4.5 碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻
璃瓶中。 4.6 精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加2.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜已液浸泡数小时，用水洗净。再以3 mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软县委，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古式坩埚用。 4.7 0.1000mol/L高锰酸钾标准溶液。 4.8 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 4.9 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 4.10 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5.操作方法5.1样品处理：5.1.1乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约0.5～2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50 ml 水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及4 ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。 5.1.2酒精性饮料：吸取100 ml样品，置于蒸发皿中，用1 mol/L 氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4后，移入250 ml容量瓶中。加50 ml水，混匀。以下按5.1.1自"加10ml碱
蔗糖合成酶的测定方法 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA； 0.2%(W/V)BSA；2%PVP； 0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入50μL粗酶液， 50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20μL 50 mmol/LMgCI2， 20μL 100mmol/L UDPG， 20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖）， 30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作： 取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）= 式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）； V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml） 淀粉酶活性的测定 1方法 1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。 1.2测定方法 1.2.1酶液的提取 将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL 预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再
实验四食品中淀粉的测定方法 Method for determination of starch in foods (一)目的 掌握酶水解法测定各类食品中淀粉含量，了解酸水解法。 (二)原理（酶水解法） 样品经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用淀粉酶水解成双糖，再用盐酸将双糖水解成单糖，最后按还原糖测定，并折算成淀粉。 (三)仪器与试剂 1. 0.5%淀粉酶溶液：称取淀粉酶0.5g，加100ml水溶解，加入数滴甲苯或三氯甲烷，防止长霉，贮于冰箱中。 2. 碘溶液：称取 3.6g碘化钾溶于20ml水中，加入1.3g碘，溶解后加水稀释至100ml。 3. 乙醚。 4. 85%乙醇。 其余试剂同GB5009.8—85《食品中蔗糖的测定方法》。 (四)操作步骤 1.样品处理 称取2～5g样品，置于放有折叠滤纸的漏斗内，先用50ml乙醚分5次洗除脂肪，再用约100ml85%乙醇洗去可溶性糖类，将残留物移入250ml烧杯内，并用50ml水洗滤纸及漏斗，洗液并入烧杯内，将烧杯置沸水浴上加热15min，使淀粉糊化，放冷至60℃以下，加20m1淀粉酶溶液，在55～60℃保温1h，并时时搅拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液，应不显现蓝色，若显蓝色，再加热糊化并加20ml淀粉酶溶液，继续保温，直至加碘不显蓝色为止。加热至沸，冷后移入250ml容量瓶中，并加水至刻度，混匀，过滤，弃去初滤液。取50ml滤液，置于250ml锥形瓶中，加5ml6N盐酸，装上回流冷凝器，在沸水浴中回流1h，冷后加2滴甲基红指示液，用20%氢氧化钠溶液中和至中性，溶液转入100ml容量瓶中，洗涤锥形瓶，洗液并入100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。2.测定 按GB5009.7—85《食品中还原糖的测定方法》。同时量取50ml水及与样品处理时相同量的淀粉酶溶液，按同一方法做试剂空白试验。
蔗糖的测定方法 1.原理 样品经除去蛋白质后，蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。 2.适用范围 GB5009.8-85。本方法适合于所有食物样品蔗糖的检测。 3.仪器 （1）滴定管 （2）25ml古式坩埚或G4垂融坩埚 （3）真空泵 （4）水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 4.1 6 mol/L盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100 ml。 4.2 甲基红指示剂：称取10mg甲基红，用100ml乙醇溶解。 4.3 5 mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。 4.4 碱性酒石酸铜甲液：称取34.639g 硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5ml 硫酸，再加水稀释至500ml，用精制石棉过滤。 4.5 碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500ml，用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。 4.6 精制石棉：取石棉先用3mol/L盐酸浸泡2～3天，用水洗净，再加2.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡2～3天，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜已液浸泡数小时，用水洗净。再以3 mol/L 盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软县委，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用做填充古式坩埚用。 4.7 0.1000mol/L高锰酸钾标准溶液。 4.8 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g 氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 4.9 硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷却后加水稀释至1L。 4.10 3mol/L盐酸：量取30ml盐酸，加水稀释至120ml。 5.操作方法 5.1样品处理： 5.1.1乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约0.5～2 g固体样品（吸取2～10 ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50 ml水，摇匀。加入10 ml碱性酒石酸铜甲液及4 ml1mol/L氢氧化钠溶液，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。
实验三 白砂糖中蔗糖含量的测定 （旋光—检糖计法） 一、实验目的 1、了解白砂糖中蔗糖的含量； 2、掌握全自动指示检糖计的使用与维护。 二、实验原理 蔗糖分子中含有不对称碳原子而具有旋光性，旋光度的大小与蔗糖含量成正比，利用旋光计或检糖计即可测定出白砂糖中蔗糖的含量。 三、仪器 1、旋光计或检糖计 2、容量瓶 100 ml 3、烧瓶 100 ml 四、操作方法 1、精确称取白砂糖样品13.00g ，用水溶解并定容至100 ml ，摇匀，用干滤纸过滤，弃去初始滤液25 ml ； 2、取洁净的200 mm 旋光管一支，用其体积的2/3样品溶液洗涤两次，将样液充满旋光管，放入旋光计或检糖计中测定； 3、读取样液的旋光度数或国际糖刻度值，最好取3～5个读数的平均值，并记录样品溶液的温度。 五、计算 1、采用检糖计测定时： 在实际测定温度t ℃下读数为St （国际糖度o S ），将St 对温度进行校正得到校正糖度S 20（即测定结果），经计算可求出白砂糖中蔗糖的含量。 白砂糖中蔗糖的含量（蔗糖克数/100克白砂糖） =2×S 20 =2×St[1+0.00034（t-20）] 式中：S 20 —校正到20℃时检糖计读数 St —t ℃ 时检糖计读数 t ℃—测定时样液的温度 2、用旋光计测定时 在温度t ℃下读取旋光度αt ，由于α=[α]×CL/100 则 100][CL t D t ? =αα []L C t D t ??=αα100 式中：C — 样品溶液中蔗糖含量 L — 旋光管长度，200 mm []t D α—t ℃时，蔗糖的比旋光度 [][])20(0144.020--=t D t D αα （t=12～25℃ ） 其中[]20D α为20℃时蔗糖比旋光度，[]20D α=+66.536° 由于被检样液是将13g 样品溶解并稀释至100 ml ，亦即此样液100 ml 中有13g 样品，现已求出C （100ml 样液中含蔗糖克数），则白砂糖果中蔗糖含量为： 白砂糖果中蔗糖含量（克/100克）=10013?C
有效氧化钙的测定有如下两种方法：蔗糖法原理,氧化钙在水中的溶解度很小，20℃时溶解度为加入蔗糖就可使之成溶解度大的蔗糖钙，再用酸滴定蔗糖钙中的氧化钙的含量，反应如下： C12H22O11+CaO+2H2O─→C12H12O11CaO+2H2O C12H22O22O11CaO+2H2O+2HCl→C11H22O11+CaCl2+3H2O 试剂：蔗糖：化学纯。 酸：l标准溶液。(０.５mol/LＨＣl溶液：量取４５毫升盐酸，缓慢注入１０００ml 水。) 酚酞指示剂。 操作: 迅速精确称取～研成细粉的试样，置于250ml具有磨口玻塞的锥形瓶中，加入4g化学纯蔗糖及小玻球12～20粒，再加入新煮沸而已冷却的蒸馏水40ml。塞紧瓶塞。摇动15min，以酚酞为指示剂，用l酸标准溶液滴定至红色恰好消失，并在30s内不再现红色为止。 计算按下式计算有效氧化钙的含量： CaO（%）=W 式中：N──酸标准溶液的浓度； V──滴定时所耗用的酸标准液的量（ml）； W──试样量（g））。 注意事项测定时，不应使氧化钙生成碳酸钙，所以要用新煮沸过而尽量除去二氧化碳的蒸馏水，以免氧化钙溶于水后生成的氢氧化钙进一步与二氧化碳作用生成碳酸钙，使消耗的酸标准溶液量偏低。再者，因蔗糖只与氧化钙作用，而不与碳酸钙作用，所以称量试样要迅束，否则氧化钙会吸收空气中的二氧化碳变成碳酸钙，导致结果偏低。
酸量法测氧化钙含量 酸量法原理有效氧化钙溶于水后生成氢氧化钙，可用酸滴定氢氧化钙，从而测出有效 氧化钙的含量。 反应如下： CaO+H2O ─→Ca （OH ）2 Ca （OH ）2+2HCl ─→CaCl2+2H2O 试剂：l 酸标准溶液。(０.１mol/L ＨＣL 溶液：量取９毫升盐酸，缓慢注入１０００ml 水。) 酚酞指示剂。 测定方法： 准确称取研磨细的试样1g 左右，置于烧杯内，加入刚煮沸过的蒸馏水约300ml ，搅匀 后全部转移至1000ml 的容量瓶中，将瓶加塞不时摇动，约20min 后冷却，再加入新煮沸已 冷蒸馏水至刻度。混匀，过滤（过滤要迅速）。弃去最初100ml 滤液，吸取50ml 入锥形瓶中， 以酚酞为指示剂，用l 酸标准溶液滴定至红色消失且30秒不再出现即为终点。 计算：CaO （%）=50 *W NV 28×100 试中各项意义同蔗糖法。 注意事项所使用的蒸馏水必须重新煮沸过。过滤要迅速，以免氢氧化钙吸收空气中的二 氧化碳变为碳酸钙，而使结果偏低
蔗糖含量测定（方案一）： 果实中蔗糖含量测定可参考（薛应龙等.植物生理学实验手册〔M].上海:上海科学技术出版社，1985.135~138） 1实验原理：先用碱性溶液同植物材料的可溶性糖提取液一起加热，破坏其中的还原糖。然后用蒽酮法在较低的温度下，测定蔗糖中的果糖部分。不含果糖苷的其他糖类在较低的温度下不与蒽酮显色，材料中如含有其他带有果糖苷的非还原糖（如：棉子糖、松三糖和土木香粉）对测定会有干扰，但是在有蔗糖存在的生物材料中这些糖几乎是不存在的。一般的说此方法的精确性是很高的。 2实验仪器：衡温水浴，分光光度计、 3实验材料：植物的根、茎、叶。 4实验试剂：30%KOH的水溶液；蒽酮试剂【150mg 蒽酮溶于100ml 稀硫酸（76ml 浓硫酸溶于30ml 水中）】；标准蔗糖溶液（1 mg/ml）；转化酶溶液。 5实验步骤：植物材料在110摄氏度下杀死，经70~80摄氏度烘干研磨，称取50mg加3ml 80%的乙醇，在80摄氏度下提取半小时，离心取上清液，共提取3次。合并上清 液，加少许（约0.1克）活性炭脱色，并定容至10ml。根据蔗糖含量的多少 吸取0.1~1.0ml于试管中，沸水浴中加热浓缩至0.05~0.1ml（不要大于0.1ml， 否则显色时间要延长），加入0.1ml30%的KOH，在沸水浴中放10min，冷却 至室温。加入3ml蒽酮试剂，40摄氏度保温10~15min，在620nm测定吸光度 值。同时取20~100μg蔗糖（在0.1ml体积中）于一系列试管中，加入0.1ml 30%KOH以同法显色，做成标准曲线。据此计算植物材料中蔗糖的含量。如 植物材料中有其他含果糖苷的干扰物质存在，可将糖的提取物去掉酒精后，与 转化酶一起保温。200μg蔗糖水解97~99%。在与转化酶保温前后各测定一次， 两次结果相减，即为蔗糖测定结果。但转化酶也能水解棉子糖，而不水解松三 糖及土木香粉。 蔗糖含量测定（方案二）： （张志良等编．植物生理学实验指导[M]．高等教育出版社，2009，106．） 1实验仪器：分光光度计，恒温水浴锅，电子天平，烘箱，刻度离心管，带塞试管，漏斗。2实验试剂：2 mol/L NaOH(80 g/L),30% HCl，蔗糖标准液（取100mg 蔗糖用80%乙醇配成500mL溶液，即得200 μg/mL 标准液），间苯二酚溶液（0.1g间苯二酚溶液于 100mL 95%乙醇溶液，棕色瓶内保存）。 3实验材料：各种植物叶片或种子。 4 实验步骤： （1）制备提取液：植物叶片或种子，在110℃烘箱烘15min，然后调制70℃过夜。干叶片磨碎后，秤取50mg样品倒入10ml刻度离心管内加入4ml 80%乙醇，至于80℃水浴中不断搅拌40min ，离心，收集上清液，其残渣加2ml 80%乙醇重复提2次，合并上清液。在上清液中加入10mg活性炭，80℃脱色30min，80%乙醇定容至10ml，过滤后去滤液测定。 （2）标准曲线制作：取蔗糖标准液用80%乙醇稀释成系列（0、10、20、30、40、60、80、100μg/ml）浓度的溶液。分别取0.4ml 溶液，各自加入200μl 2mol/L NaOH，100℃煮沸5min，冷却，加入2.8ml 30%HCl，0.8ml 0.1%间苯二酚，摇匀，80℃水浴反映10min，冷却后再480nm测定OD值，以0浓度管调零。绘制蔗糖浓度-OD值曲线。 （3）测定：取提取液0.4ml，按上述步骤进行蔗糖含量的测定，读取OD值，并从标准曲线得到提取液中的糖含量，然后再进行计算样品中的蔗糖含量。 （4）注意：色素对本实验影响较大。
、植物组织中糖含量的测定 一、实验材料：苹果、梨、黄瓜等各种水果 二、实验目的：糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主 要原料和贮存物质。不同栽培条件，不同成熟度可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 三、实验原理： 1.糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物。糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区 620 nm 波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。 2. 酮糖在一定条件下和间苯二酚生成鲜红色物质，该物质在 480 nm 处有最大 吸收，该方法可用来测定蔗糖。测定时先用碱与样品共热，破坏其中的还原性糖，然后用间苯二酚测定蔗糖中的果糖部分。 3. 果糖与间苯二酚、盐酸共热生成的红色络合物在480 nm处吸收峰最高。 四、试剂配置： 80 % 乙醇 2 M NaOH 30 % HCl：用36 %的浓HCl配置。 葡萄糖、蔗糖和果糖标准液（1mg/ml）：用蒸馏水配置。 蒽酮试剂：150 mg蒽酮溶于100 ml 稀硫酸(76 ml 浓硫酸加入到30 ml 水中)。 0.1 % 间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100 ml 95 %的乙醇，避光保存。 五、实验步骤 1、提取
取0.5 g 植物组织，于2 ml 80%的乙醇中研磨后，转入两个2 ml 离心管中，75℃温浴10 min，5000g离心5 min，收集上清于10ml离心管中。沉淀用80 % 乙醇于75℃水浴重复抽提两次，合并上清液后，用80 % 的乙醇定容至10 ml。提取液用于可溶性总糖、果糖与蔗糖含量的测定。 注：将苹果的提取液稀释一倍。 2、可溶性总糖 取10 μl上述乙醇提取液，加入90 ul 80 % 的乙醇，加入3 ml 蒽酮试剂[150 mg 蒽酮溶于100 ml 稀硫酸(76 ml 浓硫酸加入到30 ml 水中)]，90℃保温15 min ，冷却后于620 nm处测吸光值。含量以μg·g-1鲜重表示。用20-100 μg 的葡萄糖同法测定，作标准曲线（体系中加入20-100μl葡萄糖，再用80 % 的乙醇补足剩余体积）。 3、蔗糖 取100 μl乙醇提取液，加入200 μl 2 M NaOH，100℃煮5 min，冷却后加入2 ml 30 %的HCl, 600 μl 0.1 % 的间苯二酚(0.1g间苯二酚溶于100 ml 95 %的乙醇)，80℃保温10 min，冷却后于480nm处测吸光值。蔗糖含量以μg·g-1鲜重表示。用20-100 μg 的蔗糖同法作标准曲线（体系中加入20-100μl蔗糖，再用80 % 的乙醇补足剩余体积）。 4、果糖含量测定 取10 μl乙醇提取液，加入190 μl 80 % 的乙醇、400 μl 0.1 % 的间苯二酚和2400μl 30 %的HCl ，80℃保温10 min，冷却后于480nm处测吸光值。果糖含量以μg·g-1鲜重表示。用20-100 μg 的果糖同法作标准曲线（体系中加入20-100μl果糖，80 % 的乙醇）。
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
（六）旋光法测定蔗糖转化反应的速率常数 一、目的要求 1、测定蔗糖转化反应的速率常数和半衰期。 2、了解该反应的反应物浓度与旋光度之间的关系。 3、了解旋光仪的基本原理，掌握旋光仪的正确使用方法。 二、仪器与试剂 WZZ-2B自动旋光仪，样品管，秒表，恒温槽，量筒，锥形瓶，蔗糖水溶液，盐酸水溶液 三、实验原理 蔗糖在水中水解成葡萄糖与果糖的反应为 C12H22O11（蔗糖）+ H2O C6H12O6 （葡萄糖）+ C6H12O6（果糖）为使水解反应加速，反应常常以H+为催化剂。由于在较稀的蔗糖溶液中，水是大量的，反应达终点时，虽然有部分水分子参加了反应，但与溶质（蔗糖）浓度相比可以认为它的浓度没有改变。因此，在一定的酸度下，反应速度只与蔗糖的浓度有关，所以该反应可视为一级反应（动力学中称之为准一级反应）。该反应的速度方程为：－dC/dt = kC 其中Ｃ为蔗糖溶液的浓度，k为蔗糖在该条件下的水解反应速度常数 该反应的半衰期与k的关系为：t1/2 = ln2/k 蔗糖、葡萄糖、果糖都是旋光性的物质，即都能使透过它们的偏振光的振动 面旋转一定的角度，称为旋光度，以表示。其中蔗糖、葡萄糖能使偏振光的振动面按顺时针方向旋转，为右旋光性物质，旋光度为正值。而果糖能使偏振光的振动面按逆时针方向旋转，为左旋光性物质，旋光度为负值。
反应进程中，溶液的旋光度变化情况如下： 当反应开始时，t=0，溶液只有蔗糖的右旋，旋光度为正值，随着反应的进行，蔗糖溶液减少，葡萄糖和果糖浓度增大，由于果糖的左旋能力强于葡萄糖的右旋。整体来说，溶液的旋光度随着时间而减少。当反应进行完全时，蔗糖溶液为零，溶液中只有葡萄糖和果糖，这时，溶液的旋光度为负值。可见，反应过程中物质浓度的变化可以用旋光度来代替表示。 ln （ t －） = － k t ＋ln （0－） 从上式可见，以ln （ t －）对 t作图，可得一直线，由直线斜率可求得速度常数k。 四、实验步骤 1、从烘箱中取出锥形瓶。恒温槽调至55℃。 2、开启旋光仪，按下“光源”和“测量”。预热10分钟后，洗净样品管，然后在样品管中装人蒸馏水，测量蒸馏水的旋光度，之后清零。 3、量取蔗糖和盐酸溶液各30毫升至干净干燥的锥形瓶，盐酸倒入蔗糖中，摇匀，然后迅速用此溶液洗涮样品管3次，再装满样品管，放入旋光仪中，开始记时。将锥形瓶放入恒温槽中加热，待30分钟后取出，冷却至室温。 4、记时至2分钟时，按动“复测”，记录。如此，每隔2分钟测量一次，直至30分钟（注意：数值为正值时使用“+复测”，数值为负值时使用“-复测”）。 5、倒去样品管中的溶液，用加热过的溶液洗涮样品管3次，再装满样品管，测其旋光值，共测5次，求平均值。 五、实验数据记录
食品中蔗糖的测定方法酶－比色法 食品中蔗糖的测定方法，一般采用盐酸水解法。由于盐酸水解蔗糖过程中，还有其他 糖类被水解为还原糖，导致测定结果偏高。本标准采用的酶-比色法是在检索了近20年148 篇国外文献的基础上，经过反复实验、验证而制定的。由于酶法具有高度的专一性(β-果 糖苷酶只能催化蔗糖转化为葡萄糖和果糖)，灵敏度高，操作简便，因此测定结果准确。 蔗糖酶解后的产物-葡萄糖的测定方法，与GB／T 16285－96保持一致。 食品中蔗糖的测定方法GB／T 16286-96 酶－比色法 1 范围 本标准规定了用酶－比色法测定食品中蔗糖的方法，适用于各类食品中蔗糖的测定。 本标准最低检出限量为0.04μg(蔗糖)／mL(试液)。 2 原理 在β－果糖苷酶(β－FS)催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶(GOD) 在有氧条件下，催化β－D－葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D －葡萄糖酸－δ－ 内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4 －氨基安替比林和苯酚生成红 色醌亚胺。在波长505nm处测定醌亚胺的吸光度，计算食品中蔗糖的含量。 β－FS C12H22O11＋H2O ────> C6H12O6(G) ＋C6H12O6(F) GOD C6H12O6(G) ＋O2────> C6H10O6＋H2O2 POD H2O2＋C6H5OH ＋C11H13N3O ────> C6H5NO ＋H2O 3 试剂 3.1 组合试剂盒 1号瓶：内含β－果糖苷酶(fructosidase)400U(活力单位)、柠檬酸、柠檬酸三钠； 2号瓶：内含0.2mol／L 磷酸盐缓冲液(pH＝7.6) 200mL，其中含4 －氨基安替比 林0. 00154mol／L； 3号瓶：内含0.022mol／L苯酚溶液200mL； 4号瓶：内含葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)800U(活力单位)、过氧化物酶(辣根，peroxidase)2000U(活力单位)。 1、2、3、4号瓶须在4℃左右保存。 3.2 酶试剂溶液 3.2.1 将1号瓶中的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为66mL，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使 酶完全溶解。此溶液即为β－果糖苷酶试剂，其中柠檬酸(缓冲溶液)浓度为0.1mol／L， pH＝4.6。在4 ℃左右保存，有效期一个月。 3.2.2 将2号瓶与3号瓶中的溶液充分混合。 3.2.3 将4号瓶中的酶溶解在3.2.2混合液中，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使酶完全溶解， 即为葡萄糖氧化酶－过氧化物酶试剂溶液。在4℃左右保存，有效期一个月。 3.3 0.085mol／L亚铁氰化钾溶液 称取3.7g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)623H2O，GB1273，分析纯]，溶于100mL 重蒸馏水中，摇匀。 3.4 0.25mol／L硫酸锌溶液 称取7.7g硫酸锌(ZnSO427H2O，GB666，分析纯)，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。 3.5 0.1mol／L氢氧化钠溶液 称取0.4g氢氧化钠(GB629，分析纯)，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。 3.6 蔗糖标准溶液 称取经100±2℃烘烤2h的蔗糖(HG3－1001，分析纯)0.4000g，溶于重蒸馏水中，定容 至100mL，摇匀。将此溶液用重蒸馏水稀释V10.00 －－>V100，即为400μg／mL蔗糖标准溶液。 4 仪器和设备