酶联免疫反应常用底物
辣根过氧化物酶HRP底物
辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。
■ HRP的发色底物
辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2），其真正底物是H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。在ELISA中常用的供氢体有以下几种：
1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm），其灵敏度高，测定方便。
2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。
3、DBA供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。此种多聚物能被还原和
※小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制HRP的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂。■ HRP的发光底物
鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol），是一类重要的发光试剂。用HRP标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。反应过程如下图所示：
■配套产品
碱性磷酸酶底物
碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。其含量的变化能引起肝炎、肝癌等疾病，是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。
PNPP（p-Nitrophenyl phosphate disodium salt）是常用的碱性磷酸酶底物，当碱性磷酸酶与PNPP反应后，形成黄色水溶性反应产物，其在&lambda＝405 nm有光吸收。其反应灵敏，颜色鲜明，在诊断试剂盒生产中得到广泛应用。
BCIP和NBT是碱性磷酸酶最佳的发色底物组合之一，产物为深蓝色。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan，从而达到标记作用。
CAS包装
Nitrotetrazolium Blue chloride, 100 mg
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
附件1 酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。 三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生
酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围
酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg 陈桂花1a，谭玉华2，罗颖照1b（1.广州经济技术开发区红十字会医院，a检验科,b体检中心，广东广州 510530 ；2.广州市丰华生物工程有限公司，广东广州 510730） 摘要：目的比较2种方法4种试剂乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的检测性能，并探讨HBsAg阳性HBV血清标志物（HBV M）模式组间及其与HBsAg阴性模式组间的HBsAg 浓度差异。方法酶联免疫法（ELISA）对1205例标本HBV M进行定性检测。其中定性检测的153例标本再用3个厂家的时间分辨荧光免疫法（TrFIA）定量测试试剂进行HBsAg比对检测，其余经定性检测的1052例标本均再用TrFIA定量测试试剂进行HBsAg定量检测，对HBsAg结果进行统计分析。结果 2种方法4种试剂间HBsAg阳性检出率差异均无统计学(P>0.05)，3个厂家的TrFIA法试剂HBsAg定量检测结果相关性良好，r>0.95。TrFIA法能对0.2ng/ml—1.0ng/ml的低浓度HBsAg标本进行有效检测。研究发现TrFIA法定量检测未经稀释的HBV感染者血标本HBsAg浓度在0.2ng/ml—650ng/ml间。“HBsAg、e抗原（HBeAg）、核心抗体（抗-HBc）”阳性模式组HBsAg浓度与“HBsAg、抗-HBc”阳性、“HBsAg、e抗体（抗-HBe）、抗-HBc”阳性、“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组和“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组间HBsAg浓度差异无统计学意义(P>0.05)，“HBsAg、抗-HBc”阳性模式组、“HBsAg、抗-HBe、抗-HBc”阳性模式组HBsAg 浓度与“HBsAg”单阳性模式组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg”单阳性模式组和“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05），“HBsAg阳性模式”组HBsAg浓度与“HBsAg阴性模式”组HBsAg浓度差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HBsAg 出现的早晚和它被清除的早晚与感染剂量、感染方式以及病情轻重有关。HBeAg或抗-HBe 的出现与HBsAg的浓度呈一定的关系，HBsAg浓度与病毒的复制存在一定的关系。ELISA法HBV M定性检测结合TrFIA法HBsAg定量检测对HBV感染诊断和防治具有重要意义。 关键词：酶联免疫法；时间分辨荧光免疫法；乙型肝炎病毒，表面抗原 HBsAg是HBV感染后血清中首先出现的标志物HBV M，可作为乙肝的早期诊断和普查项目。HBsAg的检测受到许多研究者的关注[1-6]，随着标记免疫方法学的飞跃发展，HBsAg检测的灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为临床诊断提供了更多的信息。作者采用了1个厂家的ELISA法定性诊断试剂与3个厂家的TrFIA定量测试试剂对HBsAg 进行了比对检测，结果与分析如下。 一材料与方法 1. 标本标本采自广州市经济技术开发区红十字会医院门诊病人、住院病人和体检人员标本1205例，及时分离血清，-20℃保存备用。 2. 仪器与试剂 ST-360 型酶标仪（上海科华公司），酶联免疫法乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（国药准字S1*******，上海荣盛公司）；Victor2-D1420时间分辨荧光免疫仪（美国PE公司）；时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒表面抗原定量测试试剂盒[国药准字S2*******，广州丰华公司；国药准字S2*******，苏州新波公司；国食药监械（准）字2007第3401095号，中山大学达安公司]；DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机和FWZ-Ⅱ型恒温微量振荡仪（广州丰华公司）。 3. 方法 ELISA法与TrFIA法均严格按试剂盒和仪器说明书操作。ELISA法对以上1205例标本进行定性检测，按说明书结果判断方法判读阴阳性，对弱阳性的HBV M、“HBsAg、抗-HBs”或“e抗原、e抗体”双阳模式的HBVM均须2孔复查，仍为阳性者判为阳性。其中定性检测 作者简介：陈桂花，女，1974年9月生，本科，检验技师，主要从事免疫学检验工作。
ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
酶联免疫吸附法检测乙肝五项结果常见影响因素分析 【摘要】目的分析乙肝五项酶联免疫吸附法检测常见影响因素。方法对酶联免疫吸附方法检测单乙肝病毒表面抗原阳性和表面抗原抗体同时阳性的标本其S/CO值小于4.0大于1.0的289例标本再用免疫荧光分析的方法检测的两种HBsA。AXSYM免疫荧光分析仪为美国雅培公司产品;HBsAg免疫荧光试剂盒为美国雅培公司产品,HBsAgELISA试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司产品,按常规方法检测。HBV-DNA定量以1.00×10.3 copies/mL为判定阳性的标准,＜1.00×10.3 copies/mL判为阴性,＞1.00×10.3 copies/mL判为阳性。结果采用ELISA 法HBsAg阳性234例(80.96%),HBsAg和HBsAb同时阳性55例(19.03%),S/CO 阳性平均值 3.78,阳性率100%;免疫荧光分析法HBsAg阳性202例(69.89%),HBsAg和HBsAb同时阳性34例(11.76%),S/CO阳性平均值14.98,阳性率81.66%。结论乙肝五项是乙型肝炎治疗依据的重要指标,严格按照操作步骤进行操作,做好室内质控、室间评价是保证检测质量,杜绝假阳、假阴性结果的重要手段。 【关键词】乙肝五项;酶联免疫吸附法;乙型肝炎 ELISA试验以灵敏度较高,特异性较好的特点在临床广泛应用。但操作中的每个环节对试验的检测结果影响较大,如不按常规操作,有时会出现假阳性和假阴性的情况。我们根据多年在检验室的工作经验,总结以下可能会影响乙肝五项ELISA检测结果的因素。 1 资料与方法 1.1 临床资料289例标本均是我院门诊和住院患者检测乙肝五项的标本,其中男156例,女133例,年龄18~72岁,平均4 2.5岁。最小年龄为1岁,最大年龄为83岁。 1.2 方法对酶联免疫吸附方法检测单乙肝病毒表面抗原阳性和表面抗原抗体同时阳性的标本其S/CO值小于4.0大于1.0的289例标本再用免疫荧光分析的方法检测的两种HBsA。AXSYM免疫荧光分析仪为美国雅培公司产品;HBsAg 免疫荧光试剂盒为美国雅培公司产品,HBsAgELISA试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司产品,按常规方法检测。HBV-DNA定量以1.00×10.3 copies/mL为判定阳性的标准,＜1.00×10.3 copies/mL判为阴性,＞1.00×10.3 copies/mL判为阳性。 2 结果 采用ELISA法HBsAg阳性234例(80.96%),HBsAg和HBsAb同时阳性55例(19.03%),S/CO阳性平均值3.78,阳性率100%;免疫荧光分析法HBsAg阳性202例(69.89%),HBsAg和HBsAb同时阳性34例(11.76%),S/CO阳性平均值14.98,阳性率81.66%。
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的 应用 简介 随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 辣根过氧化物酶 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
分子生物学与生物化学课程论文 酶联免疫（ELISA）检测方 法 学院:山西农业大学信息学院 系部:农业与生命科学系 专业:生物技术 班级:102班
学号:2010010229 姓名:高淼 时间:2013年5月5日
酶联免疫（ELISA）检测方法 摘要：酶联免疫法简称ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 关键词：ELISA基本方法抗体抗原 前言： 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 一、基本原理 将抗原或抗体结合到某种固相载体，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留酶的活性，也不会改变抗体的免疫学特性。而常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AKP)等。①在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 二、其原理的免疫学基础
抗核抗体的检测间接免疫荧光法 和酶联免疫吸附试验法的比较 刘淑梅 (德州市立医院,德州235000) 【摘要】 目的 应用间接免疫荧光法(Indirect lmmunofluoreseent,Assay,IFA)与酶联免疫吸附试验(Enz yme Linked Immunosor-bent Assay,ELISA)检测血清抗核抗体并进行比较。方法 IFA法按说明书操作,在荧光显微镜下观察到特异的荧光模型为阳性;ELISA法按说明书操作,S/CO≥1.10为阳性,0.91～1.09为可疑,≤0.90为阴性。结果 检测临床疑似血清99份,IFA法阳性35份,阳性率35.36%,ELISA法阳性34份,阳性率34.35%,两法符合率87.88%,x2=0.1,P>0.05,结果有差异标本12份。结论 检测疑似病人血清标本两法阳性率无显著性差异。 【关键词】 间接免疫荧光;ELISA;抗核抗体 Comparison of Indirect lmmunofluorescent Assay and Enzyme Linked Immunosorbent Assay in detection of antinuclear antibody Liu Shumei(Dezhou Municipai Hospital253000) 【Abstract】Objective To compare antinuclear antibod y tests for autoimmune disease with IFA and ELISA.Metho d IFA was followed the kit's direction and made visible with the fluorescent microscope.The postitive result show a distinct fluorescence.ELISA was also fo11owed the kit's direction,and the results was interpreted as S/C O.Results99sera were collected from the suspected patients with autoimmune disease. Amon g these speclments,IFA pos itive rate was35.36%(35/99),and ELISA was34.35%(34/99).There were no significant difference be-tween the t wo tests(X2=0.1,P>0.05).Conclusion There is no significant difference between IFA and ELlSA in test the ANA of the patents. 【Key words】Indirect Immunofluorescent Assay;ELISA;Antinuclear Anlibody 抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)是一组将自身真核细胞的各种成分作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性,如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、混合性结缔组织病(MCTD)、千燥综合症(SS)、硬皮病、慢性活动性肝炎等。抗核抗体的检测在自身免疫病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效和预后估计中具有较大的意义,因此常将抗核抗体的检测作为自身免疫病的重要初筛试验。目前采用较多的方法是三大免疫标记技术,即免疫荧光技术、酶免疫技术和放射免疫分析,本文采用间接免疫荧光法(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对99份临床疑似自身免疫病患者血清进行检测和比较,现报告如下: 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源 自采集血清标本99份,为2005年4月至5月江阴各医院门诊及住院怀疑为自身免疫性疾病患者。 1.1.2 试剂来源 间接免疫荧光法(以下称IFA 法)试剂为欧蒙(德国)医学实验诊断公司研制的Hep-2/猴肝生物薄片,酶联免疫法(以下称E LISA 法)购自美国宙斯(Zeus)公司。 1.1.3 01ympus荧光显微镜 Bio-Rad680酶标仪 Bio-Rad1575洗板机。 1.2 方法 1.2.1 I FA法检测抗核抗体 血清1:80稀释后按试剂说明书操作。设立阴性对照及阳性对照血清。于荧光显微镜下10＊20观察结果,以出现特异性荧光模型为阳性结果,根据文献[1]将荧光模型分为均质型,斑点型,核仁心,核膜型等。 1.2.2 ELI SA法检测抗核抗体 按试剂盒说明书操作,检测同步操作阴阳对照及三份校正品,结果按S/CO≤0.90为阴性,≥1.10为阳性,0.91～0.09为可疑报告,C O值计算方法为校正因子＊校正品平均值,校正因子由试剂厂家提供。 · 43 · 医学检验与临床 2007年第18卷第4期 M edical Laboratory Science and Clinics,2007,Vol18,No.4
酶联免疫法检测试剂主要原材料、生产工艺及 质量控制注册技术审查指导原则（报批稿） 一、前言 本指导原则的主要目的是规范申请人对酶联免疫类检 测试剂的主要原材料研究资料、生产工艺及反应体系研究资料的准备，并对产品质量控制提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水 平下制订的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外 诊断试剂的注册技术审查，其它酶联免疫法检测试剂（如 作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。
三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量
分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。 免疫组化： 是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 Elisa（酶联免疫吸附试验）： 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。 免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。 western bolt：