食品生物化学实验指导
高建华曹劲松宁正祥编
华南理工大学
二O O六年三月
目录
第一部分普通试验
实验一果胶的制备和特性测定------------------------------------------------------------------- 1
一、从果皮中提取果胶----------------------------------------------------------------------------- 1
二、果酱的制备-------------------------------------------------------------------------------------- 1
实验二卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验--------------------------------------------------- 2
实验三蛋白质的盐析透析----------------------------------------------------------------------- 5
一、蛋白质的盐析--------------------------------------------------------------------------------- 5
二、蛋白质的透析--------------------------------------------------------------------------------- 6
实验四氨基酸纸电泳分离鉴定------------------------------------------------------------------- 7
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响------------------------------------ 9
一、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响---------------------------------------------- 10
二、温度和pH值对а-液化淀粉酶活力的影响-------------------------------------------- 10 实验六果蔬中过氧化物酶活力测定------------------------------------------------------------- 12 实验七酶催化转氨基反应的纸层析鉴定----------------------------------------------------- 14
1
实验八焦糖的制备极其性质----------------------------------------------------------------------17实验九酶促褐变的抑制及叶绿素的性质------------------------------------------------------- 19
第二部分综合设计性实验：一、酵母蔗糖酶的分离纯化
实验一活性干酵母蔗糖酶的提取-------------------------------------------------------------- 23 实验二蔗糖酶的分级沉淀提取-----------------------------------------------------------------25实验三蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐----------------------------------------------------- 28 实验四离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶----------------------------------------------------- 30 实验五蔗糖酶的交联葡聚糖凝胶色谱分离纯化-------------------------------------------- 35 实验六聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度------------------------------------------- 38 实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量-------------------------------------- 43 实验八蔗糖酶的酶活特性研究------------------------------------------------------------------
辅助性实验
45
实验一蔗糖酶活力测定-------------------------------------------------------------------------- 46 实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量------------------------------------------------------------- 48 实验三考马斯亮蓝染料比色法测定蛋白质含量---------------------------------------------- 50 实验四紫外吸收法测定蛋白质浓度------------------------------------------------------------- 51
附表：调整硫酸铵溶液饱和度计算表
附表1 0℃下由S1提高到S2时每100mL样品加固体硫酸铵的克数-------------------- 53
附表2 室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数-------------------------------
二、天然活性物质植物黄酮的提取及应用
实验一藤茶植物黄酮的提取------------------------------------------------------------------- 实验二重结晶法纯化黄酮提取物-------------------------------------------------------------- 54
55
56
2
实验三植物黄酮重结晶晶体形态观察---------------------------------------------------------- 实验四紫外分光光度法测定总黄酮含量------------------------------------------------------- 实验五高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量----------------------------------- 实验六植物黄酮稳定性试验-------------------------------------------------------------------- 实验七植物黄酮在油脂中的抗氧化活性测定----------------------------------------------- 辅助性实验：
实验一油脂过氧化物值的测定---------------------------------------------------------------- 实验二油脂酸价的测定--------------------------------------------------------------------------- 58 60 62
66
67
70 72
实验一果胶的制备和特性测定
一、果胶的制备
（一）目的要求了解果胶的基本结构、果胶的分类及提取原理和方法。
（二）实验原理
果胶物质可分为三类，原果胶、果胶及果胶酸，其基本结构是不同程度甲酯化和被钠、钾离子中和的α-半乳糖醛酸以1,4-苷键形成的聚合物，分子量高达200000左右。
原果胶不溶于水，主要存在于出生细胞壁中，在一定温度经稀酸长时加热条件下，果皮层细胞壁的原果胶发生水解，由于结构甲酯化程度降低及部分苷键断裂而转变成水溶性果胶。
水溶性果胶经脱水干制有利于保藏和运输，果胶干制有直接干燥法和沉淀脱水两种方法。直接干燥通常是把浓缩的果胶水溶液通过喷雾干燥获得。沉淀脱水则是根据果胶不溶于高浓度乙醇特性，采用乙醇沉淀提取。乙醇沉淀提取果胶，控制酒精浓度极为关键，浓度太高或太低都是不利的，浓度过高等于水分减少，水溶性的非胶物质没有机会溶解在水中，会随果胶一起沉淀出来，使果胶纯度降低；反之如果乙醇浓度太低，水分含量过高，果胶沉淀不完全，因此用乙醇沉淀提取果胶，乙醇用量最好为55%—60%左右。果胶溶液中存在有微量电解质时，加入乙醇果胶将以海绵絮状沉淀析出，反之不易聚集析出。
柑橘类果皮是提取果胶的优良原料，新鲜果皮含果胶约 1.5%—3%，干果皮则含9%-18%，柠檬皮果胶含量更多，新鲜果皮内含2.5%—5.5%，干果皮内含量高达30%—40%。
（三）试剂及材料
1、0.5%HCl溶液量取12mL浓盐酸，加水稀释至1000mL。
2、1mol/LNaOH溶液称取40gNaOH，用水溶解并稀释至1000mL。
3、95%乙醇。
3
4、柑桔皮和柚子皮。
（四）操作方法
1、称取50—100g果皮，分切，把果皮放入沸水中煮沸3分钟，而后用清水漂洗，以除去色素、苦味等非胶物质，并把多余水分除去。
2、把上述处理后的果皮放入600mL烧杯中，加入0.5%HCl 200—300 mL，一般以浸没果皮为度，在搅拌条件下保持微沸提取20min。
3、趁热用4层纱布过滤，用少量50℃的热水分次将滤渣洗涤2—3次，合并滤液，冷却至室温。
4、用1mol/LNaOH调整滤液的PH值至3—4。
5、缓缓向提取液加入95%乙醇约300 mL，并略加搅拌，待果胶呈棉絮状沉淀后，用四层纱布过滤，压干除去大量水分，滤渣则为粗制的果胶产品。
二、果酱的制备
（一）目的要求了解果胶的性质和用途
（二）实验原理
果胶是亲水性多糖，在PH=3-3.5、蔗糖含量为65%—70%、0.7%—1%的果胶水溶液经煮沸冷却后，可形成具有一定强度的三维网状结构凝胶，其主要作用力是分子间的氢键及静电引力。在凝胶过程中，溶液中的水含量对凝胶影响很大，过量的水阻碍果胶形成凝胶。果胶水化后和水分子形成稳定的溶胶，由于氢键的作用水分子被果胶紧紧地结合起来不易分离，向果胶溶液中添加糖类，其目的在于脱水，糖溶解时形成夺取水分的势能，促使果胶粒周围的水化层发生变化，使原来果胶表面吸附水减少，胶粒与胶粒易于结合成为链状胶束，促进果胶形成凝胶。在果胶-糖溶液分散体系内添加一定量的酸，可起到中和果胶所带的负电荷，减少了果胶分子变成阴离子的作用，促进它聚结成网状结构，而形成凝胶。果酱、果冻等食品就是利用这些特性生产的。
（三）试剂及材料
白砂糖、柠檬酸、柠檬酸钠、自制果胶。
（四）操作方法
1、配方
蔗糖70g、柠檬酸0.5 g、柠檬酸钠0.4 g、水20 g、自制果胶适量。
2、将柠檬酸、柠檬酸钠溶解于20 g水中，用蔗糖把果胶充分拌匀，加入柠檬酸水溶液。
3、在不断搅拌下，小火加热至沸，保温熬煮约10—15min，待水分含量为一定时，以
溶胶糖液以挂珠为度，冷却、观察、描述形成凝胶的体态。
三、实验结果讨论分析。
四、思考题
1、提取果胶前，用沸水处理果皮的目的是什么？
2、沉淀提取果胶前，为何需调整果胶溶液PH值？
3、若提取的果胶溶液含水量过大，采用何种方法浓缩果胶提取液，以减少乙醇用量？
4、提取果胶后，采用何种方法回收乙醇？正确绘制回收乙醇的实验装置图。
5、用什么简易方法测定回收乙醇的浓度？
4
5
6、果胶形成凝胶所需的条件是什么？
实验二、卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验
一、目的要求 学习提取卵磷脂的方法，了解卵磷脂的乳化特性性质。 二、实验原理
磷脂是分子中含磷酸的复合脂，分为磷酸甘油脂和鞘氨醇磷脂类，其醇类物质分别为甘 油和鞘氨醇。磷脂酰胆碱属磷酸甘油脂，俗名为卵磷脂，在生物体内以及食品工业应用中起着重要的作用。
卵磷脂是一种在动、植物中分布及广的磷脂，如植物的种子、动物的卵、脑及神经组织 均含有之，其中大豆中含量约为2.0%、卵黄中含量高达8%—10%、。卵磷脂在细胞中以游离态或与蛋白质结合成不稳定的化合物存在，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，不溶于丙酮。本实验采用乙醇提取蛋黄中的卵磷脂。 纯卵磷脂为白色的蜡状物，与空气接触后，因结构含不饱和脂肪酸被氧化后而呈黄色至黄棕色，粗制品中色素的存在可使之呈淡黄色。卵磷脂中的胆碱基在碱性条件下可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥味，利用此性质可鉴别卵磷脂。
在生物体中的作用是保持细胞膜的通透性，控制动物体内脂肝代谢，防止脂肪肝的形成。在食品工业中广泛充当乳化剂、抗氧化剂和营养添加剂。
使互不相溶的两种液体中的一种呈微滴状分散在另一种液体中的作用称为乳化剂。这两种不同的液体称为“相”，在体系中量大的称为连续相，量小的为分散相，能使互不相溶的两相中的一相分散在另一相中的物质称为乳化剂。由卵磷脂的分子结构可知：
C H 2O
C O
R 1
C H O
O R 2
C H 2
O P O O H
O
C H 2C H 2
N O H
C H
33
卵磷脂分子中的R 1脂肪酸为硬脂酸或软脂酸，R 2脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等不饱和脂肪酸。脂肪酸残基端具有憎水性，其胆碱残基端具亲水性，因此是一种天然的乳化剂。在乳化过程中，当少量的油与乳化剂一起在大量水中用高速搅拌混合机混合，油滴将以微滴状分散在水相中，在细滴的表面上乳化剂以亲油的非极性端相对，而以其亲水的极性端伸向水中。由于极性相斥，体系中微滴之间的斥力比相互间的引力要大，因而形成稳定的乳浊液。
乳浊液的稳定性与系统中各组分间的比例、乳化剂种类及其用量、乳化的机械条件等密
切相关。食品工业中可从大豆油精练过程中获得廉价卵磷脂。
三、试剂及材料
1、95%乙醇
2、10%NaOH溶液称取10g氢氧化钠，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
3、鸡蛋
4、花生油
四、仪器设备
1、电热恒温水浴锅
2、磁力搅拌器
3、高速电动搅拌机
4、摄像显微系统（由电脑、摄像头、显微镜、摄像控制软件组成）
五、操作方法
（一）卵磷脂的提取
选新鲜鸡蛋一个，轻轻在鸡蛋两头击破一小孔，让蛋清从小孔流出，破壳取出蛋黄置小烧杯内，捣烂，搅拌下加入50℃ 95%乙醇60 mL，，保温提取5min，冷却过滤，将滤液置于瓷蒸发皿，水浴蒸干，残留物即为卵磷脂。
（二）鉴定卵磷脂
1、三甲胺试验：取少量本实验提取的卵磷脂于试管内，加入2mL 10%NaOH ,混匀，水浴加热，嗅之是否产生鱼腥味。
2、丙酮溶解试验：加入约5m l丙酮于装有卵磷脂提取物的瓷蒸发皿，不断用玻棒搅拌卵磷脂观察其在丙酮中的溶解情况。同时也是提纯卵磷脂的过程。
（三）乳化试验：
1、乳化液制备：按下表选择乳化液制备方法。
2、利用显微摄像系统观察油脂在水中的乳化效果并对乳化液与非乳化液进行摄像，根据油脂在水相中的分散情况，评价油脂乳化试验的效果。
乳化效果摄像操作步骤：
（1）水平放置显微镜，开启并调节照明光源，装上合适的目、旋上适当的低倍物镜。
（2）用点滴管取少量乳化液滴在载玻片上，小心把盛有样品的载玻片放上光学显微镜的物台，用标本固定夹固定。移动标本移动器，使观察的部位对准聚光器上面的透镜中心。
（3）上下移动显微镜的粗调选钮，使物镜下至距离标本片最低的位置，但不能接触载玻片以免损坏镜头或标本。
（4）用眼睛在目镜上观察，两手向上慢慢旋动粗调使显微镜上升至视野中出现较清晰的被检物。
6
7
（5）移动载片标本，寻找具有代表性的被检物点放在视野中心，反复调整微调旋钮使被检物至最清晰为止。
（6
标移至
测的图象在视屏中清晰为止
对摄影像片进行保
（7DN-2菜单→ 键→ 从测定物的起点拉动鼠标把测量连线连至测定物终点，从屏幕μm ）→ 键，将测量值标注在图片中→保存测量图片结果。
（8）打印分析摄像图谱。 3、乳化结果记录
乳化液处理静置15min 后，观察比较各乳化实验结果并记录。
六、实验结果讨论分析 七、思考题
1、 向卵磷脂粗品添加丙酮的作用是什么？可去除何种杂质？
2、乳化过程要形成稳定的乳浊液，可采用什么仪器方法实现？
3、使用生物显微镜的操作要点是什么？
实验三、蛋白质的盐析透析
一、蛋白质盐析
（一）目的要求 了解蛋白质的沉淀作用，加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。
8
（二）实验原理
水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。
向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便从溶液中沉淀析出，这种沉淀作用称为蛋白质盐析。其过程是一个可逆过程，当除去引起蛋白质沉淀因素后，被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中，其天然性质不发生变化。
用不同浓度的盐可将不同种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程，称为蛋白质的分级盐析。例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取，饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。因此，盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。 （三）试剂及材料
1、10%蛋清溶液 选新鲜鸡蛋，轻轻在蛋壳上击破一小孔，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl 溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。
2、饱和硫酸铵溶液 称取76.6g 硫酸铵溶于100mL 25℃ 蒸馏水中。
3、固体硫酸铵。 （四）操作方法
1、取两支试管，分别加入10%蛋清溶液5 mL ，饱和硫酸铵5 mL ，静置5min ，观察有否沉淀物产生，沉淀物为何物？
2、取其一试管，用点滴管弃去上清夜，加水至沉淀物，观察沉淀是否会再溶解，说明沉淀反应是否可逆。
3、用滤纸把另一试管的沉淀混合物过滤，向滤液中添加固体硫酸铵至溶液饱和，注意观察溶液有否蛋白质沉淀产生，此沉淀又为何物？
注意：把溶液中硫酸铵固体沉淀与蛋白质沉淀区别开来。 二、蛋白质的透析
（一）目的要求 学习透析的基本原理和方法
（二）实验原理
透析是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种手段。透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，不断更换透析用水即可将蛋白质与小分子物质完全分开。蛋白质和酶的提取过程，常用此法使之脱盐。
如果透析时间过长，可采用低温条件下进行，以防止微生物滋长、样品变质或降解。 透析袋材料通常有火棉胶、商品化透析袋等。 利用硝酸银和双缩脲反应的透析结果进行检验：
C
l
A g
A gC
l
来源于透析用
水
加入试
剂
蛋白质C uS O
4O H
有色复合物N a2S O4
二肽以上紫红
色
（三）试剂及材料
1、氯化钠蛋清溶液取一个鸡蛋清蛋白，加入30%NaCl溶液100mL、250 mL蒸馏水混合均匀后，四层纱布过滤。
2、1%AgNO3称取1g AgNO3 ,溶解于100 mL水中，贮存棕色瓶保存。
3、1%CuSO4称取1g CuSO4，用水溶解并稀释至100mL。
4、10%NaOH 称取10g NaOH，用水溶解并稀释至100mL。
5、5%火棉胶分析纯。
（四）操作方法
1、透析袋的制备直接把5%火棉胶试剂约10 mL倒入洁净、干燥的100mL三角锥瓶底部，然后徐徐转动三角瓶，使火棉胶由底部至瓶口均匀分布于瓶内壁，同时弃去多余的火棉胶，将三角瓶倒置，自然风干10min。小心剥离三角瓶口薄胶，引自来水沿瓶内壁与袋膜间流入，使透析袋与瓶壁逐渐分离，取出透析袋，同时检查透析袋的完好性。
2、透析把10mL氯化钠蛋清液注入透析袋内，扎紧透析袋顶部，系于一横放在盛有蒸馏水的烧杯的玻璃棒上，调节水位使透析袋完全浸没蒸馏水中。
3、透析情况检验
（1）无机盐透析检验：透析10 min后，自烧杯中取透析用水2 mL于试管中，用1%AgNO3检验氯离子是否能被透析出。
（2）蛋白质透析检验：自烧杯中另取透析用水2 mL于试管中，加入2 mL 10%NaOH，摇匀，再加1%CuSO4数滴，进行双缩脲反应，检验蛋白质是否被透析出。
（3）不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析进行，经数小时侯烧杯中的水不再有氯离子检出为止，则表明透析完成。因为蛋清溶液中的清蛋白不溶于纯水，此时可观察到透析袋中有蛋白沉淀出现。
三、实验结果讨论分析。
四、思考题
1、制作透析袋时能否用采用热风干燥加速其成膜？为什么？
2、高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么？
3、盐析与透析在蛋白质、生物酶提取纯化中的意义。
4、蛋白质可逆沉淀反应与不可逆沉淀反应的区别在哪里？举例说明。
实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定
9
一、目的要求通过电泳分离氨基酸，了解氨基酸的性质以及电泳分离技术的应用。
二、实验原理
带电粒子（胶体或分子）在直流电场作用下，能向异性电极迁移，这种现象称为电泳。带电粒子之所以能在电场的作用下迁移，是因为在一定PH环境条件下，不同的物质所带的电荷种类、数量不同，在一定的电场作用下，就以不同的速度向不同的电极方向移动，从而达到分离混合物和鉴定未知物的目的。带电粒子在电场内移动的方向及电泳速度，除取决于粒子的分子量和电荷量外，还与电场强度、溶液PH、缓冲溶液的离子强度以及电渗等因素有关。
电泳是离子在电场中通过介质的移动，按支持介质的不同可分为：（1）纸电泳：以滤纸、玻璃纤维等为支持物。（2）凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等为支持物。（3）薄膜电泳：醋酸纤维素为支持物。氨基酸分离选用滤纸为支持介质进行电泳。
氨基酸在水溶液中通常解离成两性离子，它在酸性和碱性介质中的变化可用下式表示：
C H C O O R
N H
3O H
R C H C O O H
N H3
R C H C O
N H2
在酸性介质中，氨基酸主要以阳离子状态存在，电泳时向阴极移动；在碱性介质中，氨基酸主要以阴离子状态存在，电泳时向阳极移动，当介质的PH值为氨基酸的等电点时，氨基酸以中性偶极离子存在，电泳时不向阴阳电极移动。
实验在pH=5.9的缓冲溶液中进行，一张被PH5.9缓冲溶液所湿润的滤纸的两端加上直流电压，在电场的作用下，加在滤纸支持介质的各种氨基酸样品，由于所带电荷性质不同，分别向正负极方向移动，电泳体系缓冲溶液偏离氨基酸的等电点越远，氨基酸所带的电荷越多，离子移动的速度也就越快，因各氨基酸迁移的速度均不相同，从而达到分离的目的。
三、试剂及材料
1、PH5.9 0.025mol/L 邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲溶液称取邻苯二甲酸氢钾
5.10g，加水溶液至950mL ,用氢氧化钠调整PH=5.9，补水至1000mL 。
2、氨基酸溶液0.5%亮氨酸、0.5%赖氨酸、0.5%天门冬氨酸。
3、氨基酸混合液。
4、氨基酸显色液0.1%茚三酮丙酮溶液。
四、仪器设备中压电泳仪、电泳槽。
五、操作方法
1、电泳滤纸的裁剪取层析滤纸裁成250×25mm 的滤纸条，用铅笔在滤纸的中心位置
标记样品电泳时的起始位置，在滤纸的两端标上正负极符号。如下图所示。
（+）×（-）
2、向电泳槽添加适量的缓冲溶液，要求两槽缓冲液液面保持同一水平。
10
3、接上电泳仪主机，中压条件下预热10min。关闭电泳仪电源。
4、用PH5.9缓冲液湿润滤纸条，然后用电吹风把多余的缓冲液吹干，把滤纸条按正负极方向横架于电泳槽的支位上，滤纸面尽量绷直，滤纸两端下垂紧贴在定位板，末端浸入缓冲液约10mm 深。注意滤纸条不应接触电极，两滤纸间应保持一定间距。
5、用微量进样器吸取氨基酸样品4μl ，一次把样品点在滤纸的起始点（×）上，然后正确连接主机与电泳槽的正负极连线，盖上电泳槽盖子。
6、开启主机电源，调整电泳电压至300V，记录电泳初始电压。注意电泳过程电流的变化，如电泳电流接近仪器的最大额定工作电流时，可把电压略调低使电流不超过20mA。
7、30min后电泳结束，记录电泳终止电压，关闭电源，迅速把滤纸条从电泳槽中取出，用电吹风挥干其缓冲溶液。
8、用喷雾器对滤纸均匀喷洒茚三酮显色剂，立即用热风吹干，在滤纸上可显示清晰的氨基酸显色斑点。
标记电泳图谱氨基酸斑点位置，分析判断为何种氨基酸。
注：在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的羧基而带负电荷，使与纸相接触的水溶液带正电荷，使液体向负极移动。此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。因此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快；若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢，所以，中性物质有时在电场中也可能向负极移动。
六、实验结果讨论分析
要求绘出电泳谱图，分析各氨基酸向正负极移动的原理。
七、思考题
1、实验中若电泳缓冲液的PH改变为2.9，电泳图谱各氨基酸斑点的位置将发生什么变
化？
2、蛋白质A的PI=5.5，蛋白质B的PI=6.9，电泳介质PH=7.0，电泳时各蛋白向哪个
电极方向迁移？为什么？
3、记录电泳过程电参数的变化有何意义？
4、实验中哪些步骤须除去滤纸多余的缓冲液或须对滤纸进行热风干燥，其目的是什
么？
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响
一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化
11
活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。
三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
（一）试剂及材料
1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。
2、0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL 沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。
3、1%NaCl溶液称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL 。
4、1%CuSO4溶液称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。
5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。吸取2mL 上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
12
用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。
四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响
（一）试剂与材料
1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g（预先在105℃烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。
2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液
（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。
3、供试酶液的制备称取固体α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。
4、标准比色液
甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g，溶解并定容至500mL。
乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。
使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。
5、标准稀碘液。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。
2、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响
取4根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。
加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与
13
14
标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。 3、不同PH 值对α-液化淀粉酶活力的影响
取5根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。
其它操作与温度对酶活力影响实验相同。 五、结果计算和讨论
淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g 酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。
酶活力单位(U/g)=
n t
??
??5
.0102.02060
式中：20——可溶性淀粉的用量（mL ）； t ——酶解反应完成所需的时间（min ）；
0.5——测定时稀释酶液用量（mL ）； 0.02——可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL ）； n ——酶制剂稀释倍数
1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录
2、不同pH 值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录
分别以PH 值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH 值—酶活力单位、温度—酶活力单位图。讨论分析实验结果。 六、思考题
1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？
2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？
3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？
4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？
5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？
实验六、果蔬中过氧化物酶活力测定
一、目的要求了解过氧化物酶的生物氧化作用，学习过氧化物酶的测定方法。
二、实验原理
过氧化物酶属氧化还原酶，能催化底物过氧化氢对某些物质的氧化。反应中的供氢体可为各种多元酚（对–甲酚、愈创木酚、间苯二酚）或芳香族胺（苯胺、联苯胺、邻苯二胺）以及NADH2 NADFH2。其作用机理可分为以下几步：
第一步形成酶–底物复合物Ⅰ
过氧化物酶 + H2O2→酶?复合物Ⅰ
第二步酶?复合物Ⅰ转变成褐色的酶?复合物Ⅱ
酶?复合物Ⅰ + AH →酶?复合物Ⅱ + A
第三步酶?复合物Ⅱ被还原，释放酶
酶?复合物Ⅱ + AH →过氧化物酶 + A + H2O2
AH 表示还原形供氢体。
在一定条件下，酶?复合物Ⅱ可生成产物（P）同时释放出酶，亦可与过量的过氧化氢形成稳定的复合物Ⅲ：
酶?复合物Ⅱ + H2O2 →酶?复合物Ⅲ
本实验以愈创木酚为供氢体，H2O2为氢的受体，愈创木酚在过氧化物酶催化作用下被氧化后，生成褐色的有色产物，根据酶活力大小与有色产物颜色的深浅成正比，在波长下测定其吸光值，可求出过氧化物酶的活力。
15
O C H3
H
O H4H2O2
O
O
O C H3
C H3C H
3
O C H3
8H2O
愈创木酚四邻甲氧基联酚
过氧化物酶
O
O
以每分钟吸光度的变化值表示过氧化物酶活力大小，即以A470/min.g 鲜重计算。
测定过氧化物的实际意义在于，过氧化物广泛存在于植物组织中，在果蔬加工过程中的
主要作用包括两个方面：（1）过氧化物酶氧化作用与果蔬原料，特别是非酸性蔬菜在保藏期产生不良风味有关；（2）过氧化物酶属最耐热的酶类，在果蔬加工中果蔬中过氧化物酶活力大小常被用作衡量果蔬热处理灭酶是否充分的指标，因为当果蔬中的过氧化物酶在热烫中失活时，表明其它酶以活性形式存在的可能性以达到最小。
三、试剂及材料
1、30%过氧化氢。
2、愈创木酚
3、20 mmol/L磷酸二氢钾溶液称取2.72g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
4、100 mmol/L磷酸PH6.0缓冲溶液吸取6.3 mL磷酸加水至100 mL，用氢氧化钠调整至所需的PH。
5、反应混合液取25 mL磷酸缓冲溶液于烧杯中，加入愈创木酚140μl，于磁力搅拌器中搅拌至愈创木酚溶解，加入30%过氧化氢95μl，混匀置冰箱保存备用。
6、新鲜白菜梗。
四、仪器设备可见光分光光度计。
五、操作方法
1、酶液提取取白菜梗10g，加入磷酸盐溶液30mL，置于研钵中充分研磨，用磷酸盐溶液定容至100 mL，过滤备用。
2、取两根试管，其中一根试管加入反应混合液3.0 mL，磷酸盐溶液1.0 mL，作为光度计调零对照；另一试管加入反应混合液3.0 mL，酶液0.1 mL，补充磷酸盐溶液至总体积为4.0 mL，迅速混匀。1分钟后使用1cm玻璃比色皿，在470波长条件下测定其吸光值，连续测定5次，间隔时间均为1分钟。记录测试结果。
16
17
3、求吸光值y = ΔA 470 t + b 回归方程。
4、温度对过氧化物酶活力的影响实验 分别取10g 白菜梗置于70℃、80℃、90℃、100℃ 温度条件下热烫处理3min ，再按1操作方法置备酶液。按上述方法测定各吸光值，比较热处理前后酶活力大小。 六、结果计算与讨论
过氧化物酶活力
=ΔA 470?100 / (m ?V 1)
式中 V 1—测定时吸取供试酶液的体积(mL) m —提酶样品重量(g) 100—酶液稀释总体积(mL) 七、思考题
1、 过氧化物酶的作用机制是什么？测定其酶活力对食品果蔬加工有何实际意义？
2、 实验操作要点是什么？
实验七 酶催化转氨基反应的纸层析鉴定
一、目的要求 了解生物体的转氨基作用，学习应用纸层析法鉴定氨基转移的方法。 二、实验原理
催化转氨基反应的酶称为转氨酶，广泛分布于肌体的各器官及组织中，氨基酸分子的氨基转移到α-酮酸分子上的反应称为转氨基作用，它是氨基酸脱去氨基的一种重要方式，是氨基酸代谢的重要反应之一。在转氨基生物反应中，α-氨基酸的氨基通过酶促反应，转移到α-酮酸的酮基位置上，生成与原来的α-酮酸相应的α-氨基酸，原来的α-氨基酸转变成相应的α-酮酸。例如谷丙转氨酶可催化以下反应：
C O O H
C H C H 3
H 2
N
C O O H
C
O
C H 2C H 2C O O
H
C O O H
C
O
C H 2
C O O H
C H 2C H 2C H C O O H
H 2N
丙酮酸
丙氨酸
a 酮戊二酸
谷氨酸L L
新生成的谷氨酸可以与标准氨基酸同时在滤纸上通过层析被检出。
三、试剂
1、0.01mol/L pH 7.4磷酸缓冲溶液吸取0.68mL 磷酸加水至95 mL，用酸度计，用氢氧化钠溶液调整pH至7.4，再补水至100 mL。
2、0. 1mol/L丙氨酸溶液称取L-丙氨酸0.891g，用少量0.01mol/L pH 7.4磷酸缓冲溶液溶解，用氢氧化钠溶液调整pH至7.4，再用磷酸缓冲溶液定容至100 mL。
3、0. 1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸1.47g，如上法配制成100 mL。
4、0. 1mol/Lа-酮戊二酸称取а-酮戊二酸1.46g，如上法配制成100 mL。
5、层析展开剂取无色结晶酚，连瓶一起放入约60℃水浴中溶化。按苯酚液：蒸馏水为1:1的比例，移入分液漏斗剧烈震动后，在暗处静置过夜，待混合液分层后，分离下层清夜，贮存棕色瓶中保存。
6、0.1%茚三酮称取0.1g茚三酮溶解于100mL丙酮。
四、操作方法
1、酶液的制备称取新鲜鸡肝10g，加20mL磷酸缓冲液，用组织捣碎机捣碎成糊状备用。
然后把对照管与测定管一起同时放入37℃恒温水浴锅中，保温酶促反应50min,反应中摇动试管数次。反应结束迅速将试管放入沸水中加热10 min终止酶促反应。冷却，分别将试管的反应液过滤到洁净干燥试管中以备层析用。
3、层析取Φ12.5新华定性滤纸一张，定位圆心后，做一直径为2cm的圆，再作二条互相垂直交点通过圆心的直线，两直线与圆周的交点分别作为测定管样品、对照管样品、及丙氨酸、谷氨酸进行层析的基准始点。如图1所示。
用毛细管分别吸取对照管上清液5μl，测定管上清液5μl，丙氨酸1μl，谷氨酸1μl，少量多次（借助电吹风吹干）把样品全部点在滤纸相应的位置上，尽量控制点样斑点的直径为2-3mm，不能刮伤滤纸。
在滤纸的圆心上做一直径为3-4 mm的小孔，另取一张小纸将其下端剪成须状，卷成“灯芯”，插入中心小孔，尽可能使“灯芯”不突出纸面，然后将该层析圆滤纸平放在盛有层析展开剂的培养皿上，纸芯下端须状部分浸入溶液中，把一个大小合适的培养皿罩在层析滤纸上方，如图2所示。
待层析溶剂到达培养皿边缘约0.5—1cm处时，取出层析滤纸，用镊子弃除纸芯，用铅笔在滤纸上标记溶剂前沿，在通风橱用电吹风挥干苯酚溶剂。
用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮丙酮溶液，然后热风吹干，即可看到滤纸上几个
18
19
紫红色氨基酸斑点，计算各斑点层析展开的比移值Rf ，根据Rf 值定性分析转氨基反应实验结果。
图1 定位层析滤纸 图2 层析装置示意图
五、根据层析图谱结果，进行转氨基反应分析。 六、思考题
1、转氨基反应的实验机理是什么？实验中进行对照管试验的目的是什么？
2、如何根据实验结果分析转氨基反应是否发生？
3、要作好纸层析实验的操作要点是什么？
实验八 焦糖的制备极其性质
一、目的要求 通过实验了解非酶褐变反应中的羰氨反应和焦糖化反应的作用机制，以及焦糖的性质和用途。 二、实验原理
焦糖色又称酱色，为一种浓红褐色的胶体物质，溶于水，水溶液呈红褐色，透明无浑浊或沉淀，具有特殊的焦糖风味，产品有液体和固体两种。是食品工业上用量最大、最广泛的食品着色剂之一，常用于调味品、罐头、糖果饼干及饮料等方面的着色。生产酱色的主要原料为淀粉糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜等。
焦糖色反应主要有两个途径：一是羰氨反应，又称美拉德反应（Maillard reaction ），是指糖（含羰基化合物）与氮（含氨基）化合物共热所引起的反应。反应中褐变产色机理主要是羰氨缩合反应；分子重排、降解、脱水；反应体系中的中间产物发生醇醛缩合、生成的褐红色素随机缩合；最终形成结构复杂的高分子类黑色素三个阶段。二是焦糖化反应，是指
糖类在没有含氨基化合物存在的情况下，加热至熔点以上，生成深红褐色色素物质的反应。
20
在此反应中，糖类物质经一系列脱水、降解、分子重排及环构化作用、分子间缩聚等，最后生成大分子量的深红褐色物质
食品加工与贮存过程中，常发生由于美拉德反应所形成的色泽：如酿造酱油生产过程色泽的形成、长时贮存的酿造甜糯米酒、肉干、鱼干、脱水蔬菜色泽的褐变等。 焦糖色色率用EBC 单位表示。根据欧洲啤酒酿造学会（Europern Brewery Couvention ）规定：用0.1%焦糖色（标准色），使用1cm 比色皿，用可见光分光光度计于610nm 吸光度为0.076时，相当于20000EBC 单位。
焦糖色具有等电点，其等电点随不同的制备条件而异，当把焦糖色添加到不同性质的食品时，由于介质的酸碱度不同而导致液体出现絮凝、浑浊等现象时有发生。本实验通过把焦糖色添加到不同性质的介质溶液中，通过色率的检测比较，了解焦糖色的性质。 三、试剂及材料
1、 蔗糖、葡萄糖
2、5% 甘氨酸：称取10g 甘氨酸。加水溶液至100mL 。
4、12 % 醋酸溶液：量取冰醋酸12.0mL ，加水稀释至100mL 。
5、80%乙醇。
四、仪器设备 可见光分光光度计。
五、操作方法 （一）焦糖制备
1、称取蔗糖20.0g 放入瓷蒸发皿中，加水1 mL ，使用500W 电炉，加垫石棉网，搅拌下缓慢加热糖液至170℃左右关闭电炉，利用电炉的余热使料物温度继续上升，在190℃—195℃温度下保温10min （若温度下降则重新开启电炉），观察糖液颜色的变化。然后在加热的条件下，把约30 mL 的热水分多次慢慢加入焦糖液中，不断搅拌使之溶解（加水速度不宜过快，以免焦糖液结成硬块），冷却，加水定容至200 mL ，可制得含10%的焦糖稀释液，过滤，编号为Ⅰ号。
2、称取葡萄糖20.0g 放入瓷蒸发皿中，加水2 mL ，搅拌下缓慢加热糖液至125℃左右关闭电炉，待糖液温度上升至140℃时，小心加入1 mL 5%甘氨酸溶液，然后继续搅拌加热至155℃时，关闭电炉。借助电炉在155℃—165℃条件下保温10min 。按上述方法加热溶解，加水定容至200mL 。可制得含10%的焦糖稀释液，过滤，编号为Ⅱ号。 （二）焦糖色率（EBC 单位）测定
1、用吸管分别吸取Ⅰ、Ⅱ号焦糖色1.0mL ，分别移入100mL 容量瓶，加水稀释至刻度，配成0.1%样品稀释液，编号为Ⅲ、Ⅳ号。
2、用分光光度计，以蒸馏水调零，用1cm 比色皿，分别测定610nm 波长处吸光值。
3、结果计算
X=
076
.020000
610 nm A
式中 X —焦糖色率（EBC 单位）；
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验课教学大纲 课程编码： 学时： 学分： 可成熟型：独立设课 开课单位：生命科学学院 先修课程：动物学、植物学、无机及分析化学、有机化学等 一、实验性质 生物化学专业实验是配合生物化学理论教学而设置的一门基础课程，分为基础实验、综合实验与创新实验。实验按照一学期进行设置，主要实验设置为生化基础实验和部分创新、综合实验。基础实验可使学生更好地掌握基本理论和基本实验技术，一般实验在学时内完成；综合实验要求学生运用所学知识解决实际问题，培养学生分析问题解决问题的能力；创新实验由学生自己动手查阅资料，拟定具体实验方案，提倡学生多思多问，有利于学生创新意识的培养，加强了收集信息、分析问题解决问题的能力。实验室全天开放。 二、实验教学目的和要求 生物化学专业实验是配合生物化学理论教学而设置的一门基础课程，通过实验课的教学，力求使学生能够对生物化学的基本理论和概念有更加深刻的认识，激发学生对探索生物化学规律的浓厚兴趣。更为重要的是，在实验过程中培养学生观察问题、分析问题和解决问题的能力，锻炼学生的实际操作能力。 三、实验项目名称和学时分配
四、实验项目具体内容 生物化学实验技术 实验项目一：皂化价的测定 实验目的：使用酸碱滴定法通过脂肪皂化价来推断分子量。 主要仪器：电子天平、水浴锅、冷凝管、酸碱滴定管。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习滴定分析法的基本原理，熟悉实验操作基本流程。 实验项目二：凯氏定氮法测定蛋白质含量 实验目的：掌握使用基本滴定原理和方法测定蛋白质含量和凯氏定氮仪的使用。 主要仪器：凯氏定氮仪、电子天平、通风橱、电炉、酸碱滴定管。
教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“滴定分析的计算”章节内容，熟悉凯氏定氮法的基本原理。 实验项目三：的含量测定 实验目的：用滴定法测定并掌握水果和蔬菜中维生素的测定方法。 主要仪器：电子天平、研钵、移液管、酸碱滴定管。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“滴定分析的计算”和“标准溶液”章节内容。 实验项目四：蒽酮比色法定糖 实验目的：学习分光光度计的原理合使用方法。掌握总糖定量测定的操作方法。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理，了解分光光度计的基本构造。 实验项目五：血清总胆固醇的测定 实验目的：学习用分光光度法测定血清中总胆固醇（脂肪）含量及标准曲线的制作。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理及其定量和定性的基本方法。 实验项目六：考马斯亮兰染色法测蛋白质 实验目的：学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理及其定量和定性的基本方法。 实验项目七：紫外吸收法测定蛋白质核酸含量 实验目的：学习利用紫外分光光度法对生物大分子进行定量分析度。 主要仪器：紫外可见分光光度计、电子天平。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习紫外分光光度计相关内容及其定量和定性的基本方法。 实验项目八：血清丙氨酸氨基移换酶测定 实验目的：学习利用比色法测定酶的活性。 主要仪器：分光光度计、冰箱、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“酶活力及其动力学数据的测定”章节。 实验项目九：大蒜酶的提取及酶活力和含量测定
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
教案 授课日期：年月日教案编号： 教学安排课型：新授课 教学方式：讲授性，主体参与教学 教学资源相关视频，图片，多媒体 授课题目（章、节）蛋白质化学 教学目的与要求： 1，掌握蛋白质的元素组成特点，氨基酸的结构通式； 2、掌握蛋白质一级结构、二级结构的概念、维系键； 3、掌握蛋白质的结构与功能的关系； 4、熟悉蛋白质物化性质； 5、了解蛋白质的与医学的关系； 重点与难点： 重点：蛋白质的元素组成特点，氨基酸的结构通式 难点：蛋白质物化性质 教学内容与教学组织设计：详见附页 课堂教学小结： 一、蛋白质的变性 1 、概念：天然蛋白质受到物理、化学因素的影响，导致其空间结构的破坏，从而使蛋白质的理化性质发生改变和生物功能的丧失称为蛋白质的变性作用。 2 、引起蛋白质变性的因素：物理因素、化学因素二、蛋白质的两性性质蛋白质中所带的正电荷与负电荷相等而呈电中性（此时为两性离），此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，常用pI 表示。三、蛋白质具有两性电离、胶体、变性和沉淀的性质。四、蛋白质的定性、定量测定方法有多种。五、蛋白质具机体的有三大功能:。不同状态下的机体对蛋白质的需求及代谢情况有差异。构成人体的氨基酸有20种，其中8种是体内不能合成的，需从饮食种摄取。 复习思考题、作业题： 医院杀菌灭毒的方式有哪些？这些方式和蛋白质变性有何关系？ 课后反思： 做好新课导入是成功教学的关键，尽量做到知识点讲解的深入简出，要注意结合日常生活知识和护理相关知识。
教学主要内容备注 绪论 生物化学就是生命的化学。它是研究活细胞和有机体中存在的各种化学分子及其所参与的化学反应的科学。分子生物学：是研究生物大分子结构、功能及其基因结构、表达与调控机制的科学。 一、生物化学发展简史 二、生物化学研究内容 1．生物分子的结构与功能 2．物质代谢及其调节 3．遗传信息的传递及其调控 三、生物化学与医学 1．生物化学与分子生物学在生命科学中占有重要的地 位 2．生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领 域 3．生物化学的发展促进了疾病病因、诊断和治疗的研 究 第一章蛋白质的结构与功能 一、蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。 蛋白质是细胞的重要组成部分，是功能最多的生物大分子物质，几乎在所有的生命过程中起着重要作用：1）作为生物催化剂，2）代谢调节作用，3）免疫保护作用，4）物质的转运和存储，5）运动与支持作用，6）参与细胞间信息传递。 二、蛋白质的分子组成 1. 蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S，各种蛋白 质的含N量很接近，平均16%。20mins 5 mins 5 mins 25 mins
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？
碘价的测定(Hanus) 法 三、实验原理 在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。脂肪分子中如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。由于碘与脂肪的加成作用很慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后，测定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下：I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂) IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr— KI+CH3COOH-->HI+CH3COOK HI+IBr-->HBr+I2 I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6 (滴定) 四、实验试剂及材料仪器 1、Hanus试剂：溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5％)内，溶时可将冰醋酸分次加入，并置水浴中加热助溶，冷后，加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。此溶液储于棕色瓶中。 2、15％碘化钾溶液称取150g碘化钾溶于水，稀释至1000ml。 3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N) 25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3．5H20溶（C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中，稀释至1000ml，此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3，数日后标化。 标化方法：精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g 2份，分别置于两个500ml碘瓶中，各加水约30ml使溶解，加入固体碘化钾2.0g及6NHCl l0 ml：混匀，塞好，置暗处3分钟，然后加入水200ml稀释，用Na2S203滴定，当溶液由棕变黄后，加淀粉液3ml，继续滴定至呈淡绿色为止，计算Na2S2O3溶液的准确浓度。滴定的反应： K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2O I2+2S2O2-—>2I-+S4O2- 4、1％淀粉液 五、实验方法 准确称取0.2g脂肪，置于碘瓶(图5中)，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，(注意勿使碘液沾在瓶颈部)，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，混匀后，置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟，于另一碘瓶中置同量试剂，但不加脂肪，作空白试验。 60分钟后，先注少量15％碘化钾溶液于碘瓶口边上，将玻塞稍稍打开，使碘化钾溶液流入瓶内，并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液，共加20ml，再加水100ml，混匀，两个样品一起加入，终止反应。随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。初加硫代硫酸钠溶液时可较快，俟瓶内液体呈淡黄色时。加淀粉液1ml，继续滴定，滴定将近终点时(蓝色已淡)，可加塞振
生物化学实验思考题
————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:
生物化学实验考试试题
细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则