协助扩散与离子通道（选自细胞生物学）
根据不同物质通过膜的方式不同：被动运输、主动运输以及内吞和外排作用三个途径。
一.被动运输：
包括自由扩散和促进扩散。参与被动运输的膜运输蛋白主要有两大类：通道蛋白和载体蛋白。此外离子载体也参与被动运输。
1.通道蛋白：是一类跨膜蛋白，个有跨膜的亲水通道，能使水、小的水溶性分子、离子
等被动通过膜。
A.水通道或称水孔：在质膜上一部分通道蛋白带电荷的亲水区形成小的水通道，使水
及小的水溶性的溶质通过简单的自由扩散从膜的一侧到另一侧。通道蛋白不直接与小的带电荷的溶质相互作用。这些小的水溶性演技直接经扩散作用通过水孔进出细胞。
B.离子通道：由于膜上的大部分通道蛋白仅能通过无机离子，故得名。在离子通道上
常具有门，因此又称门通道。它与简单的水孔不同，不仅有门，且对离子通过有高度的选择性。一种通道只允许一种类型的离子通过，其它的不能通过。对离子的选择性于离子通道的直径和形状，也准定于通道里面的带电荷氨基酸的分布。例如，窄的秒能通过大的离子；具负电荷衬里的通道，则制止了负离子的进入。离子通道与简单水孔不同，它不是连续地开放，而是瞬时地开放。
包括：配体门通道（钠离子通道）、电子门通道（神经细胞传送电信号：神经肌肉接头）、压力门通道（内耳听毛细胞质膜上具有）。
2.载体蛋白：是参与被动运输的另一类运输蛋白，也是跨膜蛋白分子，能与特定的分子——一些小的有机分子（如糖、氨基酸、核苷酸等）或金属离子等结合通过膜。这种物质运输称为促进扩散，也称为易化扩散或协助扩散。载体有高度的选择性。
3.离子载体：是小的疏水分子，溶于膜的脂双分子层中，大部分是微生物合成的，它能保护带电荷的离子顺着电化学梯度通过脂双层。（如缬氨霉素属于可动离子载体；离子载体A23187等）
二.主动运输
1.ATP—驱动泵：这类泵本身也是一种酶—ATP酶。这能催化ATP，由ATP水解提供能量，主动运输Na+、K+、Ca2+等，由于运输溶质不同，而分为钠钾泵和钙泵等等。
2.协同运输：
3.光驱动泵
膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出
基础与临床心律失常 一、单选题 1、约60%的窦房结动脉源于: A.左主干; B.左冠状动脉; C.右冠状动脉; D.左回旋支； E.冠状静脉 答案:C 2、房室结的血供90%来源于: A.左主干; B.左冠状动脉; C.右冠状动脉; D.左回旋支； E.冠状静脉 答案:C 3、下列叙述哪一项是错误的: A,希氏束起源于房室结; B.长约15 mm; C.通过中心纤维体骑跨在室间隔顶部; D.通常行走于室间隔膜部的右侧; E.往下分为左右束支 答案:D 4、以下哪种心律失常时听诊心律不规则：c a.房扑4：1传导 b.房颤伴III度房室传导阻滞 c.莫氏I型房室传导阻滞 d. 莫氏II型房室传导阻滞2：1传导 5、.以下哪种疾病不引起上肢静脉压升高：d a.右心衰竭 b.上腔静脉综合征 c.缩窄性心包炎 d.肝硬化 6、.I度房室传导阻滞患者心尖部听诊可能发现：b a.第一心音亢进 b.第一心音降低
c.第二心音亢进 d.第二心音降低 7、下列各项中容易引起晕厥（或阿-斯综合征）的是：c a.完全性右束支传导阻滞 b. 完全性左束支传导阻滞 c.完全性房室传导阻滞阻滞 d.室上性心动过速 8、以下哪种心律失常时听诊心律不规则：d a. 室扑4：1传导 b.房颤伴III度房室传导阻滞 c.室上速 d.II度（文氏型）房室传导阻滞 9、关于房颤的心室率控制以下那项是正确的: A.常选用心律平控制心室率; B.静息时控制在60-80次/分, 中等运动量90-115次/分; C.无必要选用动态心电图来评估室率控制; D.抗凝治疗; E. 无必要选用6分钟步行试验来评估室率控制 答案：B 10、以下除外哪一项均需华法令抗凝: A.TIA; B.卒中史; C.人工心脏瓣膜; D.高血压; E.糖尿病 答案: D 11、如果心动过速时一个或多个室性期前刺激提前希氏束激动60-80ms以上而不改变心房激动时间,支持诊断: A.室速;B.AVRT;C. AVNRT;D.房速;E.窦速 答案:D 12、女性, 36岁, 发作性心悸3小时就诊。查体:心率220次/分,节律规整。按压右侧颈动脉窦数秒钟, 心率突然降为76次/分, 患者自觉症状缓解。该患者最可能的诊断为: A. 阵发性房性心动过速; B. 阵发性室性心动过速; C.阵发性室上性心动过速; D.阵发性房颤;E窦速 答案:C 13、对阵发性室上速伴心功能不全者以下哪项选择是正确的: A.心律平;B维拉帕米;C.地尔流卓;D.西地兰;E.美多心安
膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
膜片钳记录和分析技术在生命科学中的应用 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科—电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二：膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管。在此基础上相对稳定膜电位，同时，对该膜片（单通道）和（全细胞）上的离子通道电流进行监测和记录，即用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，代表离子通道电流；并通过分析通道电流了解细胞的性质和生理功能及各因素干预后的影响。
膜片钳使用规则 一、工作原理： 1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。 二、操作步骤： 1.打开总电源。 2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。 3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。 4.灌注玻璃电极并排空气体。 5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。 6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。
7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。 8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。 9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。 10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。 三、注意事项： 1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。 2.拉制仪使用前需预热15-30min。 3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次 氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换 次氯酸钠。 4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。 5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时 才可关闭。 6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触 电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。 7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液 体进入银丝底部增加噪声。 8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。 9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。 10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，最 适液面为微高于出液口。
心律失常 心脏病变时，心内神经递质系统，尤其是肾上腺素能受体通路有不同 水准的损害。心力衰竭时受体功能异常是致心律失常以及心功能损害 的重要中介因素。受体通过调节各种离子通道(Na+、Ca2+、K+、Cl-通道)改变细胞内外离子浓度，影响细胞电活动，易致传导性改变或产生 后除极而诱发各种心律失常。利用遗传性猝死狗模型证实了室性心律 失常发生的机制为浦肯野纤维早期后除极诱发的触发活动［1］。 现就当前涉及心律失常与受体、心律失常遗传基础及传导系统相关研 究作一概述。 一、β肾上腺素能受体 1.β肾上腺素能受体(β受体)在传导系统的分布窦房结、心房内、 房室结、希氏束和心室内传导系统均有β1、β2受体分布。窦房结内 β1、β2受体均高于周围心房肌，房室结内β2受体最高。希氏束 β1受体最低，希氏束、房室间隔β2受体最低。另外传导系统各部位β1、β2受体密度不一致。窦房结与心房内均以β1受体为主，但窦 房结中β2受体为心房的2.5倍，与窦房结特殊的生理功能相一致［2］。希氏束内β2受体比例最高，占(72±6)%，房室结为(51±3)%，房室间隔均为(36±1)%。心室肌与冠状动脉相比，其β受体与G蛋白 耦联更牢固［3］，可能与心室肌以β1肾上腺素能受体为主而冠状动 脉以β2受体为主的亚型分布差异相关。 关于年龄对344只Fisher大鼠β受体影响的研究发现，随年龄增长，房室结β受体密度下降，但受体亲合力及亚型比率不变；而在左右心室，β受体的密度和亚型比率均无改变［4］。心力衰竭患者有β1受体下调，这种现象在心力衰竭早期就出现，且与心力衰竭的严重水准 呈正相关；β2受体数目不变但功能下降，可能与抑制性G蛋白(G-proteininhibit)功能增强相关。β1、β2受体数目及比例在扩张型心肌病(DCM)、缺血性心肌病(ICM)心脏传导系统中差别不明显［5］。在
膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位
的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。
膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 一、膜片钳技术原理及特点
非离子通道阻滞剂的抗心律失常作用 传统的抗心律失常药主要依赖于阻断Na+、K+、ca2+离子通道，包括I类、Ⅲ类和Ⅳ类抗心律失常药。由于多数治疗剂量的离子通道阻滞剂在患有器质性心脏病的患者中同时具有致心律失常的副作用，临床使用受到限制。近年来研究发现，心脏的机械牵张、炎症、氧化应激，心房肌细胞代谢，细胞外基质的重构和纤维化等也参与了心律失常的发生过程，已成为心律失常治疗的新靶点。非离子通道阻滞剂将成为心律失常治疗的重要药物，主要包括β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂／血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物、多聚不饱和脂肪酸等。由于这些药物的抗心律失常作用基于对参与心肌细胞电学和结构重构的受体和细胞信号转导途径的干预，它们不直接阻滞离子通道，无致心律失常的副作用，且对心律失常具有早期预防作用，近年来成为研究的新动向，又称之为“心律失常的上游治疗”。 一、β受体阻滞剂 β受体阻滞剂虽为Ⅱ类抗心律失常药，本身不直接阻断离子通道，却是惟一被大型临床试验证实能够降低器质性心脏病患者猝死的药物，能降低心肌梗死后患者30％的猝死风险，早期应用可降低慢性心力衰竭(心衰)患者30％的全因病死率。 二、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin
convertingenzyme inhibitors，ACEIs)／血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker，ARBs) 肾素．血管紧张素．醛固酮系统的持续激活能够导致心脏重构，也是心律失常发生的重要原因，尤其是其中间产物血管紧张素Ⅱ具有很强的致心律失常作用。首先，心房肌细胞的血管紧张素Ⅱ受体多于心室肌细胞，血管紧张素Ⅱ增加心房压力，导致心房牵张，使心房不应期缩短和心房内传导时间延长，从而使房性快速型心律失常的发生率增加。其次，血管紧张素Ⅱ显著增加心房和心室肌细胞的钙超载，在缺血时容易诱发再灌注心律失常。此外，血管紧张素Ⅱ促进心肌纤维增生，降低胶原酶的活性，使心肌的顺应性下降，这些改变均为折返性心律失常的发生提供了条件。而血管紧张素Ⅱ来源于血管紧张素转换酶途径和血管紧张素受体途径。因此，应用ACEIs和ARBs阻断血管紧张素Ⅱ的生成已成为心律失常治疗的新靶点，ACEIs和ARBs已经在心律失常尤其是房颤的治疗中逐渐受到重视。 三、他汀类药物 炎症反应是房性心律失常产生和维持的重要因素。25％一40％房颤的发生与心房炎症有关，尤其是术后房颤；而房性快速型心律失常的维持也常常与心房炎症瘢痕形成有关。近年来，他汀类药物即羟甲戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂降脂之外的抗心律失常效应在临床试验中得到了证
膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
现代分子毒理学机制研究表明：乌头碱可促进钠离子通道电流(I )，增加内向整流钾电流(I ，)以及L一型钙离子通道电流(Ica-L)，抑 制瞬时外向钾电流(It。)，明显延长动作电位时程(APD)，增加后除 极发生率，引起折返冲动，诱发快速型心律失常， ]。其中L一型 钙离子电流、内向整流钾电流、钠内流可能是心律失常发生中起关 键作用的离子靶点。乌头碱改变心肌细胞膜上一系列离子电流的机 制是影响相关通道基因的表达。如，使钠离子通道基因(SCN 5A)表 达上调，导致心肌细胞膜钠离子通道失活关闭不正常，钠离子内流 增加[241；促进L一型钙离子通道基因(Cavl 2)的mRNA表达，引起L 一型钙离子通道电流密度增加，细胞内钙离子浓度升高【20 ；降低 瞬时外向钾电流基因(Kv43)的mRNA表达，改变It。，从而导致APD平 台期延长，复极异常，引起复极时程的离散和后除极的发生，导致 心律失常_2 。 L一型钙通道属于电压依赖性钙通道，其开放与关闭主要取决于膜电位的变化， 属长时程钙通道。 心室肌细胞膜上的钙通道以L型钙通道为主，生理情况下细胞内钙浓度上升主要 取决于细胞内钙释放，经L型钙通道产生的内向钙电流是内钙释放触发的主要机 制【剐。Ic,-L主要在快速去极化时引起动作电位的传导，参与心肌动作电位 平台期的形成和维持。L一型钙离子通道电流的升高会导致心肌细胞内钙超负荷，而各种细胞内钙增加将会引发心律失常。广泛的相关研究结果显示，L一型钙通 道编码基因的突变会导致包括Brugada综合征在内的多种类型的遗传性心律失常『2 。Sun等发现，由于L一型钙通道编码基因表达上调而引起的钙离子浓度增加，可能是脑缺血所致严重心律失常的可能机制之一[28】。Timothy综合征是 一种由于L一型钙离子通道基因(Cavl 2)的突变所致的多器官异常及心律失常综 合征。Cavl 2基因G406R的突变不仅改变了其电压依赖性失活动力学，而且显著 减缓了通道时间依赖性失活，导致L型钙通道“功能增强”，动作电位平台期内 向电流增加，QT间期延长。在后续研究中发现，L一型钙离子通道阻断剂(尼索 地平)能抑制突变通道显著增强的钙离子内流，因而具有治疗Timothy综合征的 潜力 根据以上充足的研究证据可以推测，粉防己碱通过非特异性抑制钙 离子的跨膜转运，对抗乌头碱引起的细胞内钙离子浓度升高，从而 阻止严重心律失常的发生 ______基于知识发现工具Arrowsm ith探求防己与附子配伍减毒机制的研究
膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，
膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录 单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨 率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离 子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其 电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与 其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物 学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （一）穿孔膜片钳技术 1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电
2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 来源：易生物浏览次数：513 网友评论0 条 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用一：全自动膜片钳技术介绍：膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch... 关键词：应用药物全自动通道细胞研究 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 一：全自动膜片钳技术介绍： 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional pat ch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。 传统膜片钳技术主要优缺点总结 全自动膜片钳技术的发展，经历了下列三个发展阶段，在每个阶段，所采取的原理和技术有所不同： 1. Flip-Tip翻转技术： 将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后,药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成
丁香园膜片钳技术讨论区 资料汇编 整理人：xiaoxuanzi 发起人：tianx775 2006年6月
目录 第一节膜片钳技术介绍 (1) 应用 (1) 基本概念 (2) 第二节仪器操作和维护 (3) 仪器的使用 (3) 噪声 (4) 玻璃微电极的制备 (5) 第三节 实验操作 (7) 1.细胞的分离、培养 (7) (1)心肌细胞 (7) (2)平滑肌细胞 (17) (3)其他细胞 (19) 2.电极的拉制与电镀 (23) 3.电极内外液与渗透压 (25) 4.串联、封接、电极电阻 (28) 5.补偿 (37) 6.刺激方案 (40) 7.动作电位记录 (42) 8.电流记录 (42) (1)钙电流 (42) (2)钾电流 (45) (3)钠电流 (47) (4)其他电流 (48) 9.穿孔 (50) 10.单通道记录 (51) 11.脑片 (54) 12.数据分析与处理 (55) 第四节 相关电子文献及书籍 (61)
第一节 膜片钳技术介绍 一、应用 1.全细胞记录技术的应用 [Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等) （2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。 （3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。 （4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。 （5）组织切片的全细胞记录。 (6)植物细胞的电生理研究。 二、基本概念 1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊 holding potential与command potential？ Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？ 都分别什么时候给予？ 在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补 偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节 扭？ [baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾 通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验 模式。而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激 方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后 去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是command voltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。 Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通 过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。 pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而 Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。Axon200B的面板上 在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的 magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。实际 上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不 完美，需要再稍稍调节一下SLOW。 2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。离子通道一般有备 用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。但 最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是 一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状 态个代表什么含义？ [coolworm]C<----->O<------->I