石蜡切片的甲苯胺蓝染色法
方法一
配方：甲苯胺蓝1g 溶于95%酒精100ml ，置60℃温箱中2h后降至室温。染液于室温下可保存3个月，若放于4℃冰箱则可保存半年左右，但该液的染色效果在早期为最佳，若染液存放时间较长，则染色偏淡，应适应延长染色时间。
1、脱蜡至蒸馏水。
2、根据切片厚度和组织的不同，浸染于甲苯胺蓝染色液20～30min。
3、蒸馏水或去离子水轻轻冲洗3～5min。
4、(可选)0.5%冰乙酸分化，直到细胞核和颗粒清晰可见。
5、快速95%和无水乙醇脱水。
6、二甲苯透明。
7、封固。
方法二
配方：甲苯胺蓝0.5g蒸馏水定容至100ml。冰醋酸液：冰醋酸0.5ml蒸馏水定容至100ml
1.组织切片常规脱蜡至水
2.入甲苯胺蓝液30min
3.稍水洗
4.入冰醋酸液分化，直到胞核和颗粒清晰。
5.稍水洗，用冷风吹干
6.二甲苯透明，中性树胶封固。
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
石蜡切片免疫荧光操作规程 试剂 1)二甲苯 2)PBS缓冲液 3)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 4)goat血清 5)一抗稀释液： 3%BSA in TBS，pH7.4 操作流程 1.脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 3）95%乙醇中浸泡5min； 4）70%乙醇中浸泡5min； 2.PBS洗两次各5min。 3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。 4.PBS洗5min。 5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。 ℃小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。 6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者371 7.PBS洗3次每次5min。 8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。） 9.PBS洗3次每次5min。 10. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染色10min。 11. PBS洗3次每次2 min。 12.封片： Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
石蜡切片（paraffin section）组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。 石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。 2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。 3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。 4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。 5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
对于石蜡切片： 1、烤片：60C 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中I脱蜡15分钟—二甲苯H脱蜡15分钟—无水乙醇 I 5分钟 —无水乙醇H 5分钟—90%乙醇I 5分钟—90%乙醇H 5分钟—70%乙醇5分钟 —蒸馏水5分钟—蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l 柠檬酸钠，pH6.0（柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中），上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷 缸中缓慢冷却至室温。 2.去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%HO2 （2ml H 202加入 18ml蒸馏水中，现配现用，避光），室温孵育10分钟，PBS洗3次, 每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3.封闭（Blocking） 加10%E常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4C封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意 样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4.一抗孵育（Primary antibody incubation） 参考- -抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PB）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗，4 C过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5.二抗孵育（Secondary antibody inucubation）
按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗， 立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小 时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6.蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观 察。 7.复染 用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS中洗5分钟X 3次，封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合) 显微镜观察，染色后为蓝色荧光。 多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。 0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方： NaHC03 3.7g Na2CO3 0.6g 双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。
石蜡切片免疫荧光染色 方法 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins)
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
石蜡切片免疫组织化学操作流程 一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例） 1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药 物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位； 2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑 突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意） 3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液 流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约 100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色； 换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。 4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域， 避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况） 5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组 织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分） 6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18 小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜 二、组织石蜡包埋 7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记， 自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片） 本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下： 自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min 8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用 （此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。μ皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 ±枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注
一、石蜡切片 1. 固定： 将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2.脱水： 为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3.透明： 常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4.浸蜡： 先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋： 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6.切片： 切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7.贴片与烤片： 一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。 8.切片脱蜡及水化： 干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9.染色： 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。 二、冰冻切片 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。 2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。 3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。 4）在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。 5）若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3.固定：
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin ' s 固定RT2h（6-8d tesis ）or RT 过夜（成年tesis ） PBS缓冲液洗三次，每次5min, 4 C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m,贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片 盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品 80% 乙醇15 min 95%乙醇15 min 100%乙醇15min 2 1/2 乙醇1/2 二甲苯15 min
二甲苯透明5-10 min 1/2 二甲苯1/2 石蜡30 min 石蜡（1） 石蜡（2） 石蜡（3）包埋 RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 二甲苯（1） 20 min 二甲苯（2） 20 min 100% 乙醇20min 95% 乙醇10 min 80% 乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在PBS 中浸泡5 min*2 %Trito nx RT 10 min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 佻胰酶RT 10min 如果是增强型DAB 只要1min 即可RT 60min 3%H2O ) Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS) DAB 倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 200 ( GAM1 100)，RT1h 切片在PBS 中浸泡5 min*3 显色5-10min ( 50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升 在PBS 中浸泡5 min*3
在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等. 石蜡切片法 石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法. 石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片. 取材 用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定. 取材的注意事项如下: (1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料. (2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm 小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显. (4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低. (二)固定 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签. 良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色. 常用固定液: 简单固定液以一种化学药品配制的固定液. ⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇. ⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%. ⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温