郑州大学
硕士学位论文
氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
姓名：姜春霞
申请学位级别：硕士
专业：劳动卫生与环境卫生学
指导教师：崔留欣
20040410
郑州大学医学院２００４硕士学位论文氟致人鼠生精细胞凋亡投其机制的实验研究氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
研究生导师姜春霞崔留欣
郑州大学医学院环境卫生学教研室
郑州４５００５２
摘要
氟（Ｆｌｕｏｒｉｎｅ）是一种非金属元素，也是人体必需的一种微量元素。氟具有强大的电负性，以氟化物（Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）的形式广泛存在于自然界中。摄入适量的氟有利于机体预防龋齿、维持钙磷代谢和保持神经冲动传导，而过量的氟化物则对机体产生强烈的毒性作用，能引起机体多系统损害。过去，人们多以氟对骨相组织的损害为研究重点，但近年来，随着氟化物在工农业生产和生活中的广泛应用，氟对机体生殖系统等非骨相组织的毒性作用逐渐被人们所重视。随着研究的深入，人们发现高氟区男性不育率显著高于非高氟区，精子数量和质量明显降低。因此，关于氟致雄性生殖毒性的研究日益受到关注。
生精细胞凋亡可发生于正常生精过程中。在正常生精过程中，由于生殖细胞的减少而丢失的精子数，占精子生成总量理论值的２５％～７５％。生精过程中，生精细胞凋亡在生殖细胞成熟的特殊阶段被触发以维持细胞数目的平衡，并发生于生精过程的始终。在睾丸生精过程中，曲细精管内大量生殖细胞发生的凋亡对睾丸正常生理调节及某些疾病的发生具有重要意义。但关于氟能否导致生精细胞凋亡以及生精细胞凋亡在氟致雄性生殖损害中的意义的研究，国内外报道却较少。因此，研究氟对生精细胞凋亡的影响可为深入探讨氟的生殖毒性和筛选氟暴露者早期生殖健康监护指标提供科学依据。
材料和方法
１．剂量分组：选用４～５周龄雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只，体重１ｌＯ～１３０９，随机分为６组，即：对照染毒２８ｄ组、低剂量染毒２８ｄ组、高剂量染毒２８ｄ组、对照染毒３８ｄ组、低剂量染毒３８ｄ组和高剂量染毒３８ｄ组。每组５只动物。对照组、
梦州大学医学院２００４硕上学位论文氟致太鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
低剂量组和高剂量组氟化钠的染毒剂量分别为：０、１０、２０ｍｇ／ｋｇＢｗ／２ｄ。
２．染毒方法及检测指标：按上述染毒剂量和染毒时间，各染氟组分别隔日腹腔注射ＮａＦ溶液，对照组隔Ｒ腹腔注射生理盐水，制作染氟动物模型。各组染毒结束后称重并处死动物，解剖取睾丸、附睾，称重并分别计算脏器系数；采用氟离子选择电极法测定睾丸组织中氟含量；放免分析方法测定血清睾丸酮（Ｔ）和雌二醇（Ｅ２）；观察睾丸的组织病理学变化；采用ＴｄＴ介导的末端标记法检测凋亡的生精细胞。
３．各项指标的统计学处理：选用单因素方差分析、独立样本ｔ检验和直线相关分析，以ａ＝０．０５为显著性检验水准。
结果
１．大鼠体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数分析结果：高剂量染毒２８ｄ组与同期对照组比较，除右侧睾丸重量和右侧附睾脏器系数外，其他３项指标差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜０．０１）；高剂量染毒２８ｄ组与同期低剂量染毒组比较，右侧睾丸脏器系数降低，差异有统计学意义（尸＜ｏ．０５）：低剂量染毒２８ｄ组与同期对照组比较，除右侧睾丸重量和右侧附睾脏器系数外，其他３项指标差异均有统计学意义（Ｐ＜ｏ．０５）；低剂量染毒３８ｄ组、高剂量染毒３８ｄ组分别与同期对照组比较，大鼠体重、睾丸重量和附睾重量降低，差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜Ｏ．０１）：高剂量染毒３８ｄ组与高剂量染毒２８ｄ组比较，除右侧睾丸脏器系数外，其他４项指标差异均有统计学意义（Ｐ＜ｏ．０５或Ｐ＜０．０１）；低剂量染毒３８ｄ组与低剂量染毒２８ｄ组比较，右侧睾丸重量降低，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）ａ说明动物体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数与染氟剂量和染氟时间有关。
２．大鼠血清睾酮和雌二醇测定结果：染氟各组大鼠血清睾酮和雌二醇含量分别低于同期对照组，差异有显著性（户＜Ｏ．０５或Ｐ＜０．０１）。各染氟大鼠血清睾酮和雌二醇含量随染氟剂量的增加和染氟时间的延长而逐渐降低（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。结果提示，一定剂量的氟化钠能干扰血清睾酮和雌二醇活性，引起雄性大鼠生殖内分泌功能紊乱。
３．大鼠睾丸组织氟含量测定结果：染氟组分别与同期对照组比较睾丸氟含量均升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；高剂量染氟组分别与同期低剂量染氟组比较，睾丸氟含量亦显著性升高，差异有统计学意义（尸＜ｏ．０Ｉ）。结果提示，
接触一定量的氟化钠能增加睾丸组织氟负荷水平。
４．大鼠睾丸组织病理学检测结果：染氟各组可观察到睾丸生精上皮细胞层次减少，成熟精子数量减少，组织结构变得疏松。且随染氟剂量的加大、时间的延长，氟性损害逐渐加重。提示，一定剂量的氟化钠能损害睾丸的组织结构。
５．大鼠生精细胞凋亡检测结果：染氟各组大鼠总生精细胞凋亡率、精原细胞凋亡率、精母细胞凋亡率以及精子细胞和精子凋亡率分别高于同期对照组，差异有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。各染氟大鼠生精细胞凋亡率随染氟剂量的增加和时间的延长而逐渐升高（Ｐ＜ｏ．０１）。结果提示，一定剂量的氟化钠能引起生精细胞凋亡率的升高。
６．各染氟组大鼠生精细胞凋亡率与睾丸氟含量的关系：各染氟组大鼠总生精细胞凋亡率与睾丸氟含量均呈正相关（低剂量染毒２８ｄ组，＝０．８７８，Ｐ＜Ｏ．０５：高剂量染毒２８ｄ组，＝Ｏ．９３１，Ｐ＜Ｏ．０５；低剂量染毒３８ｄ组，＝Ｏ．９００，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒３８ｄ组，＝０．９８８，Ｐ＜Ｏ．０１）。各染氟组大鼠精原细胞凋亡率与睾丸氟含量均呈正相关（低剂量染毒２８ｄ组ｒ＝０．９４８，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒２８ｄ组ｒ＝Ｏ．９３６，Ｐ＜Ｏ．０５；低剂量染毒３８ｄ组，＝Ｏ．８８８，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒３８ｄ组，＝０．９４３，Ｐ＜Ｏ．０５）。各染氟组大鼠精母细胞凋亡率与睾丸氟含量均呈正相关（低剂量染毒２８ｄ组ｒ＝０．９５６，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒２８ｄ组ｒ＝Ｏ，９１４，Ｐ＜Ｏ．０５＝低剂量染毒３８ｄ组ｒ＝Ｏ。９８９，Ｐ＜Ｏ．０１；高剂量染毒３８ｄ组ｒ＝０。９１１，Ｐ＜Ｏ．０５）。各染氟组大鼠精子细胞和精子凋亡率与睾丸氟含量均呈正相关（低剂量染毒２８ｄ组，＝Ｏ．９７０，Ｐ＜Ｏ．０１；高剂量染毒２８ｄ组，一Ｏ．９７５，Ｐ＜Ｏ．０１；低剂量染毒３８ｄ组ｒ＝Ｏ．９０７，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒３８ｄ组ｒ＝０．９７８，Ｐ＜Ｏ．叭）。
７．各染氟组大鼠血清性激素含量与睾丸氟含量的关系：除高剂量染毒２８ｄ组外。其他各染氟组大鼠血清睾酮含量与睾丸氟含量均呈负相关（低剂量染毒２８ｄ组，＝．０．８９７，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒２８ｄ组，＝．Ｏ．８７４，Ｐ＞Ｏ．０５；低剂量染毒３８ｄ组ｒ＝．０．８８６，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒３８ｄ组，＝．０．９０１，Ｐ＞Ｏ．０５）。各染氟组大鼠血清雌二醇含量与睾丸氟含量均呈负相关（低剂量染毒２８ｄ组ｒ＝－０．９８９，Ｐ＜Ｏ．０１：高剂量染毒２８ｄ组ｒ＝．Ｏ．９７１，Ｐ＜Ｏ．０１；低剂量染毒３８ｄ组，＝一Ｏ．９３６，Ｐ＜Ｏ．０５：高剂量染毒３８ｄ组，＝一０．９８９，Ｐ＜Ｏ．０１）。
８．各染氟组大鼠总生精细胞凋亡率与血清性激素含量的关系：各染氟组大
鼠总生精细胞凋亡率与血清睾酮含量均呈负相关（低剂量染毒２８ｄ组，＝．０．９７７，Ｐ＜Ｏ．０１；高剂量染毒２８ｄ组ｒ＝．０．９１２，Ｐ＜Ｏ．０５；低剂量染毒３８ｄ组，＝．Ｏ．９９０，Ｐ＜Ｏ．０１；高剂量染毒３８ｄ组，＝．０．９５０，Ｐ＜Ｏ．０５）。除低剂量染毒３８ｄ组外，其他各染氟组大鼠总生精细胞凋亡率与血清雌二醇含量均呈负相关（低剂量染毒２８ｄ组，＝一Ｏ．９１２，Ｐ＜Ｏ．０５；高剂量染毒２８ｄ组ｒ＝一Ｏ．９９０，Ｐ＜Ｏ．０１；低剂量染毒３８ｄ组ｒ＝．Ｏ．８２７，Ｐ＞Ｏ．０５；高剂量染毒３８ｄ组ｒ＝一０．９９４，Ｐ＜Ｏ．０１）。
结论
１．随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长，染氟大鼠生精细胞凋亡率逐渐增高，且以精原细胞和精母细胞凋亡为主。
２．染氟大鼠睾丸氟含量升高、血清性激素水平紊乱，是导致生精细胞凋亡的重要原因之一。
３．染氟大鼠血清雄激素和雌激素水平与睾丸氟含量以及生精细胞凋亡率之间相关性较好，可作为氟暴露人群男性生殖健康早期监护指标之一。
关键词：氟氟化钠生精细胞凋亡雄性生殖毒性睾酮雌二醇
—立型生茎兰！登堕！！篓堡圭堂些笙苎塑塾奎堕皇堕塑！堕塑圭墨苎垫型塑窭鉴竺塞ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｎＳｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｅＣｅｌｌＡｐｏｐｔｏｓｉｓ
ａｎｄＩｔｓＭｅｃｈａｎｉｓｍｉｎＭａｌｅＲａｔｓＥｘｐｏｓｅｄｔｏＦｌｕｏｒｉｄｅ
ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＴｕｔｏｒＪｉａｎｇＣｈｎｎｘｉａＣｕｉＬｉｕｘｉｎ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＵｙｇｉｅｎｅ，
ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＣｈｉｎａ，４５００５２
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｆｌｕｏｒｉｎｅ（Ｆ）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｎｏｎｍｅｔａｌｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｍｓｗｈｉｃｈａｒｅｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅｔｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｈａｖｉｎｇｓｔｒｏｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｅｇａｆｉｖｅ，ｆｌｕｏｒｉｎｅｗｉｄｅｌｙｅｘｉｓｔｓｉｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｂｙｆｌｕｏｒｉｄｅ．Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｆｌｕｏｒｉｄｅｉｓｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｔｏｐｒｅｖｅｎｔｃａｒｉｅｓ，ｔｏｍａｉｎｔａｉｎｎｅｗｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｏｓｕｐｐｏｒｔｃａｌｃｉｕｍａｎｄｐｈｏｓｐｈａｔｅｏｆｏ唱ａｎｉｓｍｓ．Ａｎｄｙｅｔ．ｅｘｃｅｓｓｉｖｅｉｎｔａｋｅｏｆｆｌｕｏｒｉｄｅｐｒｏｄｕｃｅｓｐｏｔｅｎｔｔｏｘｉｃｉｔｙｔｏｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｉｎｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ，ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｗａｓａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｄａｍａｇｅｏｆｓｋｅｌｅｔａｌｔｉｓｓｕｅｂｙｆｌｕｏｒｉｎｅ．Ｂｕｔｗｉｔｈｆｌｕｏｒｉｄｅ’ｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｎｄｕｓｔｒｙ，ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄｄａｉｌｙｌｉｆｅ，ｒｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｐａｙｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｔｏｔｈｅｎｏｎｓｋｅｌｅｔａｌｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｆｌｕｏｒｉｎｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｓｔｕｄｙ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｍａｌｅｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙｒａｔｅｉｎｈｉ曲ｆｌｕｏｒｉｄｅｅｘｐｏｓｅｄａｒｅａｗａｓｇｒｅａｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｌｏｗｆｌｕｏｒｉｄｅｅｘｐｏｓｅｄａｒｅａ，ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｓｐｅｒｍａｌｌｒｅｄｕｃｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｓｏ，ｓｔｕｄｉｅｓＯｌｌｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｆｌｕｏｒｉｄｅｗｅｒｅａｔｔａｃｈｅｄｎ＇ｌｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｒｅｃｅｎｔｌｙ．
Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｐｐｅａｒｓｄｕｒｉｎｇｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｙｃｌｅｎｏｒｍａｌｌｙ．Ｄｕｒｉｎｇｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，２５ｔｏ７５ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄｗｅｒｅｌｏｓｔｂｙｆｏｒｍｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｃａｌｌｂｅｔｒｉｇｇｅｒｅｄａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｓｔａｇｅｓｏｆｃｅｌｌ’ｓｍａｔｕｒｉｔｙ，ａｎｄｈａｐｐｅｎｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｗｈｏｌｅｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｂａｌａｎｃｅｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｄｅａｔｈａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｏｍｅｄｉａｔｅｔｈｅ
型型查兰墅兰堕！！竺堡主竺些堡苎量塑查垦皇堕塑塑塑主墨茎！！型塑塞竺堡塞
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ａｎｄｉｎｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ。Ａｓｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ
ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｄｕｃｅｄｂｙｆｌｕｏｒｉｄｅ，ｆｅｗｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｓｏ，ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎｅｆｆｅｃｔｔｏｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｃａｕｓｅｄｂｙｆｌｕｏｒｉｄｅａｒｅｖａｌｕａｂｌｅｂｏｔｈｉｎｔｈｅｄｅｅｐｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｆｌｕｏｒｉｄｅ’Ｓｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｏｘｉｔｉｃｙ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｅａｒｌｙｉｎｄｅｘｏｆｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｈｅａｌｔｈｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｏｆｆｌｕｏｒｉｄｅｅｘｐｏｓｕｒｅｐｅｒｓｏｎ，
Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ
１．ＴｈｉｒｔｙｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｉｇｈｔｅｄ１１０ｔｏ１３０ｇｒａｍｗｅｒｅａｌｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｏｓｉｘｇｒｏｕｐｓｒａｎｄｏｍｌｙ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｆｉｖｅｒａｔｓｉｎｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｓｉｘｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ２８一ｄａｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，２８一ｄａｙｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，２８－ｄａｙｈｉｇｈ．ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，３８一ｄａｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，３８一ｄａｙｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ，ａｎｄ３８一ｄａｙｈｉｇｈ—ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ．ＴｈｅＮａＦｄｏｓａｇｅｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌ，ｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｕｅａｔｍｅｍ，ａｎｄｈｉｇｈ—ｄｏｓｅｆｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅ０，１０，ａｎｄ２０ｍｇ／ｋｇＢｗ／２ｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｂｏｖｅ?ｍｅｎｔｉｏｎｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｏｓｅａｎｄｄｕｒａｔｉｏｎ，ｅｖｅｒｙｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗａｓｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＮａＦｓｏｌｕｔｉｏｎｏｎｃｅｔｗｏ
ｍｏｄｅｌ．Ｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓａｌｉｎｅ．ｄａｙｓｔＯｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｌｕｏｒｏｓｉｓｒａｔ
Ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｆｔｅｒｐｕｔｔｉｎｇｔｈｅｒａｔｔｏｄｅａｔｈｂｏｔｈｔｅｓｔｉｓａｎｄｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｗｅｒｅｄｉｓｓｅｃｔｅｄｏｕｔａｎｄｗｅｉｇｈｔｅｄｆｏｒｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｉｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮａＦｉｎｔｅｓｔｉｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｉｎｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ｔｈｅｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（Ｔ）ａｎｄｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）ｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｓｅｒｕｌｎｗｅｒｅｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｆｌｕｏｒｏｓｉｓ．ｅｘｐｌａｉｎｔｈｅ
Ｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｅｓｔｉｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｆｏｒｔｈｅｏｒｄｅｒ，ｓｈａｐｅ，ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓｉｎｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＴｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｅｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＴｄＴ—ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎ（ＴＵＮＥＬ）ｍｅｔｈｏｄｉｎｓｉｔｕ，
３．Ｏｎｅ．ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ），ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ—ｓａｍｐｌｅｓＴｔｅｓｔ，ａｓｗｅｌｌ
型大学堕堂堕！！１４硕士学位论文氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
ａｓｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｔｅｓｔ．ＴｈｅｒｅＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｈｅｎｏｗａｓ０．０５．
Ｒｅｓｕｌｔｓ
１．Ａｓｔｏｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ，ｔｅｓｔｉｓｗｅｉｇｈｔ，ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｔｈｅｉｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｘｃｅｐｔｔｈｅｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｗｅｉｇｈｔ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｉｎｄｅｘｗｈｅｎ２８一ｄａｙｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓ（Ｐ＜Ｏ．０５ｏｒＰ＜０．０１）．Ｔｈｅｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎ２８一ｄａｙｈｉ曲－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｏｆ２８－ｄａｙｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），Ｅｘｃｅｐｔｔｈｅｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｗｅｉｇｈｔ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｉｎｄｅｘｗｈｅｎ２８－ｄａｙｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓｆＰ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ，ｔｅｓｔｉｓｗｅｉｇｈｔ，ａｎｄｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｗｅｉｇｈｔｏｆ３８－ｄａｙｌｏｗ—ａｎｄｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａｌｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｏｓｅｏｆｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ俨＜Ｏ．０５ｏｒＰ＜０．０１），Ｅｘｃｅｐｔｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｃｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｏｔｈｅｒｆｏｕｒｉｎｄｅｘｗｈｅｎ３８一ｄａｙｈｉｇｈ?ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｔｏ２８一ｄａｙｈｉｇｈ—ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｆＰ＜０．０５ｏｒＰ＜０．０１）．Ｔｈｅｔｅｓｔｉｓｗｅｉｇｈｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｗｈｅｎ３８一ｄａｙｌｏｗ—ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｔｏ２８一ｄａｙｌｏｗ－ｄｏｓｅｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｔ
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２．ＴｈｅＴａｎｄＥ２ｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｓｅｒｕｍｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ
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塑！！“大学医学院２００４硕士学位论文氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
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郑州大学医学院２００４硕士学位论文氟致夫鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
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８．ＴｈｅｔｏｔａｌａｐｏｐｔｏｔｉｃｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｒａｔｉｏｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓＷａＳｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＴｃｏｎｔｅｎｔｉｎｓｅｒｕｍｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
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郑州大学医学院２００４顶士学位论文氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
１．Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｉｎｆｌｕｏｒｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｉｎｃｒｅａｓｅｓｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｍａｌｄｏｓａｇｅａｎｄｐｒｏｌｏｎｇｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｅｒｉｏｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｏｓｅｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉｕｍａｎｄｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ．
２．Ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｆｌｕｏｒｉｄｅｌｅｖｅｌｉｎｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅａｎｄｓｅｘｕａｌｈｏｒｍｏｎｅｄｉｓｏｒｄｅｒｉｎｓｅｒｕｍａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｆｏｒｆｌｕｏｒｏｓｉｓ．３．Ｔｈｅｒｅａｒｅｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｓｅｘｕａｌｈｏｒｍｏｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｓｅｒｕｍ
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ｒａｔｉｏ．ＴｈｅＴａｎｄＥ２ｌｅｖｅｌｓｉｎｓｅｒｕｍｍａｙｈａｖｅｖａｌｕｅｉｎａｐｏｐｔｏｔｉｃｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌ
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ｆｌｕｏｒｉｄｅｅｘｐｏｓｕｒｅｐｅｏｐｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｌｕｏｒｉｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅｓｏｄｉｕｍｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ
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郑州大学医学院２００４硕士学位论文氟致人鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究氟致大鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
研究生导师姜春霞崔留欣
郑州大学医学院环境卫生学教研室
郑州４５００５２
前言
氟（Ｆｌｕｏｒｉｎｅ）是机体必需的微量元素之一，广泛分布在各组织和器官。其中，骨骼、牙齿等骨相组织含量较多，非骨相组织含量较少【ｌ】。适量的氟有利于维持钙磷代谢、保持神经冲动传导，还有较好的防龋作用，过量的氟化物则损害机体多器官系统［２１。有文献报道：由于地理性高氟、氟工业废物的污染及氯化物在临床和生活中应用，全世界约有５亿人接触高氟，氟中毒人数达２亿，中国就占了其中五分之一。从１９０１年Ｅａｇｅｒ报道了氟化物对人类的毒害作用到２０世纪８０年代，人们多以氟对牙齿、骨骼等骨相组织的损伤为研究重点【３’…。１９７６年Ｗａｌｄｂｏｔｔ提醒人们；氟中毒是全身性疾患，决不仅限于牙齿和骨骼的损伤，从而提出了非骨相氟中毒（ｎｏｎ．ｓｋｅｌｅｔａｌｆｌｕｏｒｏｓｉｓ）的概念。从此，人们对氟中毒的研究进入了一个新的阶段。近２０年来，国内外报道了许多非骨相氟毒性的研究，如：氟对血清中多种酶活性的影响，氟对肝、肾等实质性器官的损害，氟的致突变性，氟对内分泌系统、神经系统、免疫系统功能的影响等１５书］。随着研究的深入，人们发现高氟区男性不育率显著高于非高氟区，患者的精子数量和质量明显降低［９】，相关的研究也有许多报道［１０￣１４１。因此，氟对雄性生殖系统的影响日益受到重视。
有关氟中毒的机制，近年来在分子水平上对氟诱导的细胞凋亡展开了广泛的研究。结果显示氟可诱导多种细胞发生凋亡。国外学者Ｈｉｒａｎｏ采用体外细胞培养的方法先后证实不同浓度的氟可分别导致大鼠肺泡巨噬细胞【ｌ”、骨肉瘤细胞ＵＭＲｌ０６株‘８１、人白血病细胞ＨＬ一６０株‘１６，１７１发生凋亡。类似的结果还可见于
经氟诱导的人和大鼠胰岛细胞、ＲＩＮｍ５Ｆ细胞、肺上皮细胞和ＨｅＬａ细胞株【博￣２。］等。国内学者以体外细胞培养和大体动物实验也发现过量氟可诱导组织细胞凋亡［２１～２８】。关于生精细胞凋亡，１９９０年Ｒｅｇａｎｄ指出，在正常生精过程中由于生殖细胞的减少而丢失的精子数，占精子生成总量理论值的２５％一７５％。在生精过程中，生精细胞的退化与细胞凋亡有关，它在生殖细胞成熟的特殊阶段被触发以维持细胞数目的平衡，并发生于生精过程的始终㈣３０１。在睾丸生精过程中，曲细精管内大量生殖细胞发生的凋亡对睾丸正常生理调节及某些疾病的发生具有重要意义。但关于氟能否导致生精细胞凋亡以及生精细胞凋亡在氟致雄性生殖损害中的意义的研究，国内外报道却较少。
本课题选用Ｗｉｓｔａｒ大鼠建立氟中毒动物模型。观察一定剂量的氟化钠对大鼠生精细胞凋亡的影响，并通过对睾丸、附睾脏器系数，睾丸氟含量，血清雄激素、雌激素含量，睾丸组织病理学的检测，探讨氟引起生精细胞凋亡的机制和染氟大鼠生殖系统损害与氟病发生发展的关系。
材料和方法
１．实验动物
选用４￣５周龄雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只，体重在１１０～１３０９之间，由河南省实验动物中心提供。
２．主要试剂
２．１氟化钠（ＮａＦ）优级纯批号２００３０２０６北京化工厂
２２氯化钾（ＫＣｌ）分析纯批号２００２１２２６北京化工厂
２．３盐酸（ＨＣｌ）优级纯批号２００２０８１３洛阳市化学试剂厂
２．４去离子水批号０３０６１５郑州纯水厂
２．５生理盐水批号２００３０５０７郑州竹林众生制药厂
２．６磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）批号ＺＬＩ．９０６２北京中山生物工程有限公司
２．７甲醛分析纯批号０３３２８７洛阳化学试剂厂
２．８乙醇分析纯批号０３１２０４郑州化学试剂二厂
２．９甲苯分析纯批号０３０２２３洛阳化学试剂厂
２．１０旺５碘一血清睾酮放射免疫测定试剂盒批号０３０９２５北京北免东雅生物技术研究所
２．１１１２５碘．血清雌二醇放射免疫测定试剂盒批号０３０９２５北京北免东雅生物技术研究所
２．１２原位细胞凋亡检测试剂盒批号０３０９０２华美生物工程公司
３．主要仪器及设备
３．１电子天平ＡＹｌ２０型上海精密科学仪器有限公司
３．２电光分析天平ＪＹ２００２型上海精密科学仪器有限公司
３．３组织匀浆器江苏常熟医用仪器厂
３．４氟离子选择电极ＰＦ．１型上海电元器件厂
３。５通用离子计ＰＸＤ．ｚ型江苏泰县无线电厂
３．６普通光学生物显微镜ＯＬＹＭＰＵＳ．ＢＸ５０型日本
３．７高压蒸汽灭菌器开封电器厂
３．８理化干燥箱ＬＧｌ００Ｂ型上海实验仪器厂有限公司
３．９医用离心机ＬＤＺ４—０．８型北京医用离心机厂
３．１０台式大容量冷冻离心机ＴＬ一４．５Ｒ型上海市离心机械研究所
３．１１自动丫免疫计数器ＴＪ一２００８Ｇ型国营二六二厂
３．１２超声波发生器ＴＹ８８型宁波新芝科器研究所
３．１３快速混匀器ＳＫ．１型江苏金檀医疗仪器厂
３．１４隔水式恒温培养箱ＧＮＰ一９０８０型上海精密实验设备有限公司
４．实验方案
４．１动物模型的建立
大鼠经检疫１周，无异常发现后，进行标号、称重，并随机分为６组，每组５只。各组大鼠均用河南省实验动物中心提供的普通全营养颗粒饲料（氟含量２．１１±Ｏ．７５ｍｇ／ｋｇ，酸浸一氟离子选择电极法）喂养，自由饮用自来水（氟含量０．３４±Ｏ．０５ｍ∥Ｌ，氟离子选择电极法＞。染氟组和对照组分别隔日腹腔注射ＮａＦ溶液和生理盐水（实验分组及处理见表１）［３１１。各组染毒结束后称重并处死动物，进行各项指标的检测。
表ｉ实验分组及处理
４．２动物体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数
各组大鼠染毒结束后，称取动物体重、麻醉、处死动物，取睾丸、附睾后立即称重。计算其脏器系数【３２】。
脏器系数（％）＝脏器湿重（ｇ）／体重（ｇ）×１００％
４．３血清雄激素、雌激素测定
处死大鼠前抽取其下腔静脉血，分离血清，用北京北免东雅生物技术研究
所生产的１２５碘一睾酮、１２５碘一雌二醇放射免疫测定试剂盒检测血清中睾酮（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，Ｔ）和雌二醇（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）含量。具体步骤见表２、３。
表２血清睾酮测定步骤（单位：ｂｔｌ）
充分混匀，任取两管测量，作为总放射性强度Ｔ。３５００ｒｐｍ（离心力３０００９）离心２５ｒａｉｎ，立即吸去上清液，测各管放射性（ｃｐｍ，测量时间小少于１ｍｉｎ）。
充分混匀，任取两管测量，作为总放射性强度Ｔ。３５００ｒｐｍ（离心力３０００９）离心２５ｍｉｎｔ立即吸去上清液，测各管放射性（ｃｐｍ，测量时间不少于１ｍｉｎ）?
两种激素均采用公式Ｂ／Ｂｏ＝（Ｂ－ＮＳＢ）／（Ｂｏ－ＮＳＢ）×１００％计算各标准管、质控和样本的Ｂ／Ｂｏ，以标准品的Ｂ／Ｂｏ值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，在Ｌｏｇｉｔ—Ｌｏｇ坐标纸上绘制标准曲线，根据样品Ｂ／Ｂｏ值，从标准曲线上查出样品的含量。本课题基于上述原理，采用自动Ｙ计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度。
４．４睾丸氟的测定
采用酸浸．氟离子选择电极法【３”。
睾丸样本的制备：麻醉后处死大鼠，取出左侧睾丸，剔除表面脂肪组织，恩５ｍｌ去离子水冲洗，除去血液。用滤纸拭干后于６０＂Ｃ烤箱中烘烤２４ｈ，干燥至
恒重，并称其重量。
总离子强度缓冲液（ＴＩｓＡＢ）的配制：取１１４ｍｌ冰醋酸，１１６９氯化钠，５８．８９柠檬酸三钠，用去离子水溶解稀释后，再用５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调ｐＨ至５．２～５．７，定容为１０００ｍｌ。
酸浸：取干燥至恒重的睾丸组织，眼科剪剪碎后，置于组织匀浆器中，加入７ｍｌ１Ｎ盐酸，充分研磨置备匀浆。然后转移匀浆至离心管中，并用少量离子强度缓冲液冲洗匀浆器，冲洗液也倒入离心管中。将离心管置于６０。Ｃ水浴锅中水浴６ｈ。取出后离心，小心吸取上清液，并用离子强度缓冲液定容至１０ｍｌ。再加入５ｍｌ去离子水，混匀，备用。
测定：用氟离子选择电极，采用标准加入法，测定氟浓度。
计算：按以下公式计算睾丸氟含量
睾丸氟含量（ｐ．ｇＦ＇／ｇ睾丸干重）＝（Ｃ×１５×１０００）／（Ｍ×１０００）
ｃ：测定用样液中氟的浓度（Ｉ．ｔｇ／ｍ１）
Ｍ：样品质量（曲
１５：样液总体积（ｍ１）
加标回收率测定：在测定各实验组睾丸氟的同时，选取同周龄正常大鼠睾丸组织，加入一定量的优级纯氟化钠，按上述操作步骤进行测定，并计算空白平行样品加标回收率。
４．５睾丸组织病理学镜检
常规ＨＥ染色［３１，３４，３５１。麻醉处死大鼠后，取出右侧睾丸，以体积分数为１０％的中性缓冲甲醛溶液４℃固定４８ｈ，较低温度（低于６０。Ｃ）下浸蜡、包埋。将睾丸常规横切成３－５ｍｍ的薄片，固定于预先用Ｏ，０１％多聚赖氨酸处理的载玻片上。３０＂Ｃ下烤片３０ｍｉｎ，然后脱蜡、水化：
（１）１００％二甲苯１５ｍｉｎ一（２）１００％二甲苯１５ｍｉｎ一（３）１００％－－苯１５ｍｉｎ一（４）１００％Ｚｄ§＇ｇ１５ｍｉｎ一（５）ｉｏｏ％ｚ，Ｎ１５ｍｉｎ一（６）９５％乙醇１５ｍｉｎ一（７）９５％乙醇１５ｍｉｎ一（８）８０％乙醇１５ｒａｉｎ（９）７５％乙醇１５ｍｉｎ（１０）去离子水５ｍｉｎ
ｆ１１）ＰＢＳ溶液３ｍｉｎ。
苏木素染色５ｍｉｎ，镜下控制盐酸酒精分化，水洗返蓝，伊红染色５ｍｉｎ，梯度乙醇脱水（浓度：７５％一８０％一９０％一１００％），－－甲ＮＮＮ，中性树胶封片。
型銮兰堕堂堕２００４硕Ｌ学每论文氟致人鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
干燥后置于光学显微镜下观察生精上皮细胞的层次、形态结构、脱落的细胞及管腔拥塞程度。并在４００倍视野下，每张切片上下左右中随机选取５个横截面曲细精管，计数从基底层到管腔中央生精上皮的细胞层数。
４．６生精细胞凋亡的检测
采用ＴｄＴ介导的末端标记法（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎ，ＴＵＮＥＬ＞，试剂盒为华美生物工程公司原位细胞凋亡检测试剂盒。石蜡切片的制各及脱蜡水化同ＨＥ染色方法，切片染色操作步骤如下：
（１）样品片放入新鲜配制的３％过氧化氢水溶液中，室温１０ｍｉｎ，双蒸水洗样品片５ｍｉｎ／次×３。
（２）用蛋白酶Ｋ稀释液稀释蛋白酶Ｋ储备液至２０１．ｔｇ／ｍｌ，然后按５０ｒｔｌ／片加至脱蜡入水后的样品片上，２５～３７。Ｃ在湿盒中放置１０～３０ｍｉｎ。
（３）双蒸水洗样品片５ｍｉｎ／次ｘ３。
（４）样品片上加标记缓冲液，２０肛１／片，室温放置１５ｍｉｎ。
邗）将末端脱氧核糖核酸转移酶（ＴｄＴ）及Ｂｉｏｔｉｎ一１１－ｄＵＴＰ经离心机离心，再于混匀器上混匀后，分别取２ｕｌ加入１６Ｉ＿ｔｌ标记缓冲液中，再在混匀器上混匀。（６）甩掉样品片上标记缓冲液，然后加上述己混匀的混合液至样品片上，２０卜１／片，３７℃于湿盒中标记６０ｍｉｎ。
（７）ＰＢＳ洗样品片，３ｍｉｎ／次Ｘ３。
（８）样品片加封闭液５０ｐ．１／）片，室温放置３０ｍｉｎ，然后甩掉封闭液，勿洗。
ｆ９）以封闭液按１：５０配制亲和素辣根过氧化物酶（Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）为工作液：５０ｐ１／片加于样品片上，３７℃湿盒反应６０ｍｉｎ。
ｆ１０１ＰＢＳ洗样品片，３ｍｉｎ／次Ｘ３。
（１１）将ＤＡＢ稀释液融化后混匀并按１：５０的比例稀释ＤＡＢ浓缩液配制成ＤＡＢ显色液。５０¨１／片加于样品片上，显微镜下控制显色。
ｆ１２１ＰＢＳ洗样品片终止显色。
（１３１苏木素复染。
（１４１常规封片、镜检。
光镜下凋亡细胞核特异性染色呈棕色，胞浆为浅棕色，非凋亡细胞为浅紫色。４００倍镜下，随机选取５个横截面曲细精管计数凋亡细胞，计算总生精细胞
郑州大学医学院２００４硕十学位论文氟致火鼠生精细胞凋亡及其机制的实验研究
凋亡率（个／曲细精管）：每张切片再随机选取５个视野计数５００个细胞中的凋亡细胞数，计算总生精细胞凋亡率（＋／５００个细胞）：计数精原细胞、精母细胞及精子细胞和精子各５００个中的凋亡细胞数，分别计算其凋亡率（个／５００个细胞）１３６，３７１。
４．７统计学处理
参照文献酬方法及步骤处理资料。各组数据以ｉ士ｓ表示，首先用ＳＰＳＳｌ２．０软件进行正态检验和方差齐性检验。同期各组间比较采用方差分析（Ａ－ＮＯＶＡ法）。相同染氟剂量不同染氟时间组之间的比较采用独立样本ｔ检验（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ｓａｍｐｌｅｓＴＴｅｓｔ）。各染氟组生精细胞凋亡率、性激素含量分别与睾丸氟含量作直线相关分析，各染氟组生精细胞凋亡率与性激素含量之间作直线相关分析。取Ⅱ＝Ｏ．０５为显著性检验水准。
结果
染毒期间，各组大鼠活动良好，被毛光泽。反应活跃，染氟组大鼠体重增
长缓慢。各染氟组与对照组大鼠的体重随染毒时间延长均呈正增长（Ｐ值均小于０．０１）。
１．动物体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数
染毒结束后，大鼠体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数见表４、图１—５。
表４各组大鼠体重、右侧睾丸和右侧附睾重量及其脏器系数比较（ｉ±ｓ）
右侧睾丸右侧附睾组染毒动物体右侧右侧
脏器系数时间数重睾丸附睾脏器系数
型业堡！塑！竺叟！坐！一旦Ｌ———ｊ翌一对照纽（Ａ）２８５２９９９０：１：４４１６６３±０２１０４３±００５０６３＋０２１ｏ１５＋ｏ０２
低剂量组（Ｂ）２８５２５６１０：１：１４９３‘ｌ４４±１１３０．３７±００２“０．７２＋００７”０１４＋０ｏｌ
高剂量组（ｃ）２８５２５０８１土２３６２’１４６±０２３０．３６±００２”０．４５±００３”‘ｏ１５＋ｏ叭
！堡竺：竺：．！竺！竺！———竺坠一
１６＋Ｏ∞
对照组（Ｄ）３８５３４６６８±２１８６１８８士０１６０．５４±００７０５５＋００７ｏ
６㈣ｌｏ’０４６ａ：０．０５”０．５８＋－００７ｏ１“ｏ０２
低剂量组（Ｅ１３８５２８９８７±２６７０“１
高剂量组（Ｆ）３８５２８６０５±２４１８“６ｌ５２士ｏ０７“酏０．４５－＋００５帖ｏ５４±ｏ０５０１７＋００２ｎ三篁：：竺坚！：．：！！竺ｏ＿——』兰一注：＋与同期对照组比较Ｐ＜Ｏ０５，¨弓同期对照组比较Ｐ＜ＯＯＩ：
?与同期低剂量组比较Ｐ＜Ｏ０５，“与矧期低剂量组比较Ｐ＜Ｏ０１；
一与同剂量染毒２８ｄ组比较Ｐ＜Ｏ０５，出与同剂量染毒２８ｄ组比较Ｐ＜ＯＯｌ
４００
３５０
３００
—２５０
恻２００
蛙１５０
１００
５０
０
时间（ｄ）
图１各组大鼠体重比较
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