骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展
邴爱英宋文刚
(泰山医学院 , 山东泰安 271016
关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性
中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04
骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化为多种胚层细胞 [1－2], 更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能 , 进行异体移植时可避免免疫排斥反应 [3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。
20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充质干细胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又称 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分离出BMSCs , 发现其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。近年来 , 人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不同。
1骨髓间充质干细胞的分离与培养
BMSCS 的含量很低 , 约占骨髓有核细胞的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和扩增。目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要有 :贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂 , 纯度不够高。而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验条件要求高 , 需要骨髓量较大。目前最
常用的是贴壁筛选法与密度梯度离心法相结合的方法 , 既可以增加分离 BMSCs 的纯度 , 又避免影响 BMSCs 的活性 , 而且操作简便 , 成本不高 [4]。
1．1贴壁筛选法贴壁筛选法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法 , 是由Friedenstein 在 19世纪 70年代中期建立的。它是根据 BMSCs 在塑料培养瓶中贴壁生长的特性 , 通过定期换液除去不贴壁细胞 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。 Frieden-stein 等的工作创建了一种体外分离和培养的简便可行的方法。至今该方法仍是一种得到广泛应用的经典途径。
1．2密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同 , 使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞 , 再进行贴壁培养 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。 Pittenger 等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到 95%。
1．3流式细胞仪和免疫磁珠法常用方法为免疫磁珠法 , 是利用免疫学的技术分离 BMSCS , 分离细 945
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*基金项目 :国家自然科学基金项目 (30872322 。山东省自然科学基金项目 (2009ZRB01841 。泰山医学院科研计划课题 (20092RQN019 。
作者简介 :邴爱英 (1977— , 女 , 山东即墨人 , 讲师 , 硕士 , 主要从事医学免疫学实验教学和研究工作。
胞的纯度高。 Phinney [5]用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来 , 提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法 , 但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记 ; 而且 , 这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响 , 造成 BMSCS 损伤 , 出现增殖缓慢等问题 , 这些技术问题很
大程度上限制了这两种方法的应用。因此 , 如何能简便高效地获得均质性的间充
质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
1．4BMSCs 的培养、扩增最常用的是 LG-DMEM 培养基 , 含体积分数 10% 20%的胎牛血清 , 其中体积分数 10%的胎牛血清最有利于 BMSCs 的贴壁、扩增
及多系潜能的维持 , 体积分数过高时 , 血清中含有大量促进细胞增殖分化的因子 , 容易使细胞过早出现老化。但如果 BMSCS 要应用于临床治疗 , 则 BMSCS 应尽
量避免和胎牛血清或新生牛血清的接触 , 以避免污染疯牛病毒和异体蛋白增加的过敏风险。目前已有多项研究使用脐带血血清或人自体血清替代胎牛血清用于BMSCs 的培养 , 这样既可以避免上述风险 , 又因此类血清中含多种细胞因子 , 可
促进 BMSCs 的增殖、分化 , 因此为临床提供了一种安全有效的培养方法。此外 , 种植密度、氧体积分数及细胞因子都对 BMSCs 的培养有一定影响 , Lennon 等认为低密度种植有益于细胞扩增 , 氧体积分数低于 20%有利于干细胞功能的存留 , 血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子亦有较强的促进增殖作用。
2骨髓间充质干细胞的生物学特性
骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织 , 由基质细胞和细胞间基质构成。 BMSCS 主要有如下特性 :①形态学特征 ; ②具有自我复制、增殖能力 ; ③间充质干细胞的表面抗原标记 ; ④具有多向分化的能力。
2．1骨髓间充质干细胞的形态学特征
体外培养的 BMSCS 体积小 , 成梭形或多角形 , 核浆比大 , 多为平行排列生长
或漩涡状生长 , 部分贴壁细胞可以快速形成集落 , 一些呈典型的纺锤形样的BMSCS 增殖迅速 , 形态均一。细胞传代后 , 传代细胞较原代细胞的贴壁速度快 , 细胞传到第 3代时 , 细胞形态比较一致。
在光镜和相差显微镜下 , BMSCS 为长梭形 , 类似成纤维细胞外观。透射电镜下 BMSCS 可表现为两种不同的形态结构类型 :一种是处于相对静息状态的细胞 ,
核较大 , 核质比大 , 胞质内细胞器少 ; 另一种是处于相对活跃期细胞 , 细胞体积大于前者 , 核不规则 , 含 2 3个核仁 , 核质比小 , 胞质中有丰富的细胞器。
2．2骨髓间充质干细胞自我复制、增殖能力
BMSCS 在体外培养条件下生长与其它细胞一样 , 经历生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期。对细胞周期的研究显示 , 只有 10%的 BMSCS 复制活跃 , 而大多数细胞处于 G
/G
1
期 , 高比例的 G 0
/G 1
期细胞暗示 BMSCS 具有高度的分化潜能 [6]。 BM-SCS 能在体外多次传代仍保留其染色体核型和端粒酶活性。 Conget 等对培养条件下 BMSCS 的生长增殖进行了实验 , 发现成体 BMSCS 可以在体外分裂 (38? 4 次 , 并且保持纺锤形态和成骨潜能直至细胞衰竭。细胞进行冷冻复苏后培养可传代达 15次 , 细胞的增殖分化潜能未受影响。作为组织工程种子细胞 , 必须携带正常且完整的遗传信息 , 多次传代后这些遗传信息没有改变。
2．3骨髓间充质干细胞的表面标记
与造血干细胞不同 , BMSCS 的表面抗原并没有确定。已有数个抗体被用来鉴定 BMSCS , Stro-1阳性细胞具有多向分化能力 , 但是 Hung 等的研究提示体外扩增的 Stro-1阴性的骨髓间充质干细胞同样具有多向分化能力。单克隆抗体 SH2和 SH3被认为是对人 BMSCS 比较特异的标记 , SH2抗体认为是对应于细胞表面的 CD105抗原决定簇 , SH3抗体对应于 CD73。但是在 Lee 研究中 , 分离获得的BMSCS 具有典型的自我增殖和多向分化特性 , 但 CD105标记都为阴性。至今仍没有特异的标记物来鉴定 BM-SCS 类细胞 , 比较一致的看法是 , 对于所分离的 BM-
SCS 进行其表面抗原检测的意义 , 仅仅在于判断所获得的细胞的纯度或均一性 , 或是初步判断其为不同于骨髓造血干细胞的一类细胞 , 即骨髓间充质干细胞 [7]。
2．4骨髓间充质干细胞的多向分化
大量的体内外实验证明 , BMSCS 具有多向分化
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潜能 , 在不同的微环境下可向不同的组织细胞分化。比如 , 在培养基中加入适量的 DXM 、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸可诱导 BMSCS 向成骨细胞分化 [8]; 而加入适量的 DXM 、人胰岛素、 1-甲基 -3-异丁基黄嘌呤、消炎痛等可诱导BMSCS 向脂肪细胞分化 [9]; 另外 , 在特定的微环境下尚可诱导 BMSCS 向成软骨细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞、肝细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等三个胚层的组织细胞分化 [10－12]。但是诱导分化出的细胞在体内是否能有效的归巢到特定部位 , 并发挥有效的生理功能尚待更多的证据进一步研究。
3骨髓间充质干细胞的鉴定
BMSCs 的鉴定问题是目前的难点之一 , 其原因主要在于对 BMSCs 的特异性表面标记物仍存在争议。在体外 BMSCs 以易于贴附于塑料培养板为特征 , 未分化的基质细胞呈梭形或成纤维细胞形。通常采用其特征性的形态以及分化为其它基质细胞系的功能来鉴定。
国际间充质及组织干细胞委员会于 2006年对人来源 MSCs 实验研究提出三条最低鉴定标准 [13]:①在标准培养条件下 , MSCs 必须具备对塑料底物的贴附特性 ;
②通过流式细胞仪检测 , MSCs 群体表达 CD105、 CD73及 CD90阳性率≥ 95%, 且 CD45、 CD34、 CD14或 CD11b 、 CD79a 或 CD19、 HLA-DR 阳性率表达≤
2%; ③经体外诱导 , MSCs 必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。比较公认的鉴定标志是 BMSCs 既不表达造血细胞表面抗原 CD34、 CD45、CD14、 CD38, 也不表达淋巴细胞表面抗原 CD11a 、 CD11b , 但表达许多粘附分子 CD44、 CD166、 CD29等 , 同时表达一些基质细胞表面抗原 CD105(SH2 、
CD73(SH3、 SH4 以及一些细胞因子受体 IL-1R 、 IFN-γR 、 TNF-α, BMSCs 表达HLA-Ⅰ类抗原 , 基本不表达 HLA-Ⅱ类抗原 [14－17]。 SH2和 SH3为 BMSCs 相对特异性抗原 , 但其单抗来源困难 , 尚不能作为 BMSCs 常规检测指标。目前鉴定 BMSCs 主要依赖其形态及功能特征。
4应用前景
骨髓间充质干细胞是一类独特的干细胞 , 具有非常强的自我增殖能力和分化的多潜能性 , 可以被诱导分化成各种间充质组织 , 包括骨、软骨、肌肉、神经、血管内皮等细胞。由于其多向分化的潜能 , 兼有易于获得 , 对机体损伤小及体外扩增能力强的特点 , BMSCs 是组织工程理想的种子细胞 , 具有广阔的应用前景 [18－20]。骨髓间充质干细胞体外培养系统的建立有利于进一步研究其移植及分化机制 , 具有良好的应用前景。
体外培养的 BMSCs 具有多向分化潜能 , 如成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞等 , 把 BMSCs 植入体内不同组织内 , 可分化出多种不同组织细胞 , 表现出相应组织细胞的表型和功能 , 具有治疗相应组织脏器疾病潜在价值。诸多研究证实其在治疗骨软骨缺损、心脏疾病、血管疾病、神经系统疾病等方面具有重要应用价值 , 是目前研究最广泛的细胞之一 [21－23]。
5存在的问题
目前对骨髓间充质干细胞的认识和了解还在初步阶段 , 很多实验也表明间充质干细胞具有其它细胞难以比拟的优点 , 因此人们已迫不及待地把这些细胞运用于心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。但是在许多具体应用过程中还有很多问题有待研究 , 例如 :①寻找和鉴定 BMSCs 所特有的细胞表面标志分子。②对间充质干细胞本身特性的研究 , 包括它的真正起源、
如何能够快速获得纯的间充质干细胞等 , 尚需进一步研究。③体外诱导间充质干细胞多向分化效率不高。④间充质干细胞的相互作用 , 如间充质干细胞与造血干细胞间相互作用、间充质干细胞与不同成熟阶段的细胞相互作用直接对其生长、分化产生的影响等 , 都需要进行更深一步的研究和探索。
参考文献 :
[1]Dezawa M．Systematic neuronal and muscle induction systems in bone marrow stromal cells :the potential for tissue reconstruction in neurodegenerative and muscle degenerative diseases [J ]．Med Mol Morphol , 2008, 41(1 :14-19．
[2]Ladage D , Brixius K , Steingen C , et al．Mesenchymal stem cells in duce endothelial activation via paracine mechanisms [J ]．Endo-thelium , 2007, 14(2 :53-63．
155
泰山医学院学报
JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011
[3]Le Blanc K , Ringden O．Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience [J ]．Intem Med , 2007, 262(5 : 509-525．
[4]Aslan H , Sheyn D , Gazit D．Genetically engineered mesenchymal stem
cells :applications in spine therapy [J ]．Regen Med , 2009, 4(1 :99-108．
[5]Phinney DG．Isolation of mesenchymal stem cells from murine bone marrow by immunodepletion [J ]．Methods Mol Biol , 2008, 449:171-186．
[6]Sudo K , Kanno M , Miharada K , et al．Mesenchymal progenitors a-ble to differentiate into osteogenic , chondrogenic , and /oradipo-genic cells in vitro are present in most primary fibroblast －like cell populations [J ]．Stem Cells , 2007, 25(7 :1610-1617．
[7]Dvorakova J , Hruba A , Velebny V , et al．Isolation and character-ization of mesenchymal stem cell population entrapped in bone marrow collection sets [J ]．Cell Biol Int , 2008, 32(9 :1116-1125．
[8]Mohr S , Portmann －Lanz CB , Schoeberlein A , et al．Generation of an osteogenic graft from human placenta and placenta －derived mesenchymal stem cells [J ]．Reprod Sci , 2010, 17(11 :1006-1015．
[9]Vidal MA , Kilroy GE , Lopez MJ , et al．Charaterization of equine adipose tissue －derived stromal cells :adipogenic and osteogenic capacity and comparision with bone marrow －derived Mesenchy-mal Progenitor Cells [J ]．Vet Surg , 2007,
36(7 :613-622．[10]Shahdadfara A , Fransdala K , Hnug T , et a1．In vitro expansion of human mesenchymal stem cells choice of serum is ad etermi-nant of cell proliferation , differentiation , gene expression , and transcriptome stability [J ]．Stem Cells , 2005,
23(9 :1357-1366．
[11]Krampera M , Marconi S , Pasini A , et a1．Induction of neural －like differentiation in human mesenchymal stemcells derived from bone marrow , fat , spleen and thymus [J ]．Bone , 2007, 40(2 : 382-390．
[12]Ni WF , Yin LH , Lu J , et al．In vitro neural differentiation of bone marrow stromal cells induced by cocultured olfactory en-sheathing cells [J ]．Neurosci Lett , 2010, 475(2 :99-103． [13]Dominici M , Le Blanc K Mueller I , et al．Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells．The International Society for Cellular Therapy position statement [J ]．Cytotherapy , 2007, 9(3 :301-302．
[14]Anokhina EB , Buravkova LB．Heterogeneity of stromal precursor cells isolated from rat bone marrow [J ]．Tsitologiia , 2007, 49 (1 :40-47．
[15]Jackson L , Jones DR , Scotting P , et a1．Adult mesenchymal stem
cells :Differentiation potential and therapeutic applications [J ]．Postqrad Med , 2007, 53(2 :121-127．
[16]Abdallah BM , Kassem M．Human mesenchymal stem cells from basic biology to clinical applications [J ]．Gene Ther , 2008, 15 (2 :109-116．
[17]Delorme B , Charbord P．Culture and characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells [J ]．Methods Mol Med , 2007, 140(1 :67－81．
[18]Garcia-Castro J , Trigueros C , Madrenas J , et al．MesenchymaL stem cells and their use as cell replacement therapy and disease modelling tool [J ]．Cell Mol Med , 2008, 12(6B :2552-2565．[19]Dulchavsky D , Gao X , Liu YB , et al．Bone marrow －derived stromal cells (BMSCS interact with fibroblasts in accelerating wound healing [J ]．Invest Surg , 2008, 21(5 :270-279．
[20]Kumar S , Chanda D , Ponnazhagan S．Therapeutic potential of genetically modified mesenchymal stem cells [J ]．Gene Ther , 2008, 15(10 :711-715．
[21]Gnecchi M , Melo LG．Bone marrow －derived mesenchymal stem
cells :isolation , expansion , characterization , viral transduction , and production of conditioned medium [J ]．Methods Mol Biol , 2009, 482:281-294．
[22]Uccelli A , Moretta L , Pistoia V．Mesenchymal stem cells in health and disease [J ]．Nat Rev Immunol , 2008, 8(9 :726-736．
[23]Kumar S , Chanda D , Ponnazhagan S．Therapeutic potential of genetically medified mesenchymal stem cells [J ]．Gene Ther , 2008, 15(10 :711-715．
(收稿日期 2011-03-20
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泰山医学院学报 JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
?２２８?生国篮旦匡煎！Ｑ塑生！！旦笠！鲞筮丝塑￡！ｉ塑旦墼丛鲤：堕！！！Ｑ嫂：Ｙ丛：堡：些！：１２ 病情持久不愈，气血郁滞，经脉失畅，化湿生痰，痰血瘀结而致。根据其病机，选用小金丸治疗，取得较好疗效，值得推广。５治疗乳腺囊性增生病悼３ 将５００例乳腺囊性增生病患者随机分为治疗组和对照组各２５０例，对照组单用三苯氧胺治疗，治疗组在对照组相同治疗的基础上加用小金丸治疗。结果：治疗组总有效率为９２．０％，对照组总有效率为６７．６％，两组有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。乳腺囊性增生病系内分泌障碍性增生病，一是体内女性激素代谢障碍，尤其是雌孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全；二是部分乳腺实质成分中女性激素受体的质和量的异常，使乳房各部分增生程度参差不齐。三苯氧胺与此激素竞争受体，阻断过高的雌激素作用于乳腺组织，但部分患者临床效果甚微，或服药期间疗效较好，停药后复发。小金丸的药理实验证实对乳腺泡和导管增生有明显抑制作用，同时能抑制纤维母细胞摄取１４．甘氨酸减少胶原纤维合成，又能促进细胞吞噬胶原纤维及其断片，增强细胞溶酶体释放组织蛋白水解胶原纤维，从而消降纤维细胞的增生、粘连，疗效肯定，不良反应小，但疗程较长。中医学认为乳腺增生病主要是气机郁滞，痰瘀互结，冲任失调所致，治当理气化瘀散结，活血祛瘀为原则。小金丸方中麝香走窜通络，散结开壅，枫香脂调气血，土鳖消肿定痛，地龙通络，制草乌祛风湿，温经散寒，当归活血，香墨消肿化瘀，五灵脂、乳香、没药活血化瘀、消肿定痛。诸药合用有温通、活血、消壅、散结之效。可使气旺络通，痰散结消。配合三苯氧胺治疗乳腺增生病，标本兼治，故能取得较好疗效。 ６治疗慢性盆腔炎包块怕１ 将６０例患者（疾湿疥阻兼脾肾两虚型）分为２组各３０例，治疗组口服小金丸和血宝胶囊配合宫颈湿敷血竭粉治疗。对照组用西医抗炎治疗。治疗前后Ｂ超测量盆腔包块的大小、检测雌激素水平、观察临床症状消失的情况。结果：总有效率治疗组８６．６７％，对照组为６３．３３％，２组比较，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；随访半年复发率，治疗组为２３．０８％，对照组为６３．１５％，２组比较，差异有非常显著性意义（Ｐ＜０．０１）；雌激素水平治疗前后比较及治疗后组问比较，差异均无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。慢性盆腔炎包快属中医学瘢瘕范畴，多起于经行产后，胞脉胞络空虚，血室正开，痰湿之邪乘虚而入，蕴结胞宫；失治误治，余邪未净，迁延１３久，病及血分，致瘀积胞中，积聚成瘾。小金丸功能散结消肿，化瘀止痛，原用于痰气凝滞所致的瘰疬、瘿瘤、乳岩、乳癖，用于此药治疗盆腔炎包块属异病同治，有异曲同工之妙。现代药理研究表明小金丸具有抗炎、消肿、抗肿瘤和镇痛作用。血宝胶囊具有益肾健脾、补阴培阳之效。血宝既可助小金丸化痰散结、活血消ｊ｝毂之力，又可防止小金丸攻邪太过损伤正气。廊竭粉是伤科活血疗伤之圣药，取其破散瘾积宿血之功。内服外用双管齐下，共奏化痰散结、化瘀消瘕之功，使邪去而不伤正。本研究表明，用中成药扶正消瘾法治疗慢性盆腔炎包块具有无创性、服用简便、疗效好，复发率低的优点。 ７治疗结节性筋膜炎ｏ¨ ５例结节性筋膜炎患者，内服小金丸０．６ｇ，２次／ｄ。局部服用黄金膏（金黄散＋凡士林）＋四虎散（由生草乌、生半夏、生南星、狼毒组成）外敷，方法：根据肿块大小，先用金黄膏涂布于纱布上，再掺加四虎散，外面用单层纱布包裹，最后在药物表面撒少量蒸馏水，敷贴患处，每２ｄ换１次。结果５例均治愈。最短治愈时间２６ｄ，最长治愈时间３５ｄ，平均治愈时间３０．８ｄ。结节性筋膜炎又称为假肉瘤性筋膜炎，是一种发生于浅筋膜的良性增生性病变。小金丸具有消痰化坚、活血止痛、消结散毒的作用；金黄散清热、解毒、消肿、定痛；四虎散化痰散结止痛。内外治结合，共奏解毒化肿、化痰散结、活血止痛之效，故用于治疗本病能取得较满意的疗效。 参考文献 ［１］秦树光，等．小金丸联合甲状腺素片治疗甲状腺肿的ｌ｜缶床分析．现代中西医结合杂志，２００５，１４（８）：１０１８． ［２］屈江宁．小金丸治疗良性前列腺增生８０例．世界中医药，２００８，３（５）：２７７． ［３］马宝华，等．小金丸治疗带状疱疹后遗神经痛４４例．中国中医急诊，２００３，１２（５）：４７３． ［４］余勇．小金丸治疗聚合性痤疮２４例．医药导报，２０００，１９（３）：２６３． ［５］杨玉国，等．小金丸与三苯氧胺合用治疗乳腺囊性增生病２５０例分析．实用中医药杂志，２００５，２１（５）：２６１． ［６］邱明英，等．小金丸为主治疗慢性盆腔炎包块的临床研究．新中医，２００８，４０（４）：５５ ［７］吴亚旭．中药治疗结节性筋膜炎５例．江苏中医药，２００５，２６（１１）：２７． 间充质干细胞研究进展及其临床应用前景李玲玲李晶 【关键词】骨髓间充质干细胞；多向分化；组织工程 间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）通常是指从骨髓或其他组织中分离到的在体外具有多向分化潜能的一类细胞。自Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等首次报道骨髓中有少量细胞在培养过程中能贴壁分化形成类似骨、软骨的集落后，人们对这些细胞产生了浓厚兴趣。随后从鼠、兔、犬、人等多种动物的骨髓中均分离到了这种贴壁细胞。它们具有多向分化潜能， 作者单位：１３００２１吉林省前卫医院（李玲玲）；吉林省人民医院中西医结合科（李晶）在体外不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞…。 与软骨细胞、骨髓基质细胞、胚胎干细胞等相比，ＭＳＣｓ具有强大的增殖力、较强的多向分化潜能，而且具有取材方便、便于自体移植、便于外源基因转染及表达调控等诸多优点。最近。还发现ＭＳＣｓ具有免疫调节功能嵋ｏ。因此，ＭＳＣｓ是组织工程的一种新的理想种子细胞。目前，已知ＭＳＣｓ是源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中¨１。本文就ＭＳＣｓ 万方数据
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
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ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
经验交流 文章编号１００６－８１４７（２０11）０4-0458-03 人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析 刘长乐1，李广平1，郑心田1，孟恒星2，邱录贵2，娄建石3 （1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070） 关键词骨髓间充质干细胞；流式细胞术；培养模型中图分类号 Q813 文献标识码 B 骨髓（bone marrow ，BM ） 中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)。MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs 作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复 和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异 贴壁法和酶消化法建立MSCs 的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。1材料与方法 1.1材料（1）BM ：39岁男性健康志愿者5mL 。（2）仪器：FACScar 流式细胞仪（Beckman -Coulter ），倒置相差显微镜（OLYMPUS ），荧光显微镜（OLYM －PUS ） ，恒温培养箱（Forma Scientific ），高速低温离心胞系MHCC97-H 的增殖。骨髓间充质干细胞旁分泌物质或许通过分泌细胞因子影响肝癌细胞某一信号通路促进细胞增殖的。 AFP 是CBRH-7919肝癌细胞分泌的一种蛋白，本研究发现随着骨髓间充质干细胞旁分泌物质浓度的升高，AFP 也逐渐升高，表明骨髓间充质干细胞旁分泌物质也增强了7919肝癌细胞分泌AFP 的功能。 骨髓间充质干细胞促进肝癌细胞增殖的具体机制目前尚未明确，目前有以下几种学说：免疫抑制影响肿瘤基因的表达，分泌细胞因子以及参与肿瘤血管形成等[4-7]。邵志红等[5]发现大鼠骨髓间充质干细胞能通过影响Walker-256肝癌细胞VEGF 和nm23的表达,促进肝癌细胞的增殖。Li 等[6]发现人骨髓间充质干细胞是通过分泌细胞因子进而影响TGFβ信号通路促进肝癌细胞增殖的。尽管骨髓间充质干细胞对肝癌增殖的确切机制尚未明确，但有效地抑制骨髓间充质干细胞的促增殖作用具有重要的意义，其有可能成为新的抗癌靶点。笔者将继续研究骨髓间充质干细胞旁分泌物质促进肝癌细胞增殖的内在机制，为肝癌治疗带来新的希望。 参考文献： ［1］Lu YR,Yuan Y,Wang XJ,et al.The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo[J].Can-cer Biol Ther,2008,7(2):245 ［2］乔玲，赵铁军，山长亮，等.人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖 的作用及其基因表达谱分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23(12):1037 ［3］陈双庆，王培军，李铭华，等.磁标记骨髓间充质干细胞对肝细 胞癌的抑制作用[J].临床放射学杂志，2009，28(10):1454 ［4］Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood，2003,102(10):3837 ［5］邵志红，王培军，李铭华，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对 Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志，2009，89(7):491 ［6］Li GC,Ye QH,Xue YH,et al.Human mesenchymal stem cells in-hibit metastasis of a hepatocel lular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J].Cancer Sci,2010,101(12):2546 ［7］Zhu W,Xu W,Jiang R,et al.Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo [J].Exp Mol Pathol,2006,80(3):267 ［8］Zheng JF,Liang LJ.Transplanted bone marrow stromal cells are not cellular origin of hepatocellular carcinomas in a mouse model of carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2008,14(19):3015 ［9］Leek RD,Harris AL,Lewis CE.Cytokine networks in solid human tumors:regulation of angiogenesis[J].J Leukoc Biol,1994,56(4):423 ［10］Budhu A,Wang XW.The role of cytokines in hepatocellular carci-noma[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1197 （2011-04-27收稿） 作者简介刘长乐（1979-），男，主治医师，硕士，研究方向：冠心病、心律失常；通信作者：李广平，Email ：tjcardiol@https://www.doczj.com/doc/cb15157865.html, 。 Ｖｏｌ．１7熏Ｎｏ．4Dec.２０11 天津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University 第１7卷4期２０11年12月 458
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时，首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓，即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年，Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年，Friedenstein 和 Petrakova 首先报道，通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞（MSCs）。 1987 年，Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养，发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞，因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年，Pittenger 等在《Science》（科学）杂志上发表文章，对从骨髓标本中分离得到 MSC，应用流式细胞分析术分析 MSC，结果表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件诱导下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞，而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期