项目名称：儿童孤独症的遗传基础及其致病的机制
研究
首席科学家：夏昆中南大学
起止年限：2012.1-2016.8
依托部门：湖南省科技厅教育部
一、关键科学问题及研究内容
（一）拟解决的关键科学问题
已有的研究显示，孤独症具有高度的临床异质性。由于缺乏明确的疾病相关生化、病理、影像学等指标，孤独症的诊断均以行为障碍为依据。目前国际上孤独症诊断评价的最佳工具被认为是ADOS和ADI-R，但在国内并未被推广。孤独症的病因至今不明。流行病学调查显示孤独症的遗传度高达90%。近年来，通过染色体核型分析、连锁分析、GWAS、全基因组CNVs研究，已鉴定了多个相关的位点和易感基因，但由于孤独症高度的表型和遗传异质性，这些位点或基因很少能够被重复验证。此外，即使是已经发现的遗传变异，也只能解释10-20%的患者。环境因素也被认为是孤独症的主要病因之一，但由于缺乏系统的调查与研究，至今尚未发现确切的与孤独症发生有关的环境因素。最近几年，关于孤独症的神经生物学机制研究取得了一些重要的进展，对多个孤独症高度相关基因的功能研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路的异常可能是孤独症发生的重要分子机制。但总体而言，关于孤独症的分子致病机制研究还处于早期阶段，易感基因究竟通过什么机制参与疾病的发生、发展，其中所包含的调控机制是什么仍然是当前孤独症研究的重大问题。
根据目前的研究现状，我们提出2个需要解决的科学问题：
1、孤独症的遗传学基础：已有的研究显示，孤独症的易感位点或基因很难被重复验证。我们认为其根本原因在于孤独症具有高度的临床异质性，同时缺乏有效的疾病相关生化、病理、影像学等特征及临床内表型和亚型分类，导致孤独症易感基因研究中入组样本实际存在较大的不同质性。此外，多数研究以ASD、而不是典型的孤独症患者为研究对象，进一步导致了研究样本的不同质性。而决定其不同质性的主要原因是由于孤独症的遗传基础较非常复杂，染色体异常、CNVs、罕见基因变异、GWAS发现的常见变异等均与孤独症有关。尽管近年来孤独症的遗传基础研究取得了很大的进展，但将所有已发现的遗传因素合并起来，也仅能解释10-20%的孤独症患者。因此，进一步鉴定孤独症的易感基因、确定不同类型变异在疾病发生中的贡献度仍然是阐明孤独症遗传学基础的重要问题。通过鉴定孤独症临床内表型，进行临床亚型分类，并在此基础上鉴定易感
基因是解决这一问题的关键。
2、孤独症的神经生物学机制：已有研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能以及神经环路的异常似乎是导致孤独症发生的重要原因。然而，现有的研究尚未阐明孤独症发生、发展过程中神经元的生物学特征和功能、以及神经环路等的改变及相关调控机制。在疾病发生中，除了已知的少数通路之外，还有哪些分子、通过什么信号途径、生物学通路和调控机制来参与疾病的病理过程尚属未知。此外，由于遗传基础复杂，至今没有一个合适的孤独症动物模型，从而制约了疾病的发病机理研究进程。因此，在准确鉴定孤独症易感基因的基础上，选择合适的模型和策略开展神经生物学研究是阐明其发病机理的关键。
（二）主要研究内容
根据孤独症的研究现状及拟解决的科学问题，我们提出如下科学假说：孤独症具有明显的遗传易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以SNPs 等常见变异为代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常、新发CNVs和罕见基因突变等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础，并且在环境因素以及表观遗传异常的作用下造成神经发育、神经元可塑性、突触连接功能和神经环路异常，最终导致孤独症表型的出现。
图1 研究假说示意图
具体研究内容包括以下四个方面：
1、鉴定孤独症的临床表型和内表型：由于尚未发现特定的孤独症病理学特征，目前的诊断仅依赖ADOS，ADI-R等行为学量表，与其他神经精神疾病不同的是，孤独症高度的表型异质性加大了临床诊断的难度。本项目将充分发挥项目组孤独症临床实践和临床基础研究国内领先的优势，在建立孤独症临床和遗传资源库的基础上，详细鉴定孤独症的临床特征，特別注重孤独症患儿的社交障碍、语言障碍、刻板行为等核心症状，并利用生化、电生理、脑成像等技术发现潜在的内表型，建立孤独症核心症状等表型和内表型数据库，为诊断提供客观指标，为孤独症的病因学研究、特别是基于特征表型的样本入组提供科学支撑。
2、孤独症的遗传学基础研究：过去近十年的遗传学研究已鉴定了数十个孤独症易感位点或基因，并在某些基因中发现了高致病效应的罕见突变。孤独症的遗传度在90%以上，但已发现的遗传因素只能够解释10-20%的患者，因此孤独症的遗传基础在很大程度上还没有阐明。而且由于孤独症高度的表型异质性，针对某种临床亚型或内表型的遗传基础也很少有人探究。本项目将利用全基因组关联研究寻找孤独症的常见变异，通过全基因组CNVs扫描以及外显子捕获结合第二代测序技术寻找孤独症的罕见致病变异。在临床实践和研究工作的基础上，依据核心症状等临床亚型或内表型进行分组，开展基于临床亚型或内表型的GWAS 及第二代测序研究，鉴定孤独症易感基因。
3、孤独症的分子发病机制研究：由于遗传基础不明，缺乏合适的细胞和动物模型，孤独症的分子病理机制研究还处于早期阶段。本项目将利用遗传学、细胞生物学、生物化学与分子生物学以及电生理等方法，对前期研究工作已发现的和本项目新发现的部分易感基因开展研究，鉴定孤独症的神经生物学基础。同时，一方面建立患者来源的iPSCs并诱导分化为神经元作为细胞模型，另一方面选择几个高度相关的易感基因构建敲除、点突变敲入或过表达小鼠和果蝇模型，确定这些细胞和动物模型中神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路或行为学变化，预测相关基因在神经发育、突触功能和神经环路中的作用，以阐明孤独症的分子发病机制。此外，由于孤独症多基因遗传背景，单个基因变异可能无法构建符合孤独症行为学特征的动物模型，本项目拟利用最新的染色体工程技术，以发现的疾病相关CNVs为目标，探索构建孤独症的小鼠模型。
4、孤独症的分子调控网络和风险预测模型的构建：孤独症的临床和遗传异
质性说明多种病因（遗传、环境、表观遗传等）、多条生物学通路参与了疾病发生过程，从系统水平研究孤独症的发病机制将是一个有效的方式。本项目将利用生物信息学技术构建一个数据整合平台，将各个课题组的研究结果以及公共数据，包括环境数据、表型数据、影像学数据、基因组数据以及神经生物学数据等进行整合，并利用数学建模的理论和方法，构建孤独症分子调控网络，寻找潜在的生物学通路，结合转化医学建立孤独症风险预测模型，辅助孤独症的早期诊断和预防。
二、预期目标
（一）总体目标
通过临床实践和研究，发现部分孤独症的特征表型和内表型，对孤独症进行亚型分类，为制定符合国际标准，并具有神经电生理、影像学等特征的诊断体系提供科学数据；利用细胞遗传学、分子遗传学和基因组学技术，鉴定孤独症的易感基因，阐明疾病发生、发展的遗传学基础；利用生物化学、细胞生物学、分子生物学、电生理等技术，以及合适的细胞和动物模型，研究孤独症的神经生物学基础，阐明孤独症的分子发病机制；利用染色体工程技术，探索构建多基因遗传背景、符合孤独症行为学特征的动物模型，并应用于孤独症的发病机制和干预研究；利用生物信息学技术和数学建模方法，整合孤独症有关的临床、遗传、神经生物学等信息，构建孤独症分子调控网络，建立孤独症风险预测模型，为孤独症的早期诊断、早期干预和临床治疗提供科学依据。
（二）五年预期目标
1.建立一个10,000例样本以上的孤独症临床和遗传资源库，将孤独症样本以社
交障碍、语言障碍、刻板行为等核心症状为主细分临床亚型，并通过生化、电生理、脑成像等方法鉴定几个孤独症的内表型。
2.联合应用经典细胞遗传学、全基因组CNVs分析、GWAS以及第二代测序技
术，发现10-20个孤独症（或某些核心症状）的致病或易感基因。
3.选择若干已有的和本项目新发现的与疾病相关的易感基因，研究其生理功能
及其参与的神经生物学过程，初步阐明孤独症的分子致病机制。
4.建立10-20个孤独症患者特异性iPSCs细胞模型并分化为神经元，在孤独症
患者遗传背景下研究发病机理，建立5-10个孤独症易感基因突变的动物模型研究孤独症易感基因功能。
5.利用生物信息学技术整合大量样本的临床数据、影像学数据、基因组数据等，
寻找孤独症相关的生化通路和调控网络并构建一套孤独症网络分析预测模型。
6.在国际权威杂志上发表50篇以上的SCI 专业论文，其中IF≥10 的专业论
文8-10篇、IF≥20 的专业论文3-5篇。
7.培养一支创新团队和中青年学术带头人队伍，确定我国在孤独症病因和发病
机制研究领域前沿的学术地位。
8.促进国内外孤独症研究的学术合作和研究资源的交流，以加强我国儿童发育
性疾病的基础和临床研究。
（三）项目总体目标和五年目标的关系
项目总体目标是针对目前孤独症面临的现状，通过临床实践和研究，实现对孤独症的早期诊断、早期干预。在本项目中，经过五年的努力，我们将发现部分孤独症的特征表型和内表型，对孤独症进行亚型分类，为制定符合国际标准的诊断体系提供科学数据；发现孤独症的部分遗传基础；阐明孤独症的部分分子发病机制；构建动物模型，应用于孤独症的干预研究；构建孤独症分子调控网络，建立孤独症风险预测模型。五年目标是实现总体目标的基础，一方面可望鉴定孤独症的主要遗传学基础，初步阐明疾病发生的遗传学机制和分子病理机制，从而为全面认识其发病机理研究提供思路，为后续开展干预和治疗研究提供有效的细胞和动物模型；另一方面，获得的数据及构建的分子网络将为实现孤独症的早期诊断和早期干预提供重要的科学思路和依据。
三、研究方案
（一）学术思路和技术途径
通过临床特征表型、电生理和脑影像学研究等鉴定孤独症内表型，进行亚型分类；在内表型和临床亚型分类及前期研究工作的基础上，利用细胞遗传学、分子遗传学、基因组学及第二代测序技术，鉴定孤独症的易感基因，阐明疾病发生、发展的遗传学基础；以培养神经元、患者来源的iPSCs诱导神经元及易感基因动物模型，综合利用生物化学、细胞生物学、分子生物学、电生理、行为学等技术，研究孤独症的神经生物学基础，阐明其分子发病机制；采用染色体工程技术，构建多基因遗传背景的孤独症动物模型；整合孤独症有关的临床、遗传、神经生物学等信息，构建孤独症分子调控网络及风险预测模型，为孤独症的早期诊断、早期干预和临床治疗提供科学依据。
图2 总体技术途径
（二）创新点与特色
1.临床与基础的结合：国际上孤独症研究的样本多为ASD患者，具有高度临
床异质性，给基础研究工作带来很大困难。鉴定孤独症不同临床亚型的分类，消除样本表型异质性给基础研究工作，尤其是给遗传学研究带来的影响极其重要。本项目设置了一个有较强临床研究基础的课题组，通过临床表型、影像学等技术对遗传资源进行详细的临床亚型及内表型分类，进一步以特异的内表型对样本分组，由于分组患者有较高的同质性，有利于鉴定在孤独症发生中起重要生物学意义的易感基因。
2.学术理论的创新：本项目中我们提出的科学假说是“孤独症具有明显的遗传
易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以SNPs等常见变异为代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常，新发CNVs和罕见基因突变等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础，并且在环境因素以及表观遗传异常的作用下造成神经发育，神经元可塑性，突出连接功能和神经环路异常，最终导致孤独症表型的出现”。此假说是根据目前孤独症的研究现状提出的，具体依据包括：（1）已鉴定的易感位点或基因众多，但很少被重复验证；（2）近年的研究发现孤独症患者约3%携带染色体异常，约5%存在相关CNVs，提示在异常染色体和CNVs累及的区间存在与孤独症直接相关的易感基因；（3）罕见变异导致子代患病，但携带相同变异的父亲或母亲正常；（4）所有易感位点或基因加起来也只能够解释大约10-20%的患者。基于上述原因，我们认为孤独症的遗传基础与多数复杂疾病相比，存在一定程度的差异，除了通过关联研究发现的背景基因之外，可能有潜在的罕见主效基因，二者协同作用导致疾病的发生。
3.新技术的应用：目前复杂疾病的研究已经进入一个高通量的时代，本项目将
利用新一代高密度基因芯片进行全基因组关联研究和CNVs分析，利用新一代测序技术进行全外显子组测序，寻找孤独症新的罕见或新发致病突变，从基因组学水平系统研究孤独症的遗传病因。
4.孤独症患者来源的iPSCs的建立：由于孤独症的多基因遗传背景，根据单个
基因变异构建的细胞或动物模型很难模拟真正的孤独症表型。我们将利用患者来源的细胞构建具有孤独症遗传背景的iPSCs并定向诱导分化为神经元，以此细胞模型来研究孤独症的分子发病机制。
5.利用染色体工程探索构建孤独症动物模型：孤独症发病机制以及潜在的治疗
靶点的探索需要有效的动物模型，通用的动物模型仅涉及单个基因或2-3个基因，与孤独症的遗传基础不符。本项目在开展单个基因有关的动物模型研究同时，将利用最新的染色体工程技术，探索构建孤独症的多基因连锁群遗传背景（如疾病相关的CNVs）的动物模型，并对模型进行行为学评估。
（三）可行性分析
1、坚实的前期研究基础
研究团队具有丰富的临床诊疗经验并且已经诊治孤独症谱系障碍儿童约20000例，收集了近5000例孤独症样本。通过前期研究，已在全基因组学关联研究，外显子测序和易感基因的神经生物学研究积累了一定经验，为本研究的立项积累了坚实的遗传基础研究和大量的基因组数据。其全基因关联研究和外显子测序在国内尚属于首例。
本研究临床和遗传资源依托的中南大学精神卫生研究所、中山大学第三附属医院儿童发育行为中心、南京医科大学附属脑科医院儿童心理卫生研究中心、哈尔滨医科大学以及中南大学医学遗传学国家重点实验室在孤独症临床诊治、资源收集、保存和利用方面做了大量的工作。南京医科大学附属脑科医院儿童心理卫生研究中心是我国最早报道孤独症的单位，自1991年起一直从事孤独症的临床诊治工作，已收集孤独症核心家系200多个；中山大学附属第三医院近10年来也一直致力于孤独症的临床诊疗工作，积累了孤独症病例10000例以上，均有详细的临床资料及评估体系，收集了400个孤独症家系的临床资料及DNA样本（包括患儿与一级亲属）。哈尔滨医科大学2007年初开始建立孤独症核心家系生物样本库，目前已收集600个孤独症核心家系样本。中南大学精神卫生研究所和医学遗传学国家重点实验室近几年来也致力于孤独症的临床和基础研究，共收集孤独症临床和DNA样本 1676例，其中核心家系460个。这些资源充分保证了本项目对样本数量的要求。
本项目建议首席科学家夏昆教授和赵靖平教授合作，利用Illumina高通量芯片完成国内第一个孤独症全基因组关联研究（GWAS）和拷贝数变异（CNVs）
研究。本项目组前期利用收集的部分遗传资源进行了GWAS和CNVs分析。GWAS研究的初筛结果见图3。通过国际合作，在676个来源于AGRE的高加索人群孤独症核心家系中验证，发现了4个具有全基因组显著相关位点（p<5e-07），目前文章正在Nature杂志审稿。所发现的4个基因均位于以前的两个连锁研究定位的区域内，其中两个基因属于被认为对孤独症有重要作用的mTOR/PI3K通路。这为我们开展神经生物学研究，探讨孤独症发病机制提供了可靠的科学基础。
与此同时，发现了两个基因位点接近全基因组显著水平，与最近JAMA和Nat Genet报道与神经发育疾病和阿尔兹海默病有关的基因相同。利用先进的全基因组关联分析技术，我们的孤独症全基因组关联研究发现多个常见变异与孤独症相关，打破西方一些人认为CNVs是孤独症的主要遗传因素。通过本项目研究，我们将进一步加大样本量，以发现更多的易感基因。此外，全基因组CNVs 分析也得到了大量的有意义的结果，在验证已发现的CNVs位点的同时，发现了多个新发的和遗传的罕见CNVs，这些CNVs所包含的基因将成为我们接下来要重点研究的对象。
图3 全基因关联分析，统计分析结果按染色体绘图
中国科学院孙中生研究员前期开展的外显子组捕获结合第二代高通量测序研究，为在全基因组关联的基础上寻找功能变异（causal variants）积累了经验。前期研究中我们已经用外显子组捕获结合第二代测序技术对20个白人样品和10个独立的中国人孤独症病例进行了遗传突变的筛查，并且在更大的孤独症样本中
对结果进行了验证。发现了一个新的孤独症致病基因，目前文章正在Nat Genet 杂志审稿。这一成果的完成不仅发现了孤独症新发突变易感基因，而且还证明了运用第二代测序技术在孤独症遗传学研究中的作用，为本项目开展的研究工作开辟了新的思路，积累了宝贵经验。
本项目研究人员具有丰富的孤独症易感基因神经生物学研究经验。东南大学“发育与疾病相关基因”教育部重点实验室在国际上最早克隆了果蝇的dneuroligin (dnl)和dneurexin (dnrx)基因并发现它们与人类的Neuroligin和Neurexin有高度的同源性。对这两个基因的前期研究发现dnrx基因突变的幼虫有严重的运动缺陷，脑神经元突触数目减少，并且突触小泡分布也发生了明显的改变，幼虫和成虫的联想式嗅觉学习记忆被打断(Zeng, 2007)，DNRX参与突触囊泡再循环(Sun, 2009),dnl2突变体的NMJ中，DGluRIIA的募集量增加，DGluRIIB和DGluRIII的募集量减少；突触前活跃区的标记物Brp的spots的数量增多，突触后PSD的标记物D-PAK的cluster的面积明显变小，DNRX与DNL2相互作用，参与突触分化和突触成熟(Sun, 2011)。小鼠神经细胞培养体系中的初步研究显示，在代谢型谷氨酸能受体依赖的长时程抑制(mGluR-LTD)的情况下，Neuroligin的突触表达受到神经活动的动态调控(未发表资料)，提示在mGluR-LTD情况下，Neuroligins和Neurexins跨突触相互作用对协调突触前、后改变有至关重要的作用。该研究可能为理解长时程突触可塑性的分子机制提供崭新的视野，为阐明孤独症的神经生物学机制奠定前期基础。
2、完善的技术平台和雄厚的科研实力
中南大学医学遗传学国家重点实验室、中国科学院北京生命科学研究院和中国医学科学研究院具有整套先进的医学遗传学研究技术平台，包括Illumina BeadArray高通量基因分型系统，HiSeq2000 第二代高通量测序仪和Sun高性能计算机系统等设备和相应的技术支持。研究团队在细胞遗传学、分子遗传学、表观遗传学、基因功能组学等方面做出了显著成绩，相关研究总计发表论文600余篇，部分论文发表在Nat Genet，J Clin Invest，PNAS等国际一流杂志。
中南大学精神卫生研究所是我国四大精神卫生区域中心之一，学科现有6个国内一流各具特色的研究方向，分别是临床心理评估、精神应激、成瘾行为、精神药理与生物精神病学、儿童精神病与精神卫生、精神疾病脑影像与脑电生理
诊断研究方向。在神经精神性疾病的临床研究方面有雄厚的基础和实力。在JAMA, Am J Psychiatry, Mol Psychiatr等国际一流杂志发表论文多篇。
东南大学“发育与疾病相关基因”教育部重点实验室和中南大学医学遗传学国家重点实验室建成了以小鼠、果蝇、线虫等模式生物基因修饰的共用平台，拥有分子和细胞神经生物学、神经生理学、神经药理学、分子影像学和基因敲除/转基因设施以及SPF级小鼠饲养中心等实验软硬件条件，还具有包括2台大型电子显微镜、7.0T MRI动物专用micro-MRI、2台单光子激光共聚焦显微镜(Zeiss，Olympus)，活细胞工作站(Time Lapse Microscope，Zeiss)，倒置荧光显微镜、正置荧光显微镜、体视荧光显微镜、双光子激光共聚焦显微-电生理分析系统、4套电生理记录系统（含双通道膜片钳记录系统）、莱卡UC6新型超薄切片机、动物行为学检测系统、脑片LTP记录系统。这些实验平台和大型仪器设备等将成为本973项目重要的支持力量，充分保证本项目的顺利实施。
电子科技大学神经信息教育部重点实验室是三期985重点建设实验室。2011年学校已立项2500万建设以磁共振成像3.0T为平台的脑研究中心，目前有3套128道脑电采集系统和电生理采集系统。30台4核和8M，1.5T硬盘的高档计算机分析系统，目前已在神经精神疾病脑影像研究中取得了重要研究成果，发表50余篇高水平SCI论文，可以满足数据采集和分析的需要。为孤独症脑成像的内表型研究提供了有力条件。
上海生物信息技术研究中心已经建立了可操作的生物信息资源汇交平台和基因组功能注释、生物芯片数据分析、蛋白质组数据分析技术平台。还建立了人类疾病相关基因的高通量生物信息学筛选技术体系，拥有IBM、SUN、SGI等大型服务器9台，PC集群三套，总CPU个数超过200个，存储容量超过40TB。保证了本项目的生物信息学的软件和硬件需求。
（四）课题设置
围绕本项目拟解决的关键科学问题，我们共设置了5个课题，课题设置思路如下图：
图4 课题设置思路图
课题1：孤独症临床亚型、内表型及影像学研究
研究目标：
前期研究中，我们已经收集了近5000例孤独症临床资料及DNA样本，其中家系1500多个（患儿及一级亲属）。前期研究已发现孤独症广泛表型中的某些特定表型符合可遗传性、家族聚集性及与疾病状态相对独立性等候选内表型的条件，课题组完成了孤独症患儿神经认知、功能影像学等预实验项目。本课题的主要研究目标是：1、收集孤独症家系及其血样标本，完善病例的诊断评估，以及家系成员的神经心理学指标、脑影像学指标、神经电生理指标及相应的生化、代谢指标等数量性状的测量，建立中国儿童孤独症临床，环境和遗传资源库；2、全面筛选具有可遗传性、家族聚集性、共分离以及疾病状态相对独立性的候选内表型，并进行内表型分组研究；3、通过与本项目其他课题组的合作寻找不同内表型的遗传学基础和致病机制，并探索内表型在孤独症临床中的早期预警及早期预防作用。
研究内容
1、建立中国儿童孤独症临床、环境和遗传资源库
（1）各参加单位协作，按照统一标准共同收集符合孤独症诊断访谈量表修订版（ADI-R）诊断标准的孤独症家系5000例，对患儿进行社交反应量表（SRS）及心理教育量表修订版（PEP-R）评估，并对一级亲属进行孤独症广泛表型评估。
（2）采用自编访谈表和一些代表性的量表收集患儿在胎儿时期及出生后的环境因素数据，分类整理，登记入册。
（3）在知情同意的原则下，采集患者及其父母的外周血，抽提DNA并建永生细胞株。
（4）根据患者样本的性别组成、年龄层次，随机选取3岁以上的正常人作为对照样本，采集外周血，抽取DNA。
2、鉴定孤独症的内表型
（1）对患儿及其一级亲属进行神经认知测试，包括威斯康辛卡片分类任务（WCST），韦氏记忆量表修订版（WMS-R），韦氏智力量表（WPPSI/WISC/WAIS）等，收集神经认知的数量性状数据。
（2）对患儿进行脑影像学指标（包括结构和功能影像学指标）、神经电生理指标（如：听觉诱发电位，事件相关电位，脑电图）及相应的生化、代谢指标等进行鉴定，收集相应的数量性状数据。
（3）根据数量性状与不同神经信号通路和神经网络通路的联系，采用表型-内表型建模的多重变量统计分析策略筛选候选内表型，并在其他神经精神疾病及普通人群中测量这些内表型在不同群体中的分布，建立孤独症候选内表型数据库，并对孤独症进行内表型分类。
3、对孤独症的临床亚型进行分类
综合表型评估的数据和已鉴定的内表型，对孤独症进行临床亚型分类，将孤独症细分为社交障碍、语言障碍、刻板行为等更多的临床亚型，以指导临床诊断和其他基础研究工作特别是孤独症的遗传病因学研究（课题二）。
对资源库中已明确临床亚型和内表型的样本，与本项目课题二和课题三合作，鉴定不同内表型和临床亚型潜在的遗传基础以及不同遗传背景下的致病机制，为孤独症针对性干预和治疗提供依据。
经费比例：20%
承担单位：中南大学、中山大学、电子科技大学、南京医科大学、哈尔滨医科大学
课题负责人：赵靖平
学术骨干：邹小兵、陈华富、柯晓燕、曾翎、武丽杰
课题2：孤独症的遗传基础研究
研究目标：
我们的研究假设认为易感遗传背景（常见变异）和某些基因的罕见或新发突变共同构成了孤独症的遗传学基础。针对这一假说，我们将结合课题一建立的资源库研究孤独症遗传学基础。本课题中我们主要有三个目标：1、利用经典细胞遗传学，全基因组CNVs扫描和第二代高通量测序技术等方法鉴定孤独症（或某些核心症状、特征表型）的罕见和新发变异。2、利用新一代高通量基因分型技术结合临床研究工作，对孤独症患者（或某些核心症状、特征表型）进行全基因组关联研究，寻找孤独症易感遗传背景（常见变异）。3、与课题三和课题四合作，在细胞和动物模型中鉴定我们发现的孤独症易感基因所参与的神经生物学过程，特别是它们如何参与神经元的发育、突触功能和神经环路等异常。这一研究将从系统水平上去阐明孤独症的遗传病因，并初步阐明孤独症遗传背景下的神经生物学机制。
研究内容
1、罕见或新发变异的鉴定
（1）对本项目新收集的孤独症患者采用高分辨染色体显带技术进行核型分析，寻找与孤独症相关的染色体异常。
（2）采用高通量的基因分型芯片对孤独症DNA样本和对照样本进行全基因组基因分型，并分别用PennCNV和QuantiSNP对患者和对照样本的分型数据进行全基因组CNVs分析。关注：①在患者和对照中存在显著差异的CNVs；②仅在患者中出现而在对照中没有出现的CNVs；分析该CNVs是父母遗传还是新发（de novo）；③与数据库比较，排除数据库中常见的、可能为多态的CNVs；
④与已有孤独症遗传变异数据库比较，分类已报道的CNVs和我们新发现的孤独症特异性CNVs。
（3）对相关的异常染色体和某些可能打断基因的CNVs，进一步通过基因组BAC克隆FISH、高密度基因芯片、长片段PCR等不同技术鉴定染色体断裂重接位点，确定DNA分子结构的改变，分析发生断裂的基因、产生的融合基因、缺失或重复的基因，以备候选。
（4）将上述候选基因在大样本量的孤独症患者和对照人群中采用经典的Sanger测序的方法对全部外显子和剪接位点进行重测序，以期发现高致病效应的罕见或新发突变，确定孤独症易感基因。
（5）与课题一合作，针对2-3种确定的内表型，每一种内表型选取20-30个样本，利用Illumina第二代高通量测序技术和Agilent液相外显子捕获系统进行全外显子组测序。寻找引起孤独症特定内表型的易感基因。
2、孤独症常见变异研究
（1）选择已收集孤独症资源库中的样本进行两种全基因组关联研究（GWAS）设计：1）核心家系的传递不平衡检验；2）病例-对照关联分析。利用Illumina新一代的高通量基因分型芯片对这两组样本进行基因分型。
（2）利用Plink等全基因组关联分析研究工具对核心家系和病例对照的基因型数据进行全基因关联分析研究。中国人群核心家系和病例对照作为初筛数据，在大样本量的高加索人群中进行验证，寻找孤独症易感区间。
（3）综合临床亚型和内表型信息，将不同临床亚型和内表型的孤独症样本进行分类，减小临床和遗传异质性，再进行全基因组关联分析。寻找特定内表型下的常见变异。
（4）对显著关联的易感区间，利用千人基因组计划数据，通过Imputation 的方法对已鉴定的区间进行精细定位，寻找真正致病（Causal）的变异。
3、研究易感基因的神经生物学功能
与课题三和课题四合作，将本课题组鉴定的孤独症易感基因在细胞和动物模型中研究其在神经元发育、突触功能和神经环路中的作用，阐明这些基因参与的神经生物学基础。
经费比例：25%
承担单位：中南大学、中国科学院、中国医学科学院
课题负责人：夏昆
学术骨干：孙中生、张风雨、孙玉慧、薛红、江泓
课题3：孤独症的神经生物学及分子致病机制研究
研究目标：
目前国内外研究表明，孤独症与其它脑疾病一样，也是神经发育异常而导致突触功能及神经环路异常的疾病，目前所发现的和推测的易感基因的蛋白质产物主要分布在神经元和突触部位。本课题主要有四个研究目标：1、针对课题二（孤独症的遗传基础研究）所发现的候选基因，从分子、细胞和整体等不同层次深入研究这些孤独症易感基因的表达、修饰、转运和分布及其调节机制；2、上述基因在神经元分化、突触发生和可塑性中的作用及其机制的离体研究；3、上述基因和已知孤独症候选基因的关联及机制；4、上述基因在小鼠神经环路及突触中的功能及机制的在体研究。
研究内容
1、基因的选择、表达定位和定向转运与机制
对已知及课题二中已发现的基因（如ANK等）和可能找到的新候选基因及其突变体进行筛选，选择3-5个和脑活动，特别是可能与孤独症核心症状有关的基因（例如与社交及认知障碍紧密关联），应用多种技术（如抗体制备，免疫标记，荧光蛋白GFP，YFP，mRFP，CFP融合，转染神经细胞，制备转基因果蝇，双光子激光共聚焦实时动态分析等），对有关基因表达的脑区域、细胞类型及超微分布及调节进行详细分析。我们将以小鼠（包括大脑皮层，海马区域CA1突触等）和具有脊椎动物中枢神经系统突触特征的果蝇神经肌肉接头（NMJ）作为主要研究模型，对有关基因在神经系统的表达规律、突触定位特征以及定向转运与机制进行深入研究。
2、候选基因在神经元分化、突触发生和可塑性中的作用及其机制
鉴于目前发现的孤独症相关基因（如neurexin和neuroligin等）产物主要在神经元和突触分布，我们将对上述发现的有关基因在神经元及突触中的功能及机制进行分析。通过Gain-of-function 和Loss-of-function途径，分析这些基因过量表达和缺失突变体对果蝇NMJ中电生理的变化及突触前、后结构与功能的影响；以转染神经细胞等方法（如shRNA及病毒表达）对有关基因和突变体对小鼠神经元细胞的分化、数量，形态(树突、轴突、spines)、种类(兴奋性，抑制性)，
突触形成和突触功能的可塑性（如LTP和LTD）的影响进行系统分析。其中，我们将特别着重应用双光子激光共聚焦—电生理分析系统，实时动态分析突触及亚突触结构与功能变化的特征。这些分析将共同阐明有关基因在突触发生、成熟及可塑性中的作用。
3、本项目筛选到的候选基因与已报道孤独症相关基因的关联研究
在已经建立的孤独症相关基因（如dnrx和dnl）研究成果的基础上，以酵母双杂交，免疫共沉淀、果蝇遗传筛选及其它方法，对本项目筛选到的候选基因与已报道的孤独症相关基因相互作用进行分析。应用Neurexin和Neuroligin C段胞内区和N段胞外端为诱饵进行酵母双杂交及体外PULL-DOWN证明所分析的基因产物是否存在直接相互作用；应用果蝇遗传学筛选技术，筛选（和/或验证）遗传上相互作用的上、下位效应基因。不仅针对经典的NMJ结构，还对包括中枢神经系统（mushroom body）等其它突触结构进行平行研究。同时探讨miRNA （如miRNA-92b，miRNA-124等）对突触形成的调控与功能的影响。
4、孤独症易感基因的动物模型和神经生物学功能及机制的在体（in vivo）研究
利用课题四制备的动物模型, 结合病人数据（课题一、二）及动物行为研究（课题四）进行一系列在体研究，其中包括：(1) 用常规染色及MRI 等脑成像技术, 系统分析脑体积，形态结构及脑亚区大小形态结构，我们将特別关注那些在孤独症患儿有关变化的脑区域；(2) 选择有变化的脑区域(如脑皮层，海马及纹状体)，采用在体染色(Golgi staining)、活体细胞荧光跟踪和EM等枝术，详细分析神经元的数目、种类(兴奋性，抑制性)、树突、轴突复杂程度及走向, 突触数目、种类等；(3) 采用fMRI、整体动物电生理、双光子共聚焦成像等枝术，检测分析有关脑区的神经环路突触功能(例如CA3-CA1、Cortical-Striatum环路突触) 及可塑性(例如EPSPs、LTP、LTD、spine形态可塑性等)；(4) 用生化、分子生物学、功能拯救(rescue) 等技术、检测以上动物模型有关脑区神经环路中的分子及生化信息传递变化, 并证实其在神经元及突触形态和功能异常中的作用；(5) 结合动物行为研究结果, 特别在学习记忆、社交等核心症状方面，对其动物模型在分子、突触、细胞、环路各层次进行相关分析。揭示有关基因及突变体在神经元发育环路的形成和功能中的作用及机理。这些结果将为鉴定及阐明孤独症的神经环路和突触机理提供不可缺少的证据。