浙江大学学报（医学版）第４０卷
达质粒签定结果ＢａｍＨＩ内切酶酶切，Ｉ％琼脂糖凝胶电泳，如图ｌ所示，得到７１６ｂｐ、６３０９ｂｐ条带，为正确克隆。
图１ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９（１５６３ｂｐ）ＢａｍＨＩ酶切鉴定
Ｆｉｇ．１ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９（１５６３ｂｐ）
２．２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ重组质粒鉴定结果经Ｈｉｎｄ９Ｉ和ＣｌａＩ酶切鉴定，ｌ％琼脂糖凝胶电泳，如图２所示，得到６５２６ｂｐ、ｌ１９６ｂｐ条带，测序验证。
图２ｐｅＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ重组质粒ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａＩ酶切鉴定
Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｅｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）?
ＣＹＰＩ９．ＧＦＰ
２．３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９ｗ３９Ｒ＿ＧＦＰ和ｐｅＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９粼．ＧＦＰ以及ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９Ｗ３９昏嗍Ｃ＿ＧＦＰ真核表达质粒经测序
结果ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９Ｗ３９Ｒ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第３９位密码子ＴＧＧ由ＣＧＧ所替代，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ｃＹＰｌ９‘幽Ｃ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第２６４位密码子ＣＧＣ由ＴＧＣ所替代，而ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９ｗ３卟。嗍Ｃ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第３９位密码子ＴＧＧ、第２６４位密码子ＣＧＣ分别由ＣＧＧ和ＴＧｃ替代。
２．４野生犁ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ质粒
在细胞中表达情况观察分别以明视野图片为
对照，在经转染质粒的ＭＣＦ－７和Ｂｃａｐ－３７细胞中均能观察到较强的绿色荧光，如图３—６所示。
３讨论
ＣＹＰｌ９基因所编码的Ｐ４５０ａｒｏｍ是雄激素转化为雌激素的限速酶和关键酶，该基因单核苷酸多态性能使其编码的芳香化酶蛋白结构和活性发牛改变，从而可能影响乳腺癌内分泌治疗的疗效。已有相关研究发现，ＣＹＰｌ９３９Ｒ倒６和ＣＹＰｌ９删多态性与内分泌治疗疗效相关ｆｌ引。Ｍａ等…的有关研究发现，来曲唑对经转染ＣＹＰｌ９撇绷。变异体的ＣＯＳ．１细胞芳香化酶蛋白活性的抑制作用比野生型明显降低（Ｐ＜０．０５）。Ｃｏｌｏｍｅｒ等对６７例接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性晚期乳腺癌患者的疗效与ＣＹＰｌ９基因３’一ＵＴＲＳＮＰｓ的相关性研究发现，ＣＹＰｌ９基因ｒｓ４６４６ＡＣ或者ＡＡ基因型携带者至疾病进展时间（Ｔｉｍｅｔｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ＴＴＰ）比ＣＣ基因型携带者明显延长（１７．２个月比６．４个月，Ｐ＝０．０２）Ｂｊ。Ｌｏｐｅｚ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ等对８６名接受新辅助内分泌治疗的绝经后乳腺癌患者的研究也发现，ｒｓ４６４６多态性可能与内分泌治疗的疗效相关＂。。
我们的前期研究亦发现，在５４例接受三苯氧胺术后辅助治疗的患者中，ＣＹＰｌ９基因ｒｓ４６４６ＣＣ基因型携带者的无瘤生存时间（Ｄｉｓｅａｓｅｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌ，ＤＦＳ），比ＡＣ基因型或Ａ等位基因携带者均明显延长（Ｐ＝０．０１８，
０．０１）；在２４例接受第三代芳香化酶抑制剂治
第２期邵１年英．等．ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９－ＧＦＰ真核表达质粒构建
图３荧光显微镜下观察ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９．ＧＦＰ质粒转染ＭＣＦ－７细胞
图４ＭＣＦ－７细胞（明视照片）图５荧光显微镜下观察ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ质粒转染Ｂｃａｐ３７细胞图６Ｂｃａｐ３７细胞（明视照片）
Ｆｉｇ．３ＭＣＦ．７ｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９－ＧＦＰｉｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＦｉｇ．４ＭＣＦ－７ｃｅｌｌｉｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＦｉｇ．５
Ｂｃａｐ３７ｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰＩ９一ＧＦＰｉｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＦｉｇ．６Ｂｃａｐ３７ｃｅｌｌｉｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
疗的激素受体阳性晚期乳腺癌患者中，ＣＣ基因型携带者的，ｒｒＰ比ＡＣ或ＡＡ基因型携带者也有延长趋势。因此，ＣＹＰｌ９基因多态性的功能分析将成为今后乳腺癌内分泌治疗领域新的研究热点。
为了今后进一步研究ＣＹＰｌ９３９Ｒ删６和ＣＹＰｌ９一多态性的确切功能，我们在构建野生型ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９－ＧＦＰ的基础上，又通过定点突变等方法构建了ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｉ９Ｗ３９Ｒ－ＧＦＰ和ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９“２６４６．ＧＦＰ及ｐｃＤＮＡ３．Ｉ（＋）．ＣＹＰｌ９们蛐－“２６４Ｃ＿ＧＦＰ融合质粒。由于ＣＹＰｌ９基因在人体中的表达具有组织特异性，其中，在胎盘中的表达高达２３２０±１３３２ａｔｔｏｍｏ［／ｉｘｇ（１８ＳｒＲＮＡ）［４－６Ｊ，因此，本实验以胎舷组织总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ．ＰＣＲ扩增ＣＹＰｌ９基因片段。
构建克隆载体时，可以合理利用酶切，经平端或粘端连接插入目的基因。Ｔａｑ聚合酶具有末端连接酶的功能，在ＰＣＲ扩增产物的３’端自动添加一个３一Ａ突出端。我们构建克隆载体时选择ＴＥａｓｙ载体，利用Ｔ－Ａ克隆，不需使用含限制酶序列的引物，不需优化ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物不需做平端处理及添加接头，即可直接进行克隆，操作方便，成功率高。ｘｕ等在克隆、测序目的基因时都采用Ｔ—Ａ克隆＂剖。在本研究中，由于目的基因片段长达ｌ５６３ｂｐ，Ｔａｑ酶保真度不够，存在碱基错配现象，我们通过分段扩增基阒片段，利用相应内切酶酶切，回收』邸角片段、连接，最终成功构建ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ－ＣＹＰｌ９（１５６３ｂｐ）质粒。从中可以得到启发，当目的基因片段较长，Ｔａｑ酶不能达到一定保
真度时，通过分段扩增短基因片段．酶切、连接
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转 染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹 【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染 ［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
构建目的基因的真核表达载体实战操作 最后更新：2010-5-16 阅读次数：451 【字体：小中大】 目的：构建目的基因的真核表达载体 一.PCR扩增得到目的片段 1.引物的设计与合成： 这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基），后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。 现在想想，有几点教训： (1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样 (2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾 （3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起 2.Pfu酶扩增： （1）扩增效率低的问题： 往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。 （2）pfu保真性的问题： 即使是pfu，也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。 3．cDNA模板的问题： 在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板，因此在开始要准备足够的cDNA。100ul，200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA 的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。 二．酶切的问题： 用于构建的酶切一定要非常充分！ 新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。 三．PCR产物直接酶切：
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
?学术交流?pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达 邓兴力 杨智勇 董坚 王廷华 徐丹 冯忠堂 【摘要】 目的 构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表 达。方法 以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2 NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和 western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。结果 R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒 pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人 N GF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其 前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb, 为后续的研究奠定基础。 【关键词】 神经生长因子; 真核表达; 重组质粒; 转染 C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong, DO N G J ian,et al. De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming Medical College,Kunming650032,China 【Abstract】 Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3- hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods The cDNA of human nerve growth factor beta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombination technique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2 nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2 binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-β was analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults The R T-PCR product is 750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into 750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with human N GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressed successfully in L929cells.Conclusions The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructed successfully,which will provide the foundation for f urther research. 【K ey w ords】 Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection 中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022******* 神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。N GF在体内首先以其前体的形式合成,随后在各种蛋白酶的作用下裂解为成熟体[1]。最近研究表明,N GF前体(p roN GF)具有与成熟N GF相反的生物学活性,其通过作用于p75N TR受体及sortilin受体介导包括神经细胞内的多种细胞凋亡[2-5]。本研究将构建人N GF-β基因真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,并研究其在L929细胞中的表达情况,为进一步研究p roN GF的 作者单位:650032昆明医学院第一附属医院神经外科(邓兴力,杨志勇),生物治疗中心(董坚);昆明医学院神经科学研究所(王廷华、徐丹、冯忠堂) 作者简介:邓兴力(1979-),男,博士研究生。研究方向:细胞移植治疗帕金森病的研究。 通讯作者:冯忠堂 fzt@https://www.doczj.com/doc/ce8859427.html, 生物学功能奠定实验基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、细菌与脑组织 真核表达质粒载体pcDNA3由昆明医学院第一附属医院生物治疗研究中心保存;小鼠成纤维细胞系L929、E.coli D H5α由昆明医学院神经科学研究所保存;人脑肿瘤旁组织由昆明医学院第一附属医院神经外科提供。 1.1.2 主要试剂与工具酶 TRIzol,Lipofectamine 2000Reagent,G418,RPM I1640培养基,小牛血清(Invitrogen);Hind,xho,T4DNA Ligase,Calf In2 testine Alkaline Phosp hotase,First Strand cDNA Synt hesis K it,High Fidelity PCR Enzyme Mix(MB I Fermentas);凝胶回收试剂盒,DNA纯化试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(OM EGA);DNA MA KER DL2000,DNA MA KERλ-Eco T14(Takara);6×
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞
E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建 【摘要】目的克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，HECTD3）基因及构建真核表达质粒。方法提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA，并逆转录为cDNA，以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因，将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功，可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。 【关键词】E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒 泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰，参与调控多种生物学过程，其系统功能的紊乱与癌症发展进程密切相关[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[2]，但是目前尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[3]。因此本文拟克隆HECTD3基因，并构建该基因真核表达质粒，对进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。 1 实验材料 卵巢癌细胞SKOV-3、真核表达载体pCDNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶购自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit购自omega公司，DL2000、1Kb DNA Marker购自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成，测序也由该公司完成。其余试剂购自广州威佳生物有限公司。 2 试验方法 2. 1 HECTD3基因的扩增采用Trizol法提取SKOV-3细胞RNA，并逆转录成cDNA。以该cDNA为模板进行HECTD3基因的扩增，Forward Primer：5’-GGCgctagcATGGCGGGTCC-TGGCCCGG-3’，Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCCCAAGGGCTCATGTCA-3’，其中小写黑体的序列表示酶切位点。PCR结果用1%琼脂糖凝胶检测。将扩增的目的条带用胶回收试剂盒回收，具体操作见说明书。 2. 2 pcDNA-HECTD3重组质粒的构建利用限制性内切酶NheI和EcoRI，37℃2 h消化真核表达载体pcDNA 3.1（+）和PCR扩增得到的HECTD3基因片段，回收载体和基因片段的酶切产物。T4 DNA Ligase 于16℃连接载体和基因片段。连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆送invitrogen公司测序。
实验九表达质粒的构建与诱导表达 第一节原核表达概述 基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约： 1．正确的阅读框架 为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。 2．目的基因有效转录的启动子 启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列， 它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为一35区和一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。 目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受la cⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp 等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp 启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG 存在时就能够启动转录；噬菌体的λP L、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。 3．转录终止子 构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子(terminator)。否则合成的 mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。原核基因的转录终止序列包括依赖Rho蛋白和不依赖Rho蛋白两种。不依赖Rho的终止信号序列都含发夹结构，末端为一连串T 及YRTCTG。 4．mRNA有效翻译的SD序列 在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码(AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是由SD序列以及与起始密码子AUG之间的距离决定的。因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是影响外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。SD序列与AUG间隔9个碱基最为合适，其间距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响，蛋白质合成水平会相差2 000倍以上。且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。 5．转录、翻译后的适当修饰和加工 真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。并且不同宿主其修饰系统也不一样，所以选择宿主时应注意。 6．信号序列(signal sequence)