生物化学实验报告
姓名：吴瑞
学号： 04
专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则
1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。
2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。
3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。
4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。
5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。
6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。
7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。
8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。
9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。
10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
二、实验报告的基本要求
实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。
1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。
2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程与操作步骤）要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。
3．每项内容的基本要求
（1）实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。
（2）实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器。说明化学试剂时要避免使用未被普遍接受的商品名和俗名。试剂要标清所用的浓度。
（3）实验步骤：描述要简洁，不能照抄实验讲义，可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示，但对实验条件和操作的关键环节应写清楚，以便他人重复。
（4）实验记录：包括主要实验条件、实验中观察到的现象及实验中的原始数据。
（5）结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果，如实验组与对照组实验结果的比较表等(有时对实验结果还可附以必要的说明)。
（6）讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。如对定性实验，在分析实验结果的基础上应有中肯的结论。还可以包括关于实验方法、操作技术和有关实验的一些问题，对实验异常结果的分析和评论，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。
（7）结论：一般实验要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的
结果。
三、实验报告的评分标准（百分制）
1．实验预习报告内容（30分）
学生进入实验室前应预习实验，并书写预习报告。实验预习报告应包括以下三部分：①实验原理（10分）：要求以自己的语言归纳要点；②实验材料（5分）：包括样品、试剂及仪器。只列出主要仪器、试剂（常规材料不列）；③实验方法（15分）：包括流程或路线、操作步骤，要以流程图、表格式给出要点，简明扼要。依据各部分内容是否完整、清楚、简明等，分以下三个等级给分。
优秀：项目完整，能反映实验者的加工、整理、提炼。
合格：较完整，有一定整理，但不够精炼。
不合格：不完整、缺项，大段文字，完全照抄教材，记流水账。
实验预习报告不合格者，不允许进行实验。该实验应重新预约，待实验室安排时间后方可进行实验。
2．实验记录内容（20分）
实验记录是实验教学、科学研究的重要环节之一，必须培养严谨的科学作风。
实验记录的主要内容包括以下三方面：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据：设计实验数据表格（注意三线表格式），准确记录实验中测得的原始数据。记录测量值时，要根据仪器的精确度准确记录有效数字（如吸光值为，不应写成），注意有效数字的位数。
实验记录应在实验过程中书写；应该用钢笔或者圆珠笔记录，不能用铅笔。记录不可擦抹和涂改，写错时可以准确划去重记。记录数据时请教师审核并签名。
实验记录分以下三个等级给分。
优秀：如实详细地记录了实验条件、实验中观察到的现象、结果及实验中的原始数据（如三次测定的吸光度值）等；实验记录用钢笔或者圆珠笔记录，没有抹擦和涂改迹象。书写准确，表格规
范（三线表）。有教师的签字审核。
合格：记录了主要实验条件，但不详细、凌乱；实验中观察到的现象不细致；原始数据无涂改迹象，但不规范。有教师的签字审核。
不合格：记录不完整，有遗漏；原始数据有抹擦和涂改迹象、捏造数据（以0分计）；图、表格形式错误；用铅笔记录原始数据；无教师的签字审核。
若记录的结果有怀疑、遗漏、丢失，必须重做实验，培养严谨的科学作风。
3．结果与讨论（45分）
（1）数据处理（5分）
对实验中所测得的一系列数值，要选择合适的处理方法进行整理和分析。数据处理时，要根据计算公式正确书写中间计算过程或推导过程及结果，得出最终实验结果。要注意有效数字的位数、单位（国际单位制）。经过统计处理的数据要以X±SD表示。可分成以下三个等级给分。
优秀：处理方法合理，中间过程清楚，数据格式单位规范。
合格：处理方法较合理，有中间计算过程；数据格式单位较规范。
不合格：处理方法不当；无中间过程；有效数字的位数、单位不规范。
（2）结果（20分）
实验结果部分应把所观察到的现象和处理的最终数据进行归纳、分析、比对，以列表法或作图法来表示。同时对结果还可附以必要的说明。
要注意图表的规范：表格要有编号、标题；表格中数据要有单位（通常列在每一列顶端的第一行或每一行左端的第一列）。图也要有编号、标题，标注在图的下方；直角坐标图的纵轴和横轴要标出方向、名称、单位和长度单位；电泳图谱和层析图谱等要标明正、负极方向及分离出的区带、色带或色斑的组分或成分。电泳结果还要标记泳道，并在图题下给出泳道的注释；要标出分子量标准的各条带的大小。并且注意需要结合图表对结果进行较详细的解释说明。
可分成以下三个等级给分。
优秀：实验结果有归纳、解释说明，结果准确，格式规范。
合格：堆砌实验现象、数据，解释说明少。
不合格：最终实验结果错误且无解释说明，图表、数字不规范。
（3）讨论（20分）
讨论应围绕实验结果进行，不是实验结果的重述，而是以实验结果为基础的逻辑推论，基本内容包括：①用已有的专业知识理论对实验结果进行讨论，从理论上对实验结果的各种资料、数据、现象等进行综合分析、解释，说明实验结果，重点阐述实验中出现的一般规律与特殊性规律之间的关系；②实验结果提示了哪些新问题，指出结果与结论的理论意义及其大小；③对实践的指导与应用价值；④实验中遇到的问题、差错和教训，与预想不一致的原因，有何待解决的方法，提出在今后的实验中需要注意和改进的地方；⑤实验目的是否达到。
同时能结合查阅的其他文献等资料进行讨论，有独到的见解。在实验结果和理论分析的基础上，经过推理，归纳规律得出结论。结论要严谨、精炼，表达要准确，与实验目的呼应。也分三个等级给分。
优秀：分析实验结果的问题与经验；分析实验设计的优劣；能提出实验技术、方法的改进意见；能结合自己查阅的其他资料来讨论，有自己独到的见解；有结论。
合格：仅针对实验结果进行讨论，有一定自己的见解。
不合格：将讨论写成注意事项分析或回答思考题等，与实验结果无关。
4．格式与版面（5分）
按照实验报告的书写格式、版面是否整洁、工整，分三个等级给分。
优秀：实验报告字体工整，版面整洁。
合格：实验报告字体较工整，版面较整洁。
不合格：实验报告字体潦草，版面凌乱。
5. 加分（5~10分）：
以全英文书写实验报告视情况加5~10分。
Introduction to Biochemistry Experiment
Biochemistry experiment is a preclinical curriculum of omni-specialties in biomedicine and an experimental curriculum for going with biochemistry teaching. Its task is to help students to understand and master the basic technical principles and methods in biochemistry, to possess the abilities of analyzing problems and working out solutions independently. By learning this curriculum, the students should understand the basic experimental principles of spectrophotometry，chromatography, electrophoresis and centrifuge, et al.，master the basic technical skills commonly used with these principles and possess the abilities to apply the skills systematically and to optimize the experiment conditions. The goal of biochemistry experiment is to make the students strengthen their grasp of the biochemistry theories and to integrate what they have learned with scientific research and clinical application.
There are 9 experiments that represent most important areas of biochemistry including characterization of proteins and nucleic acid by electrophoresis and spectroscopic or chromatographic analysis. These experiments are essential for a typical one-semester course and are to be revised and updated when necessary. New experiments will be added to this list in the future to cover more topics of biochemistry and to reflect the many advances in biochemistry. Biochemistry Laboratory Rules
1．Pre-Laboratory Preparation
All students must prepare BEFORE ARRIVING IN THE LABORATORY. The experiments are designed so that they can be carried out –with proper advance planning – within the four-hour laboratory periods. It is expected that students should have a fundamental understanding of the theory and practices
pertaining to the experiment before entering the laboratory to conduct these experiments.
Biochemical experiments often employ toxic chemicals. For the health and safety of all students, the experimental protocols must be studied and the day’s activities should be planned in advance. If it becomes obvious that
a student is ill-prepared, he or she will not be permitted to continue the
experiment.
2．Safety Precautions in the Biochemistry Laboratory
All INJURIES, no matter how minor, should be reported to the instructor IMMEDIATELY. If you have any questions regarding the safe handling of any biochemical, consult your instructor.
3．Strictly follow the experimental procedures.
Turn to instructors immediately for help once the laboratory instruments don’t work. DON’T try to fix the breakdown by yourself. Proper compensation for loss because of your own fault will be demanded. 4．Disposal of Solutions
In most cases the solutions used during the laboratory can be disposed of as directed by laboratory personnel at the end of the period. Any volatile organic solvents should be placed in the hood as directed. Laboratory personnel will then dispose of these solvents.
5．Solid trashes including waste papers are prohibited to discard into the sink.
6．All the glassware should be cleaned immediately after use. And all the reagent bottles and instruments should be placed neatly after use.
7．An experiment report should be submitted to the Professor and/or TAs in time. Laboratory Report
1．Although students will work in pairs for all experiments, each student must turn in an individual laboratory report, written by himself or herself.
These reports should be clearly written in ink, typed, or printed and be clear and legible. If mistakes are made, neatly cross them out and enter the corrections nearby. Reports should be written in the third person ., do not use “I” or “we”).STAPLE a Title Page to the top of the report and STAPLE the accompanying graphs, tables, and laboratory notebook sheets to the back.
If the report is not clearly presented, the instructor may return the report without grading it.
2．Each laboratory report should consist of:
a. Title Page
A title page for each experiment is required and should state the title
of the experiment, the name of the student, the dates of the laboratory periods covered, the names of the laboratory partners, and the date that the laboratory report is due.
b. Objectives
Statement of the point of the experiment - in no more than two sentences.
c. Procedures
DO NOT recapitulate the laboratory protocol. Write in you OWN words. A clear flowchart of the procedures is recommended.
d. Results
This section should summarize your observations presented in the form of graphs, calculations, tables, etc.
e. Discussion
Evaluate your data. Explain what you observed and also why you think the data were as observed. Do not restate procedures! List possible sites of error. Whenever possible demonstrate your understanding of the theory behind the experiment. Support your results .: “Using the linear portion of the Absorbance vs. Concentration graph to calculate the slope, it was determined that...”) (Limited to only one page per experiment for experiments 1 - 6 and four pages for experiment 7-9).
3．If any laboratory report is not completed and turned in by the end of the quarter, the student maybe receive an Incomplete for the course at the discretion of the instructors; alternatively a “zero” for the missing laboratory report will be recorded and the final grade determined accordingly.
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】
一、实验原理
不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下的带电的情况都有所不同。利用蛋白质的这一特性，可以分离纯化各种蛋白质。
1.盐析法。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。如：血清清蛋白不溶于饱和硫酸铵溶液，而球蛋白不溶于半饱和硫酸铵溶液，从而将清、球蛋白分离开。
2.脱盐。用盐析法分离而得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质的进一步纯化。本实验中我们采用葡聚糖凝胶（G-25）层析法。主要利用的是蛋白质与无机盐类之间的分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔从而首先被洗脱出来；而无机盐分子直径小，能进入凝胶颗粒网孔中被阻滞而后洗脱出来。
3.纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。本实验采用的DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素是一种阴离子交换剂。溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电的离子则不能，从而达到分离纯化的目的。
4..蛋白性质鉴定（沉淀法）。本实验采用的是磺基水杨酸检测蛋白质。因为蛋白质为两性物质，在酸性环境中带正电荷，而磺基水杨酸根带负电，正好与蛋白质结合沉淀，显示液体中有蛋白存在。
5.纯度鉴定（电泳）。本实验采用的是醋酸纤维素薄膜电泳。血浆中各种蛋白质的等电
点不同，一般都低于。它们在的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
二、实验材料
1.样品。健康人血清
2.试剂。L 醋酸铵（NH
4AC)缓冲液、L NH
4
AC缓冲液、L NH
4
AC缓冲液、L NH
4
AC
溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、20%磺基水杨酸
3.仪器及器材
电泳仪、电泳槽、离心机、微量加样枪、离心管、托盘天平、载玻片、盖玻片、醋酸纤维素薄膜、滤纸、试管、点样板、滴管
三、实验步骤
1.流程：粗提→脱盐→纯化→鉴定
2.操作步骤
（1）取血清于试管中，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min
（2）取沉淀（含球蛋白）加蒸馏水溶解，过葡聚糖凝胶G-25层析柱。
（3）用1ml L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 继续用L NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约2ml
（4）磺基水杨酸检测是否有蛋白质被洗脱，当有沉淀且后一滴洗脱液产生的沉淀明显多于前一滴时，收集含有较纯净球蛋白的峰液12d.
（5）此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性，继续用L NH4AC缓冲液洗涤约2ml，BaCl2检测SO42-阴性，用2~3ml L NH4AC缓冲液再生平衡
（6）上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约，加入到步骤（5）再生的葡聚凝胶层析柱中，重复步骤（3）-（5）
（7）除盐后收集的球蛋白，过DEAE-纤维素层析柱。
（8）用1ml L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 继续用L NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约2ml时，用磺基水杨酸检测是否有蛋白质生成
（9）当点滴板上有沉淀生成时，收集含有球蛋白的洗脱液每管10d，连续收集3管（10）DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白
（11）除盐后收集的清蛋白过DEAE-纤维素层析柱，用1ml ６mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 用约５mL L NH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白
（12）用磺基水杨酸检测蛋白质呈阴性时，用L NH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约
（13）磺基水杨酸检测蛋白质呈阳性时，收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管
（14）DEAE-纤维素柱先用6ml L NaCl - L NH4AC溶液流洗，再用10ml L NH4AC缓冲液流洗再生平衡
（15）将收集到的3管γ-球蛋白用磺基水杨酸做纯度鉴定，取浓度最高的一管做纯度鉴定，而收集到的两管清蛋白都要做纯度鉴定
醋酸纤维素薄膜电泳：取醋酸纤维素薄膜迎光找出粗糙面，在粗面距边缘约点样，然后将薄膜粗面向下，点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，接通电源开始电泳。电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可
3.注意事项
（1）当层析柱上的缓冲液面或样品液面刚好下降到凝胶床表面时，注意不要使液面低于凝胶床表面以下，以免空气进入凝胶床。
（2）上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此
（3）洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气
（4）切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色
（5）葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!
（6）点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多。切勿使点样处与电泳槽接触
（7）本实验中用到的缓冲液较多，实验过程中一定要注意缓冲液的浓度，避免弄混
【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：XX】
请在此键入第二部分内容……
一、实验现象
1.取出的健康成人的血清澄清透明呈淡黄色，加入饱和硫酸铵溶液后，混合液中出现浑浊。离心后，血清明显分为两层，上层为黄色澄清透明的液体，下层为淡黄色沉淀（如图）
二、盐析离心后的血清原始实验数据
血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱从上到下依次为血清、清蛋白第一管、清蛋白第二管、γ-球蛋白
【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：XX】
请在此键入第三部分内容……
1.实验结果
从电泳图中可以看出，血清电泳图谱共有5条带，按离点样线由近到远的顺序依次为γ
球蛋白、β球蛋白、α
2球蛋白、α
1
球蛋白和清蛋白。
清蛋白第一管有两条带，与血清的电泳条带对比可以看出离点样线最远、颜色最深的那
条带为清蛋白，离点样线较近、颜色较浅的那条带为球蛋白
清蛋白第二管只有一条带，与血清电泳条带对照可以看出为清蛋白
γ球蛋白的电泳图谱只有一条带，与血清图谱对照可以看出是γ球蛋白，但量比较少2.结果分析
从上述结果中可以看出，第一管清蛋白中仍然混有少量球蛋白，说明清蛋白中的球蛋白没除干净，原因可能是加样时幅度有点大，使凝胶柱表面出现凹陷，层析时各部分溶液不在同一水平线造成的；第二管由于残留的少量球蛋白已被收集到第一管中，所以只有一条带；γ球蛋白的纯度较高，说明α、β球蛋白除得比较彻底，操作比较成功
3.结论
1）健康成人血清中主要有五种蛋白，他们分别是γ球蛋白、β球蛋白、α
2
球蛋白、
α
1
球蛋白和清蛋白。
2）在收集到的几管蛋白质中，第一管清蛋白的纯度不是很高，第二管清蛋白和γ球蛋白的纯度较高