氯胺酮对大鼠神经干细胞增殖、凋亡、分化影响的研究
摘要
氯胺酮是Ｎ＿甲基．（ｄ）一天（门）冬氨酸受体（ＮＭＤＡ－－Ｒ）的拮抗剂，作用于ＮＭＤＡ－－Ｒ的苯环哌啶（ＰＣＰ）受点，由于大剂量的ＮＭＤＡ、Ｇｌｕ都不能逆转其作用，故称ＮＭＤＡ－－Ｒ非竞争性拮抗剂。ＮＭＤＡ?Ｒ非竞争性拮抗剂与离子通道深部位的ＰＣＰ受点结合，阻断与ＮＭＤＡ－－Ｒ耦联的钙通道，减少钙离子内流，从而影响或逆转谷氨酸、甘氨酸等兴奋性氨基酸对神经系统发育的调节。近年的研究却发现，暂时拮抗ＮＭＤＡ－Ｒ可激发快速生长期未成熟哺乳动物大脑神经元的大量凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）。人类大脑的快速发育期大约为胚胎后三个月至出生后２４岁，由于世界范围内的药物滥用以及无痛分娩、胎儿手术，尤其是新生儿、婴幼儿手术的广泛开展，氯胺酮作为婴幼儿麻醉的一线药物，在临床上大量使用。此时正处于大脑的快速发育期，在此阶段短暂的使用ＮＭＤＡ－Ｒ拮抗剂氯胺酮就能使新生鼠大脑大量神经元发生凋亡，其结果是发生凋亡性神经变性改变，导致脑实质体积缩小和长时间的神经行为异常，但氯胺酮对神经干细胞的影响尚未见文献报道，本实验在体外培养和鉴定大鼠神经干细胞后，将大鼠神经干细胞和不同浓度的氯胺酮共同培养，采用Ｍｌ＂ｒ法测定氯胺酮对神经干细胞增殖的影响，用ＴＵＮＥＬ和流式细胞术检测氯胺酮对神经干细胞凋亡的影响，用流式细胞仪检测氯胺酮对神经干细胞分化的影响。实验结果和分析如下：１．我们从胎鼠海马区分离培养的细胞群具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的分裂增殖能力，属于胚胎早期细胞，具备了神经干细胞的基本属性，是中枢神经系统的干细胞。
２．氯胺酮浓度大于５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，对大鼠神经干细胞的增殖有明显的抑制作用，并随着氯胺酮浓度的增加，这种抑制作用也逐渐增强，有明显的剂量相关性。其最小半数抑制剂量为４６７．１５ｍｍｏｌ／Ｌ。氯胺酮对神经干细胞增殖的抑制作用可能与氯胺酮降低细胞内钙离子［ｃａ２＋】ｉ浓度有关。
３．氯胺酮能触发培养大鼠神经干细胞和幼鼠在体神经千细胞的大量凋亡，并且随着氯胺酮浓度的提高，凋亡率也随之上升，有明显的量效相关性。其机制有待进一步研究。
Ｉｖ
４．氯胺酮在高浓度（ＳＯＯｍｍｏｌ／Ｌ）时可影响神经干细胞的分化趋势，使神经元分化比例减少而星型胶质细胞分化比率明显升高。氯胺酮降低细胞内钙离子浓度而影响钙离子的峰电位，并且导致大量神经元细胞的凋亡，这些都可能使神经干细胞分化为神经元的比例下降。
关键词：氯胺酮神经干细胞增殖凋亡分化
Ｖ
蔓三兰墨奎堂堡主堑塞生丝苎
一
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙＯｌｌｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｏｆｒａｔｓ
ＫｅｔａｍｉｎｅｉｓａⅡａｎｔａｇｏｎｉｓｔｏｆｇｌｕｔａｍａｔｅＮ－ｍｅｔｈｙｌ?ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＮＭＤＡ－Ｒ）ｗｈｉｃｈｔａｋｅｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅＰＣＰｓｉｔｅｏｆＮＭＤＡ－Ｒ．Ａｓａｎｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｃａｎｎｏｔｂｃｒｅｖｅｒｓｅｄｅｖｅｎｂｙｈｉｇｈｄｏｓｅｏｆＮＭＤＡｏｒｇｌｕｔａｍｉｅ（Ｇｈｌ）．ＮＭＤＡ－Ｒｎｏｎ—ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｃｏｍｂｉｎｅｓｗｉｔｈｔｈｅＰＣＰｓｉｔｅｉｎｔｈｅｄｅｃｐｏｆＮＭＤＡ－Ｒｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ，ｂｌｏｃｋｉｎｇｔｈｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｌｉｎｋｅｄＮＭＤＡ．ＲｔｏｍｄｕｃｅｔｈｅｉｎｆｌｏｗｏｆＣａ２＋。ｗｈｉｃｈｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｒｒｅｖｅｒｓｅｓｔｈｅａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｏｆｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙａｍｉｎｏａｃｉｄ（ｓｕｃｈａｓＧｌｕ，Ｇ１ｙ）ｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ．ＲｅｃｅｎｔｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｃａｎｂｅｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙｔｈｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｂｌｏｃｋａｄｅｏｆＮＭＤＡ－Ｒｉｎｓｐｕｒｔｐｅｒｉｏｄｉｎｔｈｅｉｒｍｎａｔｕｒｅｍａｍｍａｌｉａｎｂｒａｉｎ．Ｉｎｈｕｍａｎｓ，ｔｈｅｓｐｕｒｔｐｅｒｉｏｄｏｆｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｂｒａｉｎｅｘｔｅｎｄｓｆｒｏｍｔｈｅ６ｔｈｍｏｎｔｈｏｆｇｅｓｔａｔｉｏｎｔＯｓｅｖｅｒａｌｙｅａｒｓａｆｔｅｒｂｉｒｔｈ．ＴｈｅｒｅｉｓｂａｓｉｓｆｏｒＣｏｎｃｅｒｎｔｈａｔｋｅｔａｍｉｎｅｂｅｅｘｔｅｎｓｉｖｅｕｓｅｄｉｎｐｅｄｉａｔｒｉｃａｎｄｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒｐｕｒｐｏｓｅｓｏｆｓｅｄａｔｉｏｎａｎｄａｎｅｓｔｈｅｓｉａｂｕｔｋｅｔａｍｉｎｅｊｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｗｉｄｅｓｐｒｅａｄａｐｏｐｔｏｔｉｃｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｉｓｖｕｌｎｅｒａｂｌｅｐｅｒｉｏｄｌｅａｄｉｎｇｔｏｒｅｄｕｃｉｎｇｏｆｂｒａｉｎｍａｓｓａｎｄｎｅｕｓｒｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ．Ｔｈｅ／ｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｏｎｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｆＮｓＱｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ．Ｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙ，ｗｅｉｓｏｌａｔｅｄａｃｅｌｌｌｉｎｅｗｈｉｃｈｈａｓａｂｉｌｉｔｉｅｓｔｏｆｏｒｍｃｌｏｎｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｓ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｒａｔｓｂｙｕｓｉｎｇｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｃｌｏｎｅ．Ａｆｔｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗａｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉ也ｋｅｔａｍｉｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｏｎＮＳＣｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＷａＳａｓｓａｙｅｄｂｙＭＴＴｍｅｔｈｏｄ，ｉｔｓｃｆｆｃｃｔｏｎＮＳＣａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｄｗｉｔｈＴＵＮＥＬｍｅｔｈｏｄａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎＮＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｓｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ∞ＣｈＤ．
Ｒｅｓｕｌｔａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ：
１．Ｔｈｅｃｅｌｌｓｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｒａｔｓｐｏｓｓｅｓｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｆｏｒｍ
ｃｌｏｎｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｆｉ．ａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｌｌｓ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓａｎｄｉｔｃａｎｅｘｐｒｅｓｓ
Ｎｅｓｔｉｎａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｅｙｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅｆｏｒｅｐａｒｔｅｍｂｒｙｏｃｅｌｌｗｈｉｃｈｈａｖｅａｌｌｔｈｅａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｆ
ＮＳＣ．
２．ＷｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓＯＶｅｒ５０ｍｍｏｌ／Ｉ＾ｋｅｔａｍｉｎｅｇｒｅａｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＮＳＣ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔＷａｓｅｎｈａｎｃｅｄｗｉ出ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＴｈｅＩＣ５０
ｉｓ４６７．１５ｍｍｏｌ／Ｌ．ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｋｅｔａｍｉｎｅｏｎＮＳＣｍａｙｈａｖｅｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅ
Ｈ
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ｄｅｃｒｅａｓｅｄｍｔｍｃｅｌｌｕｌａｒＣａ２＋ｃｏｎｃｃｎｔｒａｄｏｎｃａｕｓｅｄｂｙｋｅｔａｍｉｎｅ．
３．ＫｅｔａｍｉｎｅｔｒｉｇｇｅｒｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＮＳＣｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｖｉｖｏａｎｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｉｏｒｏｓｅ
ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｋｅｔ田ｎｉｎｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈｅｍｅｘｉｓｔｏｂｖｉｏｕｓ
ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｉｌｌｎｅｅｄｍｏｒｅｓｔｕｄｙ．
４．ＫｅｔａｍｉｎｅｗｉｌｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅＮＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｉｔｓｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（５００ｍｍｏＩ／Ｌ）ｗｈｉｃｈｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｎｅｕｒｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｉｏａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅａｓ缸ｏｃｙｔｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｉｏ．ＫｅｔａｍｉｎｅｒｅｄｕｃｅｔｈｅＣａ２＋ｓｐｉｋｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｙｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｍｃｉｏｎａｎｄｔｒｉｇｇｅｒｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｅｕｒｏｎｉｎｇｒｅａｔｄｅａｌｗｈｉｃｈｌｅａｄｔｏｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｎｅｕｒｏｌｌｒａｔｉｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｆｚｏｍＮＳＣ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｋｅｔａｍｉｎｅ，Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｉｌｌ
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常用英文缩写一览表
英文缩写英文名称中文名称
ＡＢＣａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ抗生物素一生物素?过氧化物酶复合物ＢＦＧＦＢａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ碱性成纤维生长因子
ＭＴＴ３－（４，５一ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一噻唑蓝
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ
ｃＮＰ
ＮＳＥ
ＣＮＳ
ＤＭＥＭ
ＦＣＭ
ＦｒｒＣ
ＧＦＡＰ
Ｎｅｓｔｉｎ
ｒ１１ｒＮＥＬ
ＰＢＳ
ＮＳＣ
ＮＭＤＡ．ＲＣｙｃｌｉｃｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏ－－ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
２＇３—环核昔酸磷酸二脂酶
Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ
神经元特异性烯醇化酶
Ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ中枢神经系统
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ改良的基础培养基
Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ叽流式细胞仪测量术
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｏｔｈｉｏｙａｎａｔｅ异硫氰酸荧光素
Ｇｌｉａｌａｃｉｄｉｃｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｐｒｏｔ．ｅｉｎ胶质酸性纤维蛋白
Ｎｅｕｒｏｅｐｉ也ｅｌｉａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ神经上皮干细胞蛋白
ＴｄＴＭｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰＮｉｃｋｅｎｄ原位缺口末端标记
Ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄ翰ｌｉｎｅ
磷酸盐缓冲液
Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｉｌ神经干细胞
ＧｌｕｔａｍａｔｅＮ－ｍｅｔｈｙｌ．ｄ．Ｎ．甲基．（ｄ）．天（门）冬氨酸受体ａｓｐａｒｔａｔｅ（Ｎ删ｒｅｅｅｐｔＯｒ
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氯胺酮对大鼠神经干细胞增殖、凋亡、分化影响的研究
前言
近年的研究发现，暂时拮抗Ｎ．甲基．（ｄ）．天（门）冬氨酸受体（ＮＭＤＡ．Ｒ）可激发快速生长期未成熟哺乳动物大脑神经元的大量凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）。快速生长期未成熟哺乳动物大脑神经元大量凋亡的结果则是发生凋亡性神经变性改变，导致脑实质体积缩小和长时间的神经行为异常。酒精，是ＮＭＤＡ受体的拮抗剂的一种，上世纪７０年代人们认识到妊娠期间大量服用乙醇或者子宫内胎儿接触乙醇都会导致一种神经发育综合症，称之为胎儿乙醇综合症（ｆｅｔａｌａｌｃｏｈｏｌｓｙｎｄｒｏｍｅＦＡＳ）或胎儿乙醇影响（ｆｅｔａｌａｌｃｏｈｏｌｅｆｆｅｃｔｓＲ蝴。ＦＡＳ以颅骨异常、小头畸形、智力低下、精神发育迟缓为特征。在未成熟大脑快速发育期保持乙醇血浓度２００ｍｇ］ｄＬ持续４小时就能触发大脑实质细胞的凋亡、变性坏死，如果保持这一浓度的时间超过４小时，脑细胞凋亡、变性坏死的严重程度及范围与持续时间成正比。电子显微镜下观察发现乙醇对神经细胞的损伤具有凋亡的典型特征。给予ＮＭＤＡ受体绉抗剂后神经元凋亡损伤分布型与给予乙醇后出现的神经元凋亡分布型基本一致。妊娠三期孕妇服用酒糟斟起的脑组织结构改变和神经性行为异常为特征的婴儿酒糟综合痘促进７翊瞧ｌＡ爱体拮抗齐４对未成熟大脑损伤作用的研究，从而发现了ＮＭＤＡ受体接抗掰能导致未成熟大脑的快速生长期神经元凋亡的现象。
由于世界范围内的药物滥用以及无痛分娩、胎儿手术，尤其是新生儿、婴幼儿手术的广泛开展，氯胺酮作为婴幼儿镇静的—线药物．在临床上大量使用。此时正处于大脑的快速发育期，人类大脑豹快速发育期大约为胚胎后兰个月至出生后２．３岁。在大脑的快速发育阶段，ＮＭＤＡ受体有一个过度敏感期，对作用于ＮＭＤＡ受体的药物非常敏感，并可对神经细胞产生毒性作用。研究表明，大鼠的相似阶段为怀孕晚期到生后２周，在此阶段短暂的使用ＮＭＤＡ描抗荆氯胺葫就艟使新生鼠大脑大量神经元发生凋亡。在大脑快速发育期存在着大薰的神经千细胞，这些神经干细胞可以分裂增殖，并分化成为大脑内各种神经细胞的来源，‘对大脑的发育形成以及神经元损伤后的再生有重妥意义，然而，目前氯胺酮对神经千组胞增殖、旗亡、分化的影响及其机制尚未见报道．
本实验在体外分离培养大鼠神经干细胞的基础上，将大鼠神经干细胞和不同浓度的氯胺酮共同培养，应用免疫组化、ＭＴＴ、流式缎胞仪等方法研究氯胺酮对大鼠神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响，为进一步的分子机制等研究提供依据。
净
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材料与方法
一、实验动物：
孕鼠（１６天）、新生鼠（Ｐ４）均为Ｗｉｓｍｒ大鼠，由第三军医大学动物实验中心提供。实验分组
目的实验分组１数目
ＭＴＴ法测氯胺酮对按氯胺酮浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）分为０、５、１０、每组各５瓶培养ＮＳＣ
ＮＳＣ增殖的影响２０、５０、ｉ００、２００、５００、１０００共９组细胞
ＴＵＮＥＩ法检测氯胺酮阳性对照组：一抗为ＴＵＮＥＬ反应液每组细胞贴壁玻片
对ＮＳＣ凋亡的影响阴性对照组：ＰＢＳ代替一抗备３片
ＴＵＮＥＩ、Ｎｅｓｔｉｎ双标法阳性对照组：肌注氯胺酮５０ｍｍｏｌ／Ｌ每组Ｐ４大鼠各３只
检测氯胺酮对ＮＳＣ凋阴性对照组：肌注等量生理盐水
亡的影响
ＰＩ法检测氯胺酮对按氯胺酮浓度（ｍｍｏｌ／Ｌ）分为０、１００、每组各５瓶培养ＮＳＣ
ＮＳＣ凋亡的影响４６７．１５、１０００共５组细胞
流式细胞仪检测氯胺酮按氯胺酮浓度（ｍｍｏＩ／Ｌ）分为０、１０、１００、每组各５瓶培养ＮＳＣ
对ＮＳＣ分化的影响５００共４组细胞
二、主要器材和试剂：
（一）主要器材：
１．酶标分析仪Ｂｉｏ—Ｒｅｄ美国
２．ＳＰＥＧＡＩＲＴＥＣＨ超净工作台苏州净化设备厂
３．ＴＣ２３３Ｃ０２恒温培养箱美国ＳＨＥＬＬＡＢ
４．ＸＤＳ．１倒置显微镜重庆光学仪器厂
５．荧光显微镜ＯＬＹＭＰＵＳ日本
６．流式细胞仪（ＦＡＣｓｔｍＰＬＵＳ型）ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｓｏｎ公司美国
７．电子天平（ＬＩＢＲＯＲＡＥＧ－２２０Ｇ型）ＳＨＩＭＡＤＺＵ公司日本
８．解剖显微镜重庆光学仪器厂
９．珠江Ｓ．２０７相机重庆光学仪器厂
１１．电冰箱（４０ｃ，．２００Ｃ）青岛海尔电冰箱厂
１２．动物手术器械无锡医用器材厂
１３．ＴＤＬ８０．１Ａ低速台式离心机上海安亭科学仪器厂
１４．ｚｅｉｓｓ滤器上海医用分析仪器厂
２
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１５．细胞培养有关小型器皿等（二）主要试剂：
１．细胞培养试剂：
合成培养基ＤＭＥＭ／Ｆ１２
Ｂ２７
ＢＦＧＦ
胎牛血清
青霉索
链霉素
２．单克隆抗体及多克隆抗体：
抗Ｎｅｓｔｉｎ培Ｇ
抗ＧＲ心多抗
抗ＣＮＰ培Ｇ
抗ＮＳＥ多抗
羊抗鼠二抗
３．其它试剂：
ＳＡＢＣ－Ｃｙ３荧光试剂盒
Ｆ１ＴＣ荧光＿＝抗
左旋多聚赖氨酸
ＴＵＮＥＬ试剂盒
氯胺酮
多聚甲醛
三、实验方法：
（一）主要试剂的配制：重庆玻璃仪器厂
Ｇｉｂｃｏ，美国
Ｇｉｂｃｏ，美国
Ｓｉｇｍａ，美国
Ｇｉｂｃｏ，美国
华北制药有限公司
华北制药有限公司
何家全博士后惠赠
中山公司
Ｐｒｏｍｅｇａ公司提供
中山公司
中山公司
Ｓｉｇｍａ，博士德公司代理电山公司
博士德公司
罗氐公司
上海弗Ｂ药一厂
重庆纯掌试齐Ｂ厂
１．磷酸缓冲液（ＰＢＳ）配制
在８００ｍｌ双蒸水中溶解ＮａＣｌ８９。Ｋａ０．２９，Ｎａ２ＨＰ０４１．０４９和ＫＨ２Ｐ０４０．２４９，用ＨＣＩ调ｐＨ值至７．４，加水定容为１０００ｍｌ，高压蒸气灭菌。
２．Ｄ．Ｈａｎｋ’Ｓ配制
称取ＮａＣＩ４．０９．ＫＣｉ０．２９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２００．０３９，ＫＨ２Ｐ０４０．０３９，ＮａＨＣ０３Ｏ．１７５９，酚红０．０１９，依次溶解上述药品于４００ｍｌ双蒸水中，定容至５００ｍｌ，高压蒸气灭菌。
３．０．２５％胰酶液配制
称取胰蛋白酶０．２５９溶予１００ｍｌＤ－Ｈａｎｋ＇ｓ液中．用ＮａＨＣ０３调ｐＨ值至８．０，过滤除菌．２０。ｃ保存备用。
＾３
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４．基本细胞培养液配制
将ＤＭＥＭ／Ｆ１２干细胞粉～袋倒入烧杯，加双蒸水５０ｍｌ使之溶解，冲洗烧杯三次，均加入容量瓶内，加入ＮａＨＣ０３３．７岛加双蒸水至１０００ｍｌ，用１ＮＮａＯＨ或ＩＮＨＣＩ调节ｐＨ值为７．２－７．４之间，用Ｚｅｉｓｓ过滤器过滤除菌，分装入消毒瓶中．２０。Ｃ保存备用，应用前将青、链霉素（均为１００Ｕ／ｍ１）加入上述的培养液中，另加入添加剂（ｂＦＧＦ、Ｂ２７）。
５．多聚赖氮酸的配制‘
按产家提供的说明书进行，即将多聚赖氨酸按１：１０的比例稀释于已消毒的双蒸水中，使用针式滤器过滤，孵育盖玻片３０分钟，消毒双蒸水清洗２次后将盖玻片置入无菌培养孔中，晾干后即可使用。
（二）神经干细胞的分离和传代
所有的细胞培养操作均参照鄂征主编的《组织培养和细胞分化子生物学技术》和司图镇强、吴军正主编的《细胞培养》两书有关章节进行。
１．无血清细胞培养液的配制：
在上述的基本培养液中加入无菌的ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍ１）和Ｂ２７（每１００ｍｌ培养液加２ｒｏｔ），密闭备用。
２．动物取材：
胎鼠取材：选用孕鼠（１６天），固定四肢，脱颈处死。腹部备皮后碘酒和酒精消毒。在准备室内用无菌手术剪依次剪开下腹部皮肤、肌肉和腹膜，暴露子宫，从子富角开始解剖取出胎鼠，置于Ｄ．Ｈａｎｋ’ｓ液中漂洗。取胎鼠于７５％酒精中浸透５秒消毒后固定于冰台上，用眼科剪和眼科镊剪开头皮和软骨，暴露胎鼠大脑，取胎鼠海马组织，于Ｄ—Ｈａｎｋ’ｓ液中反复漂洗，将上述的脑组织转移到ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）加Ｂ２７和ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍ１）的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后在多马氏计数台上进行活细胞计数，于每个培养瓶ｄＰ（７Ｓｍｌ培养瓶）加入５×１０５个活细胞，每瓶中加入上述的无血清培养液５－７ｍｌ进行原代培养。
３．神经干细胞传代培养：
待原代克隆形成后再次使用吸管吹打机械分离克隆，相差显微镜下观察显示为单细胞悬液，计数后每培养瓶中加入５×１０４个活细胞。此后每６－＿９天机械分离克隆传代一次，方法同前，仍采用无血清培养基（含ｂＦＧＦ和Ｂ２７，浓度同前）。在传代的同时进行克陛形成实验和单细胞克隆实验，并计数每代细胞的克隆形成率（见后）。
（三）单细胞克隆系的建立
采用有限稀释法。选取原代克隆制作的单细胞悬液，活细胞计数后逐步稀释到４０个细胞／毫升，于９６孔培养板中滴加稀释的细胞悬液（每孔５即ｌ细胞悬液和５叻ｌ无血清培养液，１—２个细胞／孔），２小时后相差显微镜下观察计数，选取仅有１个细胞的培
’
４
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养孔作记号，动态观察。
选取最初只有一个细胞长成的单细胞克隆，机械分离成单细胞悬液，将一个克隆的所有细胞种入２５ｍｌ培养瓶中培养（培养基仍同前），待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自单个细胞的亚克隆。
（四）克隆形成率计数实验
在上述的原代培养和亚克隆培养过程中均随机取培养瓶进行克隆形成率计数实验。采用方格分割的透明胶布贴于培养瓶上，计数在显微镜下格子中大于５０个细胞的克隆数，计数２０个方格的总克隆数除以２０后再乘以总方格数即得培养瓶的总克隆数，除去最初的种植细胞数，即得克隆形成率。
（五）神经干细胞的鉴定
１．Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光染色：，
取部分来自（二）和（三）中的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的２４孔培养板，每孔种植５０ｕｌ克隆液（约５０—８０个干细胞克隆），并加入含５％胎牛血清的有血清培养液，待培养２小时，８小时、７天后行Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光单标实验。
２．成熟ＣＮＳ细胞特异性抗原免疫荧光染色：
取部分来自（－－）和（三）中的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的２４孔培养板，每孔仍为５蛳ｌ克隆液，待贴壁２小时后分别行ＮＳＥ、ＧＦＡＰ和ＣＮＰ免疫荧光单标染色。本实验的目的是为了证明分离的细胞群为未分化细胞。
３．克隆细胞诱导分化后特异性抗原免疫荧光染色：
选取部分上述盼细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的２４孔培养板，每孔５陋ｌ克隆液，并加入有不同浓度氯胺酮的培养基（氯胺酮＋５％胎牛血清＋ＤＭＥＭ／Ｆ１２），观察分化结果，并予７天后行免疫荧光实验。即将来自（三）中的克隆在有氯胺酮培养液中培养７天后行ＮＳＥ、ＧＦＡＰ和ＣＮＰ免疫荧光单标染色。（具体步骤见下文）
（六）免疫荧光单标实验
在免疫荧光单标实验中均设阴性对照，用ＰＢＳ代替一抗。
（１）以０．０１Ｍ的ＰＢＳ液（ｐＨ７．４）漂洗培养孔中的盖玻片，５分钟Ｘ３次，然后用４％多聚甲醛固定１５分钟。
（２）０．０１Ｍ的ＰＢＳ液漂洗培养孔中的盖玻片，５分钟×３次
（３）将培养孔中的盖玻片转移到青霉素瓶塞上。
（４）加入含０．４％ＴｆｉｔｏｎＸ－１００和０．１％ＢＳＡ的ＰＢＳ液在３７。ｃ孵育１５分钟。
（５）０．０１Ｍ的ＰＢＳ液漂洗盖玻片，５分钟Ｘ３次。
（６）加入一抗，湿盒，置于４４Ｃ冰箱反应１２小时。
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第三军医大学硕士研究生论文
（７）０．０１Ｍ的ＰＢＳ液漂洗盖玻片，５分钟×３次。
（８）加入荧光二抗，湿盒，３７。Ｃ孵育６０分钟。
（９）０．０１Ｍ的ＰＢＳ液漂洗盖玻片，５分钟×３次。
ｆ１０）５０％甘油封片，立即荧光显微镜显色照相。
（七）流式细胞仪检测
１．ＰＩ法检测凋亡率
（１）收集培养的神经干细胞，机械吹打为单细胞悬液。
（２）８００～１０００ｒｐｍ／分，离心５分钟，２次。
（３）４００目过滤网过滤２次。
（４）用７０％酒精固定单细胞悬液，４。Ｃ保存，９６小时。
（５）８００～１０００ｒｐｍ／分，离心５分钟，去除酒精。
（６）０．０１Ｍ的ＰＢＳ漂洗。
（７）加入２０１ａｌＲＮａｓｅＡ３７０Ｃ水溶３０分钟。
（８）加入８００９ｌＰＩ染色液混匀，４０Ｃ避光保存３０分钟。
（９）流式细胞仪检测，记录激发波长４８８ｎｍ的红色荧光，每组五个样本，每个标本检测１００００个细胞，由计算机处理结果。
２．神经干细胞分化比率
（１）将来自（５１）中的分化细胞用ｏ．２５％胰酶消化，Ｄ．Ｈａｎｋｒｓ液漂洗１５００ｒｐｍ离心５分钟，重复３次。
（２）弃上清液，调整细胞数为ｌｏ‰ｄ，以７０％的乙醇固定３０分钟。
（３）以ＰＢＳ漂洗，５分钟Ｘ３次。
（４）按照（六）中的方法进行免疫荧光单标标记。
（５）标记后取少量细胞悬液涂片，在荧光显微镜下观察染色情况。
（６）用ＦＡＣｓｔａｒ流式细胞仪检测荧光强度，每组五个样本，每个标本检测１００００个细胞，由计算机处理结果。
（７）阳性率计算：阳性率＝阳性细胞／（阳性细胞＋阴性细胞）．对照组中的非特异结合率
（八）ＭＴＴ实验
（１）ＭＴＴ溶液；称取２５０ｍｇＭＴＴ，放入小烧杯中，加５０ｍｌＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）在电磁力搅拌机上搅拌３０ｍｉｎ，用Ｏ．２２ｕｍ的微孔滤器除菌，分装，４＂Ｃ保存。两周内有效。
（２）接种细胞：机械吹打分离神经干细胞克隆团，用含ｂＦＧＦ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液配成单个细胞悬液，以每孔５Ｘ１０４个细胞接种于９６孔培养板中，每孔体积２００ｌｔｌ。
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（３）培养细胞：将培养板移入Ｃ０２孵箱中，在３７０ｃ、５％Ｃ０２及饱和湿度条件下，培养３～５天。
（４’呈色：培养第３～５天后，每孔加入ＭＴＴ溶液（Ｓｔａｇ／ｍ１）２０掣ｌ，３７。Ｃ，继续孵育４ｈ。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。离一ｃ，Ｏ０００ｒｐｍ。５ｍ蛐，然后弃去孔内培养液。每孔加入１５叫ｌＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。
（５）比色：选择４９０ｒｉｍ波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
（九）ＴＵＮＥＬ单标免疫荧光及单标免疫组化
（１）以０．０１Ｍ的ＰＢＳ液ＱＨ７．螺洗培养孔中的盖玻片’５分钟Ｘ３次，然后用４％多聚甲醭固定１５分钟。
（２）０．０１Ｍ的ＰＢＳ液漂洗培养孔中的盖玻片ｊ分钟Ｘ３次
（３）将培养孔中的盖玻片转移到青霉素瓶塞上。
ｆ４）ｏ．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｒａｉｎ。
（５）０．３％Ｈ２０２／甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温，１０ｍｉｎ。
（６）０．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｍｉｎ。
∽１％ＢＳＡ／０．４％ＴｄｔｏｎＸ－－１００，４＂Ｃ，２ｒａｉｎ?
（８）Ｏ．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｒａｍ。
伪ＴＵＮ＇ＥＬ反应液，于湿盒内３７℃孵育６０ｍｉｎ。
（１０）０．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｍｉｎ。
（１１）荧光显微镜下观察，如做免疫芡光染色到此为止，免疫组化继续下面步骤。
（１２）Ｃｏｖｅｒｔｅｒ－ＰＯＤ，３７℃孵育３０ｍｉｎ。
（１∞０．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｒａｉｎ。
（１４）ＤＡＢ显色，在显微镜下观察染色深浅，至适当程度终止反应。
Ｏｓ）脱水、透明、ＤＰＸ封片。
（十）１１『ＮＥＩ，及Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光双标染色方法
（１）石蜡切片，片厚和ｍ。
（２）二甲苯脱蜡，系列乙醇入水。
ｆ３）置切片于盛有抗原修复液的容器中，微波炉中９２～９８℃持续８～１０ｍｉｎ。
（４）取出容器，室温冷却１０ｒａｉｎ。
（５）０．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｍｉｎ。
（６）０．３％Ｈ２０２／甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温，１０ｍｉｎ。
∽０．０１ＭＰＢＳ漂洗３次，每次２ｍｉｎ。
（８）Ｉ％ＢＳＡ／０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ－－１００，４＂Ｃ，２ｒａｉｎ。
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三、氯胺酮对神经干细胞增殖影响结果
１．克隆形成率计数结果
在胎鼠海马原代培养中克隆形成率约为ｏ．６～ｌ％之间，而次代克隆及随后的亚克隆中克隆形成率则明显升高，波动在１０～２０％之间，经传代２０代后的细胞仍具有克隆能力。氯胺酮与胎鼠海马原代培养的克隆形成率为ｏ．４％，次代培养及以后的亚克隆过程中则提高到７～１４％。单细胞克隆系的克隆形成率结果与此相类似。
２．ＭＴＴ法用于神经干细胞活性测定的最佳条件确定
用ＭＴＴ掺入法，通过测定ＯＤ４９０ｎｍ的吸收值，来计算待测样品的活性值。ＭＴＴ法是Ｍｏｓｍａｎｎ创立的一种简便、快速的比色方法，其后Ｔａｄａ和Ｇｒｅｅｎ等人又对该方法进行了改进。由于每种细胞株各具不同的生物特性，本实验针对大鼠神经干细胞，比较了培养时间、细胞浓度、ＭＴＴ浓度及ＭＴＴ保留时间等几个重要的实验条件，最后确定了最佳方案，使实验结果更为准确。
①神经干细胞的培养时间：取对数生长期的神经干细胞，每孔加入５×１０４细胞，分别加入０、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ的氯胺酮．并分别培养２４、４８、７２、９６、１２０ｈ，结果见图１。
图１不同培养时间对ＯＤ值的影响
Ｆｉｇ１ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｐｅｒｉｏｄｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇＯｉｌｔｈｅｌｕｎｏｔｍｔｏｆＭ＇ＩＴｆｏｒｍａｚａｎｐｒｏｄｕｃｅｄ
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