药用真菌粗多糖蛋白含量测定方法
以药用真菌姬松茸(Agaricus blazei)、鸡腿菇(Coprinus comatus)、猴头(Hericium erinaceus)、灰树花(Grifola frondosa)和灵芝(Ganoderma lucidum)的水提多糖为材料,采用二喹林甲酸法、考马斯亮蓝法、福林-酚法、紫外分光光度法、离子色谱法和传统凯氏定氮法对其中的蛋白含量进行测定和比较分析。结果表明,不同测定方法获得的蛋白含量测定值有差异;笔者推荐使用离子色谱法进行精确蛋白含量测定,采用福林-酚法进行快速趋势比较测定。
药用真菌; 多糖; 蛋白含量; 福林酚法; 离子色谱法
近年来,国内外针对药用真菌保健功能的研究越来越广泛,其中有关药用真菌水提多糖的研究数量明显增多。由于水提粗多糖中含有部分游离蛋白,所以蛋白含量成为粗多糖常见检测指标[1]。目前蛋白检测常用方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝法、二喹林甲酸法、福林-酚法、紫外分光光度法等,还出现了利用离子色谱分析氨基酸来计算蛋白质含量的离子色谱法,笔者以5种常见药用真菌的水提粗多糖为试验材料,采用上述6种测定方法进行蛋白含量测定,比较各方法的测定值和重复性,并对各测定方法优缺点进行分析。
1 材料与方法
1.1试验材料
姬松茸(A. blazei)、鸡腿菇(C. comatus)、猴头(H. erinaceus)、灰树花(G. frondosa)、灵芝(G. lucidum)子实体购自磐安市场,粉碎过80目筛后,参照文献[2,3]的沸水提取方法进行粗多糖提取,水提物冷冻干燥后得干粉。每种药用真菌3个平行样,充分混匀后用于蛋白含量测定。
1.2蛋白含量测定方法
1.2.1二喹林甲酸法(BCA法)
使用Applygen公司提供的BCA法蛋白浓度定量试剂盒,参照文献[4]对各水提多糖样品进行蛋白含量测定。
1.2.2考马斯亮蓝法(Bradford法)
使用GENMED Bradford 蛋白浓度定量试剂盒,参照文献[5]进行测定。
1.2.3福林-酚法(Lowry法)
使用上海荔达提供的Lowry法蛋白测定试剂盒,参照文献[6]进行测定。
多糖含量的测定参照国标NY/1676-2008 一、实验原理 多糖在硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有特征吸收，与标准曲线比较定量。 二、试剂 1、硫酸（H2SO4，国药集团），ρ=1.84g/mL； 2、无水乙醇（国药集团）； 3、苯酚（国药集团），重蒸馏； 4、80%乙醇溶液（国药集团）； 5、葡萄糖（国药集团），使用前于105℃恒温烘干至恒重； 6、80%苯酚溶液：称取80g苯酚于100mL烧杯中，加水溶解，定容至100ml后转至棕色瓶中，置4℃冰箱中避光贮存。 7、5%苯酚：吸取5mL，80%的苯酚溶液，溶于75mL水中，混匀，现配现用。 8、100mg/L标准葡萄糖溶液：称取0.1000g葡萄糖于100mL烧杯中，加水溶解，定容至1000mL，4℃冰箱中避光贮存。 三、仪器 双光束紫外可见分光光度计（TU-1901；北京普析通用仪器有限责任公司） 分析天平（0.0001g；奥豪斯） 超声提取器（KQ-500B;昆山市超声仪器有限公司） 高速离心机（常州中捷实验仪器制造有限公司） 四、操作步骤 1、样品的提取 称取样品0.1g于离心管中，加入20mL无水乙醇，充分混匀后超声提取30min，然后4000r/min离心10min，弃去上清液，不溶物用10mL乙醇溶液洗涤、离心。用水将上述不溶物转移至圆底烧瓶中，加入50mL水，沸水浴回流提取2h。冷却至室温，过滤，将上清液转移至100mL容量瓶中，残渣洗涤2-3次，洗涤液转移至容量瓶，加水定容。 2、标准曲线 分别吸取0、0.2mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL标准液至试管中，蒸馏水补至1.0 mL。向试液中加入1.0 mL5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，静置10min。充分混匀后将试管放置于30℃水浴中反应20min,在490nm处测吸光度，以浓度为横坐标，吸光度未纵坐标，绘制标准曲线 3、测定 吸取1.00mL样品溶液于20mL具塞试管中，按照1、2操作，测定吸光度，同时做空白实验 五、计算公式 X（%）=m1*v1/(m2*v2)*0.9*10-4 m1标曲上查的样品测定液中含糖量，μg； v1样品定容体积，mL； v2比色测定所移取样品测定液体积，mL； m2样品质量，g； 0.9 葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数
27 第13卷 第8期 2011 年 8 月 辽宁中医药大学学报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 13 No. 8 Aug .，2011 复方雄蚕蛾胶囊中总多糖和蛋白质含量测定 耿耘，马超英，李子阳，杨超，罗丽勤 （西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031） 收稿日期：2011-05-18 基金项目：四川省科技厅支撑计划资助项目（2008SZ0141）；四川省中医药管理局科技专项资助项目（2008-31）作者简介：耿耘（1959-）,女，河北石家庄人，教授，硕士，研究方向：中药药理学。 复方雄蚕蛾胶囊是由雄蚕蛾、枸杞子等3味药食两用中药组成的保健食品，临床应用证明其具有补肾壮阳、改善免疫及抗疲劳等功效，主要用于中老年人阳气亏虚、阴精不足或抗病能力下降、易疲劳等症者。为了有效地控制其质量，我们根据该保健食品中药物组成中的有效成分，采用检测该胶囊中多糖和蛋白质的含量来保证质量。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。现报道如下。 1 材 料 UV-265型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；微量定氮蒸馏仪一套（深圳三利仪器）；复方雄蚕蛾胶囊（由西南交通大学中药研究所提供，规格0.5g/粒，批号080915）；D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，批号110833200503）。 2 方法与结果2.1 多糖含量测定 2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25mg，置250mL 量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻 度，摇匀，配制成每毫升中含无水葡萄糖0.1mg 的对照品溶液。 2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置具塞试管中，加水至2.0mL，各精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白。照紫外分光光度法，在490nm 波长处测定吸收度，以吸收度A 为纵坐标，对照品溶液质量浓度C(g ·L -1)为横坐标，得回归方程:Y=0.0141X+0.1642，r =0.9984，结果表明，无水葡萄糖在0.02~0.1g ·L -1范围内，其质量浓度与吸收度线性关系良好。2.1.3 供试品溶液的制备 取6颗胶囊，将其内容物置于三角瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀超声待糖全溶后，将杂质过滤，滤液置旋转蒸发仪中蒸发，蒸发完全后用无水乙醇溶解超声溶解充分，滤掉杂质，然后将滤液置旋转蒸发仪中蒸发，再用蒸馏水溶解，溶液移至250mL 摘 要：目的：建立复方雄蚕蛾胶囊质量控制的定性定量方法。方法：总多糖含量测定采用苯酚-硫酸显色 法[1]，在490nm 波长处测定吸收度，在0.02~0.1g·L -1范围内，其质量浓度与吸光度线性关系良好（r =0.9984）；蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[2]。结果：复方雄蚕蛾胶囊中总多糖的平均含量为5.9%，蛋白质平均含量为51.3%。结论：该方法操作简便、快速、灵敏度高和重复性好，可以作为复方雄蚕蛾胶囊的质量控制的定性定量方法。 关键词：复方雄蚕蛾胶囊；总多糖；蛋白质；含量测定 中图分类号：R-322 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 08- 0027- 02Determination of Total Polysaccharides Content and Protein Content in Bombycidae Hung Capsule GENG Yun，MA Chao-ying，LI Zi-yang，YANG Chao，LUO Li-qin （College of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China） Abstract： Objective ：To study the quality standard of bombycidae hung capsule. Method ：The contents of Total Polysaccharides were determined by phenol-sulfuric method [1] ,the detection wavelength was 490nm,from 0.02~0.1g ·L -1，The Linear Relationship was good between Concentrations and Absorbency of Total Polysaccharides（r =0.9984）；The content of Protein were determined by Micro - Kjeldahl method [2]. Result :The average contents of Total Polysaccharides was determined 5.9%，the average content of Proteinin was determined 51.3%，from Bombycidae hung Capsule. Conclusion ：The above method for the quantification was proved to have the advantages of simple operation, rapidity, high sensitivity and fine repetition, and it should be helpful for monitoring the quality control methods of Bombycidae hung Capsule. Key words：bombycidae hung capsule；total polysaccharides；protein；determination
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较 1．蛋白质的常规检测方法 1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 1.2 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是3 分子的脲经180℃左右加热,放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合）,称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速,干扰物质少,不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ②三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 1.3 Folin-酚试剂法 原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同,利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。 同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,由此可测定蛋白质的含量。 测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高,对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时,要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、 糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。
粗多糖的测定方法(1) 1. 原理 分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。 2. 适用范围 参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。 3.仪器 （1）分光光度计 （2）离心机 （3）旋转混匀器 （4）恒温水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 （1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。 （2）2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。（3）铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。 （4）铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。 （5）洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。（6）1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。 （7）20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。 （8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h 至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。 （9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。 粗多糖的测定方法(2) 5. 操作方法 5.1 样品处理 （1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。 （2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。 （3）沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。 （4）测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。 5.2 标准曲线制备：
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤： ①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸
粗多糖含量测定方法学研究资料 一、仪器与试药 (1) 二、方法的研究 (2) 1.检测波长的测定 (2) 2.样品及对照制备方法 (2) 三、方法学验证 (3) 1.线性 (3) 2.精密度实验 (4) 3.稳定性实验 (4) 4.重复性试验 (5) 5.中间精密度实验 (5) 6.准确度试验 (6)
芪参颗粒粗多糖含量测定方法起草说明 标志性成分粗多糖含量测定的方法来源于《保健食品功效成分检测方法》白鸿主编（中国中医药出版社)的第二法，该方法的原理是：多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，糖与硫酸在沸水浴中加热脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基呋喃糠醛），再与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，其显色强度与溶液中糖的浓度成正比，在625nm波长下比色测定。 主要研究资料如下： 一、仪器与试药 1、仪器 (1) 离心机（湘南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TD25-WS）； (2) 离心管：50ml； (3) 水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号 DK-S26）； (4) 旋涡混合器（DioCote，SA8）； (5) SHIMADZU UV-1800 紫外可见光分光光度计； (6) JB760-68 石英比色皿（宜兴市伟鑫仪器有限公司）； (7) TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； 2、试药 (1) 葡萄糖：广州化学试剂厂，分析纯，批号为-1； (2) 无水乙醇：西陇化学股份有限公司，分析纯，批号为160802 1； (3) 蒽酮：国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号为； (4) 硫酸：广州化学试剂厂，分析纯，批号为-1； (5) 葡萄糖标准液：标准称取干燥恒重的分析纯级葡萄糖，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（ml）。 (6) %蒽酮硫酸溶液（W/V）：准确称取蒽酮置于烧杯中，缓缓加入100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黄色透明溶液。现用现配。 3、试样
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 ①浓硫酸：分析纯，95.5% ②80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） ③5%苯酚：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取 该馏分(100%苯酚)5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中， 冰箱中冷藏储存备用。 ④标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干 燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入6%（5%，9%）苯 酚0.5ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同 样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL）0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 6%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 注意事项 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
多糖含量的测定 1.原理 分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。 2.适用范围 参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。3.仪器 （1）分光光度计 （2）离心机 （3）旋转混匀器 （4）恒温水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 （1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。 （2）2.5mol/LNaOH溶液：100gNaOH加蒸馏水稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和。 （3）铜贮存液：称取3.0gCuSO4·5H 2 O，30.0g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。 （4）铜应用溶液：取铜贮存液50ml，加水50ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。 （5）洗涤液：取水50ml，加入10ml铜应用溶液，10ml2.5mol/LNaOH溶液，混匀。 （6）1.8mol/LH 2SO 4 ：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。 （7）20g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。（8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。 （9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。 5.操作方法 5.1样品处理 （1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml（V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。 （2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml（V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。 （3）沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml（V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/LNaOH2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。 （4）测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL1.8mol/LH 2SO 4 溶解，用水定容至100mL（V5）。 准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白的提取和定量 肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃ 蛋白质定量：BCA蛋白测定法 ①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 ②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。 ③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的 ④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。 ⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。同时打开酶标仪预热。 注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。 ⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 ⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）： 总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul） RSB=1/5*总体积（ul） TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul） 先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70℃保存。 Western Blot SDS-PAGE 1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。 灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到
蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋
白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外
多糖含量测定的几种不同方法比较 系别:信息学院 专业:生物工程 学号: 姓名: 指导教师: 指导教师职称: 讲师
多糖含量测定的几种不同方法比较 摘要：本文综述了多糖含量测定的几种常用方法，主要有苯酚-硫酸法、3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)、蒽酮-硫酸法、色谱法、红外光谱定量分析多糖法等。并对这些方法的优缺点进行了分析和比较。这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考，并为多糖含量测定的更深入研究提供一定的理论基础。 关键词：多糖；含量；测定；方法
A review of different methods to the determination of polysaccharides Abstract: Paper reviewed some different methods to the determination of polysaccharides, in it phenol-vitriol method, 3, 5-two nitro salicylic acid (DNS) method, anthrone-vitriol method, chromatography, infrared spectrum quantitative analysis and etc had been dealed with. And the advantages and disadvantages of these methods are analyzed and compared. It provided some related information and based theories to the determination of polysaccharides content. Key words：polysaccharides; content; determination; methods
第九章多糖的测定 第一节淀粉的测定 ●一、测定淀粉含量对于决定用途具有重要意义： ●1、淀粉是供给人体热量的主要来源。 ●2、淀粉在食品中的作用是作为增稠剂、胶体生成剂、保潮剂、乳化剂、粘合剂等。 ●二、淀粉的测定方法： ●（一）淀粉的物理检验法：淀粉因其品种不同，淀粉的大小和形状也不同。用显微 镜分析法可鉴别不同品种的淀粉。 ●（二）淀粉含量的测定方法： ●1、酶水解法： ●（1）概念：淀粉用麦芽淀粉酶水解成二糖，再用酸将二糖水解为单糖，然后测定由 水解所得到的单糖。（还原糖） ●（2）常用于液化的淀粉酶是麦芽淀粉酶。它是?—淀粉酶和?—淀粉酶的混合物。 ●（3）酸直接水解法：淀粉的测定方法也可采用酸直接水解法，但酸水解法不仅是淀 粉水解，而且也能分解半纤维素，结果产生了具有还原力的木糖、阿拉伯糖等单糖，使淀粉测定所得的结果较实际含量偏高。 ●（4）酶水解法的优点：在一定条件下，用?—淀粉酶处理样品，则能使淀粉与半纤 维素等某些多糖分开来。因为?—淀粉酶具有严格的选择性，它只使淀粉液化变成低分子糊精和可溶性糖分，而对半纤维素不起作用。在用?—淀粉酶液化淀粉除去半纤维素等不溶性残留物后，再用酸水解使生成葡萄糖，所得结果比较准确。这种酶水解作用，叫作选择性水解。 ●（5）酶水解法测定淀粉的具体步骤： ●a:样品的处理：将磨碎样品置漏斗中，用乙醚50ml分数次洗涤，除去脂肪，再用10% 乙醇洗去可溶性糖分，先5次。 ●b:酶水解：将滤纸上残留物用水移至烧杯内，水浴加热直到淀粉糊化。冷却至60℃， 加麦芽汁20ml在60℃保温1小时，再重复加热冷却，保温冷却过滤，将滤液定容250ml。 ●c:酸水解，吸取滤液加入1：4硫酸，放在120—130℃油浴中保持沸腾5—6min用 40%NaOH 滴定至碱性。 ●d:用非林氏试剂测定葡萄糖含量，同时做空白试验。 ●e:计算：淀粉=[（A-B）*0.9*100]/[W*(50/250)*(V/100)*100] A:样品中淀粉相当于还原糖重量（mg) B:空白相当于还原糖的重量0.9：还原糖换算为淀粉因数 V/100：样液酸解后稀释100ml取Vml W：样品重量（g） 第二节纤维的测定 ●植物性食品内含有粗纤维，它集中存在于谷类的麸、糠、果蔬的表皮及其纤维样组 织之中。从现代营养学的观点来看，我们膳食中每天需要摄入一定数量的纤维（称为膳食纤维），它可防止包括阑尾炎、心脏病和结肠癌等多种疾病，所以，深入了解膳食纤维的特性及其分析方法更具有迫切的现实意义。此外，粗纤维的含量是果蔬制品的一项质量指标，借此可以鉴定果蔬的鲜嫩度。例如：青豌豆按其鲜嫩程度分为三级，其粗纤维含量分别为：一级1.8%左右，二级2.2%左右，三级2.5%左右。 ●一、概念： ●粗纤维：指动物饲料中那些对稀酸、稀碱难溶的，家畜（特别是反刍动物）不容易
蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量 一. 实验原理 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 μg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。该法有很高的灵敏度，糖含量在30 μg左右就能进行测定。 二. 试剂器材 蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100 mL使溶解，摇匀。当日配制使用； 葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml； 其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶(100ml、50ml、10ml)、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。 三. 操作步骤 葡萄糖标准曲线的制作 取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2-3个重复： 管号0 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。 在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。
以标准葡萄糖含量( g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 样品的测定 将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2-3个重复。 在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计算各样品溶液中糖的浓度，并计算其糖含量。 四. 注意事项 该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。
四种紫外吸收法: 1. 280nm的光吸收法 用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。 标准曲线的测定： 取6支试管，按下表编号并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用蒸馏水补体积至5.0 mL；测定A280 ：用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横坐标作图，标准曲线应为直线。 利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 2. 280 nm和260 nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260 nm 处的吸收更强，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍；而蛋白质则相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ＝1.8 纯核酸的光吸收比值：A280/A260＝0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280 －0.74×A260 (mg/mL) 3. 215 nm与225 nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收测定时，可用215nm与225 nm 吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白质溶液，分别测定215 nm和225 nm的吸光度值，并计算出吸收差: 吸收差D= A215 －A225 以吸收差D为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。