人脑星形胶质细胞瘤血管内皮生长因子表达、血管生成及细胞增殖活性的研究
张淑杰1
,刘 明2
,王瑞芬1
,王正彩1
,王立峰
13
(1.哈尔滨医科大学第一临床医学院病理科; 2.哈尔滨医科大学第四临床医学院
肿瘤治疗中心,黑龙江哈尔滨150001)
[摘要] 目的 研究血管内皮生长因子(VEG F )和增殖细胞核抗原(PC NA )在星形细胞瘤中的表达,探讨VEG F 与肿
瘤血管生成和细胞增殖的关系。方法 SP 免疫组化法对64例星形细胞瘤的VEG F 和PC NA 表达进行观察。C D31单克隆抗体免疫组化染色显示微血管,用微血管计数(M VC )测定肿瘤血管生成。结果 VEG F 蛋白主要分布在高级别胶质瘤组织的瘤细胞和内皮细胞,低级别胶质瘤呈低表达,且与PC NA 的表达成显著正相关(r =0.991,P <
0.01);高级别胶质瘤M VC 显著高于低级别胶质瘤。结论 VEG F 可能参与胶质瘤血管生成,对胶质瘤的恶性进展
起促进作用,PC NA 较能客观地反映肿瘤的恶性程度。
[关键词] 星形细胞瘤;血管内皮生长因子;增殖细胞核抗原;微血管计数
[中图分类号]R730.264 [文献标识码]A [文章编号]1000-1905(2007)03-0230-04
VEGF expression ,angiogenesis ,and cell proli feration in human brain astrocytomas
ZH ANG Shu 2jie ,LI U Ming ,W ANG Rui 2fen ,et al
(Department o f Pathology ,The Fir st Clinical College ,Harbin Medical Univer sity ,Harbin 150001,China )Abstract :Objective T o investigate the expressions of vascular endothelial growth factor (VEG F )and prolif 2
erating cell nuclear antigen (PC NA )in human brain astrocytomas and its relation with angiogenesis and cell proliferation.Methods The expressions of VEG F and PC NA in 64astrocytomas were examined by S 2P immu 2nohistochemical analysis ,the vascular development was measured by microvessel counting (MVC )by immunos 2taining with C D31m onoclonal antibody.R esults Immunohistochemical staining for VEG F showed the distribu 2tion of VEG F protein was mainly in tum or cells and endothelial cells of high 2grade glioma ,whereas it was only weakly expressed in low 2grade glioma ,and VEG F protein expression was significantly positive correlated with that of PC NA (r =0.991,P <0.01).MVC in high 2grade glioma was considerably higher than those in low 2grade glioma (P <0.05).Conclusion VEG F may contribute to the progression of human glioma and play an im portant role in leading to angiogenesis.PC NA was inv olved in malignancy of astrocytoma.K ey w ords :astrocytomas ;VEG F ;PC NA ;microvessel counting
[收稿日期]2006-01-15
[作者简介]张淑杰(1969-),女,黑龙江哈尔滨人,副主任医师。
3通讯作者
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEG F )是一类特异性作用于血管内皮细胞的
二聚糖蛋白,具有增加血管通透性[1]
,促进血管内皮细胞分裂增殖的作用,对活体血管生成具有强烈的
诱发作用[2]
。大量的研究证实,VEG F 是肿瘤血管生
成的主要促进因子[3-5]
。血管生成是肿瘤生长的关
键,对实体瘤的快速生长尤为重要[6]
。阻断血管生
成能显著抑制肿瘤的生长[7]
,抗血管生成治疗是不
同于常规的新的抗肿瘤策略,在一些实验性肿瘤治
疗中已经取得理想疗效
[8-10]
。
胶质瘤是人体血管最丰富的肿瘤之一,为探讨VEG F 在人脑胶质瘤中表达及其与肿瘤微血管计数(microvessel counting ,MVC )和细胞增殖活性的关系,
以便为抗血管生成治疗胶质瘤提供理论依据,我们应用SP 免疫组化技术检测64例人脑胶质瘤,6例正常脑组织中VEG F 表达,用C D31免疫组化染色检测胶质瘤中MVC ,应用增殖细胞核抗原评价胶质瘤
细胞增殖活性,并分析VEG F、MVC、增殖细胞核抗原(PC NA)与胶质瘤细胞分化程度的关系,探讨VEG F 与MVC、PC NA的相关关系。
1 材料与方法
111 材料
选取哈尔滨医科大学第一临床医学院1999～2000年胶质瘤手术标本的存档蜡块64例,其中毛细胞性星形细胞瘤2例,星形细胞瘤Ⅱ级19例,Ⅲ级22例,Ⅳ级21例,星形细胞瘤病理分级按WH O分类;正常脑组织标本6例,取自非脑病死亡的尸体解剖脑标本的存档蜡块。
1.2 试剂
鼠抗人VEG F蛋白的单克隆抗体J H121、鼠抗人C D31及PC NA的单克隆抗体和SP2StreptavidinΠPerox2 idase kit由福州迈新公司提供。
1.3 方法
辣根过氧化酶标记的SP法进行免疫组化检测:石蜡切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢2甲醇封闭5min,P BS(pH7.2)漂洗后置E DT A(pH8.0)中,微波炉抗原修复5min,P BS漂洗后依次滴加一抗4℃过夜,二抗37℃15min,辣根酶标记的链酶卵白素工作液15min,P BS漂洗后DAB显色,自来水充分冲洗终止反应,苏木素复染,脱水,透明,封片。以P BS缓冲液代替C D31、PC NA和VEG F作为阴性对照。1.4 结果判定
VEG F的表达强度按组织切片中肿瘤细胞的显色比例评分:“-”无阳性细胞,“+”阳性细胞< 25%,“++”阳性细胞25%～50%,“+++”阳性细胞>75%。
微血管计数参照Weidner法[11]。先用40倍光镜扫视整个切片,寻找高血管密度区,即热点区(hot spot),一般位于肿瘤组织包膜区域的纤维组织中,也可见于肿瘤组织的任何部位,然后在200倍视野下计数热点区被C D31染色的微血管数目,血管内皮细胞被染成棕色,只要与邻近的微血管,肿瘤细胞或结缔组织分开,就视为一个微血管,即使同一血管的“头”和“尾”恰巧在同一平面上,也作为两个微血管计数,血管腔的有无不作为判断血管的标准。MVC 用单个200倍视野下最多的血管数目来表示,不用多视野下血管数的均数表示,这是因为肿瘤的复发和转移与热点区的微血管密度有良好的相关性,而与平均微血管密度无相关性[12]。
PC NA:PC NA以肿瘤细胞核棕褐色染定义为免疫组化阳性。对于每一张切片,随机取3个高倍视野<400,计数其阳性细胞数,并以其三者的平均值定义为肿瘤的PC NA的阳性细胞率,即PC NA的阳性率(阳性细胞数Π计数肿瘤细胞数<100%,按组织切片中肿瘤细胞的显色比例进行半定量:“-”无阳性细胞,“+”阳性细胞<25%,“++”阳性细胞25%～50%,“+++”阳性细胞>75%。
1.5 统计学处理
用SSPS10.0统计软件进行分析,计量资料采用t检验;计数资料采用χ2检验和Fishier2exact检验;VEG F与MVC,VEG F与PC NA两变量间关系采用直线相关分析。
2 结果
211 人脑胶质细胞瘤中VEG F的表达
VEG F阳性染色局限于肿瘤细胞胞浆,偶见周围结缔组织及血管内皮细胞呈阳性染色。图1为胶质瘤Ⅳ级VEG F免疫组化染色结果,可见阳性细胞明显增多,染色强度高,而正常脑组织中几乎无VEG F阳性表达(表1)。VEG F的表达与星形胶质瘤组织学分级之间显著相关(χ2=65.916,P=0.000)。
表1 胶质瘤及正常脑组织中VEG F的表达组织类型
VEG F的表达
-+++
+++
总计阳性率(%)正常脑组织(A组)600060.0
星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ(B组)165002123.813#
星形细胞瘤Ⅲ(C组)109302254.55△
星形细胞瘤Ⅳ(D组)402152180.95
3与C组VEG F的表达有差异(P=0.039);#与D组VEG F的表达有显著差异(P=0.000);△与D组VEG F的表达无差异(P=0.063)
2.2 人脑胶质瘤中微血管定量分析
C D31免疫组化染色仅见于血管内皮细胞,正常脑组织及胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级中微血管数量少,而胶质瘤Ⅲ、Ⅳ中微血管数量明显增多(图2)。表2为不同病理分级胶质瘤的M VC结果,可见不同病理分级的胶质瘤中M VC差异有意义,恶性度越高,M VC越高。2.3 人脑胶质瘤中PC NA标记指数
PC NA阳性染色定位于肿瘤细胞核,图3为胶质瘤Ⅱ级PC NA免疫组化染色结果,可见阳性细胞少,染色强度低;正常脑组织中PC NA阳性表达率极低(表3),PC NA的表达与星形胶质瘤组织学分级之间显著相关(χ2=26.182P=0.002)。
2.4 VEG F表达与微血管计数、细胞增殖活性的关系
直线相关分析表明,VEG F表达水平与PC NA、MVC呈显著正相关(r=0.991,P<0.01,表4)。
第3期 张淑杰,等1人脑星形胶质细胞瘤血管内皮生长因子表达、血管生成及细胞增殖活性的研究
表2 胶质瘤及正常脑组织中M VC的表达
组织类型n M VC( x±s)正常脑组织(A组)68.33±2.34
星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ(B组)2119.17±8.593#
星形细胞瘤Ⅲ(C组)2232.86±15.66△星形细胞瘤Ⅳ(D组)2150.67±22.69
3与C组M VC的表达有差异(P<0.05);#与D组M VC的表达有显著意义(P<0.01);△与D组M VC的表达差异有意义(P<0.05)表3 胶质瘤及正常脑组织中PC NA的表达
组织类型
PCNA的表达
-+++
+++
总计阳性率(%)正常脑组织(A组)600060.0
星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ(B组)136202138.10
星形细胞瘤Ⅲ(C组)84642263.643#△星形细胞瘤Ⅳ(D组)610142171.43
3与A组PCNA的表达有差异(P<0.05);#与B组PCNA的表达无差异(P=0.085);△与D组PCNA的表达无差异(P=4.414)
表4 VEG F表达与PC NA、M VD的相关性
组织学分级
VEG F表达
阳性率(%)
PCNA表达
阳性率(%)
M VC( x±s)
Ⅰ～Ⅱ23.8138.1019.19±8.59Ⅲ54.5563.64 2.86±15.66
Ⅳ80.9571.4350.67±22.69
3 讨论
3.1 血管内皮生长因子及血管生成与脑胶质瘤
实体肿瘤的生长依赖于肿瘤血管的生成,肿瘤血管生成是一个受基因调控、细胞因子作用等复杂因素影响的过程。肿瘤细胞分泌的某些生长因子,如成纤维细胞生长因子(FG F)、转化生长因子(TG F2α、TG F2β)、血小板衍生的生长因子(PDG F)以及血管内皮生长因子(VEG F)等构成了肿瘤发生、发展以及血管生成的微环境,其中VEG F在脑肿瘤的血管形成过程中最为重要。VEG F对肿瘤血管生成的作用有三:①特异性促进血管内皮细胞增殖;②提高血管通透性,引起血浆蛋白从血管内渗漏到血管外区域;
③刺激内皮细胞产生PAS,从而促进渗漏到血管外区域的血浆蛋白形成纤维蛋白凝块,作为血管新生的支持物。直接应用抗VEG F抗体,VEG F反义核苷酸体内实验治疗中,胶质瘤生长明显受到抑制;而在体外培养的瘤细胞中则无抑制作用,说明体内的抑瘤作用与抑制血管生成有关,支持VEG F在脑胶质瘤中具有促进内皮细胞增殖,新生血管生成的观点。
肿瘤血管生成具有一定的组织侵蚀性,肿瘤细胞可沿新形成血管启开的组织裂隙向外侵袭,侵蚀周围组织,肿瘤细胞在原发肿瘤血管化之前极少能进入血液循环,研究已经显示,肿瘤微血管数量愈多,肿瘤细胞进入血液循环的机会就愈大。伴随血管内皮细胞增生的大量微血管生成是恶性胶质瘤的标志,用肿瘤的微血管计数(MVC)反应肿瘤的恶性程度。以前多用Ⅷ因子相关抗体标记肿瘤微血管,但它不仅标记毛细血管,也标记淋巴管,特异性不高。现也用C D31和C D34抗体,通过标记血管内皮细胞来反映肿瘤微血管密度,但对新生血管芽的特异性不强。
Weidner等[11]研究发现,肿瘤的增殖、转移和复发与肿瘤的平均微血管计数(MVC)无相关性,而与高密度血管区(热点区)的MVC有良好的相关性,针对C D31等血管内皮细胞抗原的免疫组化报道的MVC也较为相近[11-13]。
本研究应用免疫组化方法,直接检测VEG F蛋白在人脑胶质瘤中的表达,不同病理分级的胶质瘤中VEG F表达差异有显著性,恶性度愈高,VEG F阳性率愈高,而正常脑组织中几乎无VEG F阳性表达。Ⅲ、Ⅳ胶质瘤VEG F蛋白水平显著高于Ⅰ、Ⅱ级; VEG F主要分布于高恶性胶质瘤细胞和血管内皮细
232哈尔滨医科大学学报 第41卷
胞,定位于细胞浆,低恶性胶质瘤表达相对较低,正常脑组织几乎检测不出。结合VEG F具有的特异性刺激血管内皮细胞增殖及血管生成的生物学功能,我们认为VEG F基因可能是人脑胶质瘤血管生成的重要调节基因,VEG F参与脑胶质瘤的血管生成和侵袭发展过程。
本研究应用C D31抗体显示血管内皮细胞,发现C D31免疫组化染色仅见于血管内皮细胞膜,形成环状(横切面)或条状(纵切面)的棕色染色,正常脑组织及胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级中新生微血管数量少,而胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级微血管数量显著增加,血管丧失正常外形,扩张扭曲,管腔不规则。不同病理分级的胶质瘤中的MVC差异有显著性,恶性度愈高,MVC 愈高。说明胶质瘤中MVC能较好反映病期进展,高水平的MVC预后不良,MVC可以作为胶质瘤预后和肿瘤诊断的指标之一。人脑胶质细胞瘤VEG F蛋白的表达水平与MVC呈显著正相关性(r=0.991,P <0.01),VEG F表达与MVC有良好的相关性,说明VEG F能较好地反映肿瘤微血管生成的活跃程度。
3.2 VEG F与胶质瘤细胞增殖
研究肿瘤增殖动力学的一个重要方面是检测肿瘤细胞的增殖活性,细胞增殖活性可以判断肿瘤恶性程度及评估肿瘤生物学特点,是判断肿瘤预后的指标之一。目前用于检测肿瘤细胞增殖活性的方法很多,其中增殖细胞核抗原(PC NA)的检测方法简单,结果可靠。PC NA是一种分子量为38kD的酸性核蛋白,它是DNA多聚酶的辅助蛋白,为DNA合成所必需的细胞周期调节蛋白,在细胞周期是G
1后期
及S期合成期,G
2期浓度降低,在G0期检测不到,所以只有处于增殖状态的细胞才能检测到PC NA的存在。PC NA的免疫活性较好地反映了细胞增殖活性,目前多用于评价肿瘤细胞增殖活性及肿瘤生物学行为。
本研究结果表明,PC NA阳性染色定位于肿瘤细胞核,细胞核被染成棕黄色,各级胶质瘤细胞中均有不同程度的PC NA阳性表达,而正常脑组织中PC2 NA阳性表达率极低。本组胶质瘤Ⅰ、Ⅱ级PC NA免疫组化染色阳性细胞较少,染色强度低;胶质瘤Ⅲ级、Ⅳ级PC NA免疫组化染色阳性细胞明显增多,且染色强度高。高恶性胶质瘤中PC NA表达与低恶性胶质瘤比较差异有显著性。直线相关分析表明, VEG F表达强度与PC NA阳性率呈正相关,即胶质瘤中VEG F表达强度愈高,肿瘤细胞增殖活性也愈高,说明血管生成旺盛的肿瘤,其细胞分裂活跃,细胞增殖活性更高,提示VEG F通过刺激肿瘤微血管生长而促进肿瘤细胞增殖和生长,预后不佳。
总之,VEG F的表达不仅与胶质瘤的发展密切相关,而且与MVC、PC NA的表达有显著的相关性,高表达的VEG F、MVC及PC NA提示预后不良,深入研究其血管生成与生物学行为的关系,可能为胶质瘤的抗血管治疗提供理论依据。
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