中国农业科学 2011,44(15):3252-3263 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.15.021
收稿日期：2010-09-28；接受日期：2010-12-08
基金项目：中国博士后科学基金项目（20070420722，200801221）、国家大学生创新性实验计划项目（081063503）、高等学校学科创新引智计划
（B07045）、重庆市自然科学基金计划重点项目（CSTC ，2011BA1005）
联系方式：赵爱春，Tel ：023-********，Fax ：023-********，E-mail ：zhaoaichun@https://www.doczj.com/doc/c84615338.html, ；zhaoaichun@https://www.doczj.com/doc/c84615338.html,
FLP/FRT 位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展
赵爱春，龙定沛，谭 兵，许龙霞，向仲怀
（西南大学蚕学与系统生物学研究所/农业部蚕学重点开放实验室，重庆 400716）
摘要：来源于酵母2 μm 质粒的FLP/FRT 位点特异性重组系统已经被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物，正逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。笔者综述了FLP/FRT 系统的重组原理及其在高等真核生物中的应用，系统地概述了该系统在转基因植物、哺乳动物、昆虫以及其它相关高等真核模式生物中的研究现状，讨论了FLP/FRT 系统在研究中存在的主要问题、应用前景和发展方向。
关键词：FLP/FRT 系统；位点特异性重组；转基因；高等真核生物
Progress in Research of FLP/FRT Site-Specific Recombination System in Higher Eukaryotes
ZHAO Ai-chun, LONG Ding-pei, TAN Bing, XU Long-xia, XIANG Zhong-huai
(Institute of Sericulture and Systems Biology, Southwest University/Key Sericultural Laboratory of the Ministry of Agriculture,
Chongqing 400716)
Abstract: FLP/FRT site-specific recombination system derived from 2 μm plasmid of yeast has been widely used in Arabidopsis thaliana , Oryza sativa Linnaeus, Mus musculus , Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans and other higher eukaryotic organisms, and gradually become one of the powerful tools of genetic manipulation in transgenic animals and plants research areas. This review introduced the recombination principles of FLP/FRT system and its application in higher eukaryotes, and systematically summarized the main achievements of the system in transgenic plants, mammals, insects and other higher eukaryotic model organisms. In addition, the main problem, application prospect and developmental trend of the FLP/FRT system were discussed in this review.
Key words: FLP/FRT system; site-specific recombination; transgene; higher eukaryotes
0 引言
位点特异性重组（site-specific recombination ）技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，其通过借助特异位点重组酶（site-specific recombinase ，SSR ），在基因组和外源DNA 上的重组酶特异识别位点（recombination target site ，RTS ）间进行基因操作，可实现基因置换、倒置和组织特异性敲除等。由于位点特异性重组技术能够有效克服诸如同源重组、非同源重组以及转座重组等其它类型重组
技术的重组效率低、随机整合而不具有靶向性以及易受整合的位置效应影响等缺点，因而逐渐被广泛应用于各种生物特别是高等真核生物的基因工程操作。
常用的位点特异性重组酶系统多为双组分系统，根据重组酶序列的同源性及催化氨基酸的特性可将其分为2个家族：酪氨酸家族和丝氨酸家族。λ重组酶、P1噬菌体的Cre 重组酶、酵母的FLP 重组酶、细菌的XerC 蛋白以及新近发展起来的Dre 重组酶属酪氨酸家族；链霉菌噬菌体的ФC31重组酶、R4、Tn3、TP901-1重组酶属丝氨酸家族。目前研究和运用最多的位点特
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异性重组系统主要是Cre/loxP、FLP/FRT和ФC31-Int 这3个系统[1]。来源于酵母的FLP/FRT位点特异性重组系统由于具有较高的重组效率和靶向性，已经被广泛应用于细菌、HIV病毒等微生物和拟南芥、水稻、小鼠、大鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物的研究中，实现了基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作[2]。本文概述了FLP/FRT位点特异性重组系统的研究现状及其在高等真核生物中的应用，并就当前FLP/FRT系统存在的主要问题和今后的发展方向进行了讨论。
1 FLP/FRT位点特异性重组系统概述
1.1 FLP/FRT系统的来源
1980年，Hartley等对酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）的2 μm双链环状DNA质粒（yeast 2 micron circle plasmid）的序列进行了测序鉴定，发现2 μm环结构上最为显著的特点是存在2个599 bp的反向重复序列（inverted repeat，IR）[3]。这2个IR序列之间能够发生重组，使酵母细胞中的2 μm环存在A 和B 2种不同的构型，并对维持2 μm环在酵母细胞中的高拷贝数具有十分重要的作用[4-6]。进一步研究发现，2 μm环分子内发生的DNA重组属于位点特异性重组，Broach等[7]在1980年首次将催化这一重组反应的flippase基因编码的重组酶命名为“FLP”（flippase recombination enzyme）。
1.2 FLP/FRT系统的重组酶和重组位点
FLP/FRT系统是典型的双组分位点特异性重组系统，FLP重组酶基因全长1 272 bp，编码1个423个氨基酸残基的48 kD的多肽单体蛋白[8]。FLP重组酶作用的靶序列为2 μm环的2个IR序列中48 bp的FRT 位点（FLP recombination target）[9]。
FLP作为整合酶家族的位点特异性重组酶，其蛋白活性部位在结构上与其它的整合酶家族的重组酶类似，均具有4个相对保守的氨基酸残基[10]。FLP重组酶的活性部位是1个由Arg191、His305、Arg308和Tyr343残基共同组成的四分体结构（tetrad）[11]，其中Arg191、His305和Arg308残基能介导相同FRT位点之间的连接反应，Tyr343残基能使FRT序列发生断裂[12]。有研究表明，Arg191和His305残基与FRT位点间的连接反应直接相关，而Arg308残基与重组期间断裂的磷酸二酯键（phosphodiester bond）的活化以及结合期间磷酸酪氨酸（phosphotyrosine）的形成有关[13]。如果Arg308发生突变，则会影响FLP单体对FRT位点的切割活性[14]。
FLP重组酶识别位点FRT全长48 bp，包含3个13 bp的重组酶结合区和1个8 bp的含XbaⅠ位点的非对称间隔区（spacer）[15-16]（图1）。8 bp间隔区相邻的2个13 bp的反向重复序列是重组酶识别和结合的位点，8 bp间隔区序列是链的断裂、重接、Holliday 交叉（holliday junction）中间体分枝的移动等重组过程的发生区域，其不对称性显示整个重组位点具有方向性，重组位点的不同定位形式（同向或反向）决定其重组方式[17]。
FRT序列包含3个13 bp的重复元件（a、b、c标记的水平箭头），它
们共同构成FLP特异结合的位点；“c”元件并非重组反应所必需的元件；“a”和“b”元件被一个8 bp的非对称间隔区隔开（空方框，深黑
字母），间隔区即为重组发生的区域；垂直箭头表示断裂发生的2个位
置
The FRT site consists of three 13 bp symmetry elements (horizontal arrows, a, b and c) to which FLP binds in a site-specific manner; The ‘c’ element is dispensable for recombination function; The ‘a’ and ‘b’ elements are separated by an 8 bp asymmetric spacer (open box, dark black letters) across which recombination takes place; The vertical arrows indicate the two cleavage sites
图1 FRT位点的结构[16]
Fig. 1 Structure of FRT site
FLP/FRT系统中的突变型识别位点有2种，一种是反向重复突变位点[18]（即FRT位点间隔区相邻2个13 bp的反向识别区域的碱基突变），另一种是间隔区突变位点[19]（即FRT位点8 bp间隔区域的碱基突变）（表）。FLP重组酶介导左臂反向重复突变型FRT位点（LE mutant）与右臂反向重复突变型FRT位点（RE mutant）发生重组，生成1个双臂反向重复突变型FRT 位点与1个野生型FRT位点。FLP重组酶很难识别新生成的双臂反向重复突变型FRT位点，因此利用反向重复突变位点可以介导外源基因片段稳定的插入或倒置。但是由于反向重复突变型FRT位点来源于13 bp识别区域的碱基突变，突变导致FLP重组酶对突变型FRT位点的识别与结合效率降低，进一步导致重组效率的显著降低，因此这种类型的FRT突变位点并没有在位点特异性重组技术中得到广泛的运用。与此相反，间隔区突变型FRT位点在近年来的研究中却逐渐得到了广泛的应用。在FLP重组酶作用下，2个相同的间隔区突变型FRT位点（如FRT3
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表 可供选择的FLP识别位点
Table Alternative FLP recognition sites
靶位点Target site a 反向重复序列1
Inverted repeat 1
间隔区域
Spacer
反向重复序列2
Inverted repeat 2
供选择位点的用途
Use of alternative site
参考文献
Reference
FRT GAAGTTCCTATTC TCTAGAAA GTATAGGAACTTC [9]
FRT3GAAGTTCCTATTC TtcAaAtA GTATAGGAACTTC RMCE
b [19] FRT5GAAGTTCCTATTC TtcAaAAg GTATAGGAACTTC RMCE [19]
FRT mutant -10 (LE c mutant)GAAGTTCaTATTC TCTAGAAA GTATAGGAACTTC Stable insertion or inversion [18]
FRT mutant +10 (RE d mutant)GAAGTTCCTATTC TCTAGAAA GTATAtGAACTTC Stable insertion or inversion [18]
a小写字母表示突变型FRT位点相对于野生型FRT位点序列发生改变的核苷酸；b RMCE，重组酶介导的盒式交换；c LE，左臂反向重复突变型FRT
位点（反向重复序列1）；d RE，右臂反向重复突变型FRT位点（反向重复序列2）
a Nucleotides that have been altered from the wild-type FRT sites are lowercase;
b RMCE, recombinase mediated cassette exchange;
c LE, left-han
d element of
FRT recognition site (inverted repeat 1); d RE, right-hand element of FRT recognition site (inverted repeat 2)
和FRT3，FRT5和FRT5）之间的重组效率几乎与野生型FRT位点间的重组效率相同，而间隔区突变型FRT位点与野生型FRT位点（如FRT3和FRT，FRT5和FRT）或者2个不同的间隔区突变型FRT位点（如FRT3和FRT5）之间由于具有异种特异性，其重组效率则非常低。
如今，间隔区突变型FRT位点已经被广泛应用于果蝇、小鼠等高等真核模式生物的基因工程操作。在小鼠的ES细胞中利用FLP重组酶介导相同的间隔区突变型FRT位点之间的重组反应，能够实现外源染色体与基因组之间的重组，建立突变型ES细胞系[20]。通过对突变型ES细胞系的进一步培养与筛选，最终实现基因敲除或基因敲入小鼠模型的建立[21-22]。此外，间隔突变型FRT位点也已经与逆转录病毒载体结合应用于基因治疗中[23]。
1.3 FLP/FRT系统的重组机制
对于FLP/FRT系统真实的作用机制尚无定论，其作用机制的主要模型假说包括Holliday模型、拓扑异构酶模型、随机卷曲模型、核小体模型和足迹模型等。目前比较公认的为Holliday模型，其认为当FLP重组酶介导FRT位点发生重组时，4个FLP单体蛋白与2个平行排列的FRT位点结合构成1个重组四聚体（recombination tetramer），FLP单体活性部位的Tyr343残基亲核性地攻击FRT序列，使FRT序列的间隔区发生断裂[24]。Tyr343残基与断裂位点处的磷酸基团结合形成3′-磷酸酪氨酸（phosphotryosine），同时在FRT断裂位点处形成1个自由的5′-羟基（5′-OH）。Tyr343残基介导间隔区发生的断裂可能存在4种不同的方式（图2）[25-26]，Jayaram[27]证实FLP单体活性部位的Tyr343残基并非攻击临近结合区域的断裂位点（顺式断裂，cleavage in cis），而是作用于另外3个较远端的断裂位点（反式断裂，cleavage in trans），其中水平反式断裂模型（trans-horizontal mode of cleavage）的发生频率最高，垂直反式断裂模型（trans-vertical mode of cleavage）的发生频率相对较低。
“p”表示磷酸二酯键断裂的位置‘p’ indicates the scissile phosphodiester positions
图2 FLP酶介导重组过程中可能存在的分裂模型[25]
Fig. 2 Possible modes of cleavage during FLP site-specific recombination
在2个FRT位点发生重组的整个过程中，并没有额外DNA的合成和丢失，一般认为重组反应可分以下几步进行（图3）[13, 24, 28-29]：（1）FLP重组酶识别并结合到FRT位点的反向重复序列区，每个反向重复序列结合1个FLP单体而形成重组四聚体；（2）2个具有活性的FLP单体的Tyr343残基直接攻击FRT 位点spacer断裂处的磷酸二酯键，形成共价中间产物3′-磷酸酪氨酸和1个自由的5′-羟基；（3）5′-羟基攻击相对的另1个FRT位点处形成的磷酸酪氨酸并与之交叉相连；（4）交叉相连的DNA链经旋转形成
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2个FRT 位点与4个FLP 重组酶结合形成1个四聚体，重组酶的每个活性部位都携带1个酪氨酸亲核体；在反应进行的特定时段，4个FLP 单体中仅有2个具有活性，用圆圈标明；酪氨酸攻击易断裂的磷酸二酯键，产生共价的3′-磷酸酪氨酸中间产物；形成的5′-羟基随后攻击相对的磷酸酪氨酸，形成Holliday 交叉中间产物；四聚体异构化激活另1对酪氨酸，使FRT 位点开始第二次的断裂及链交换反应，从而解开Holliday 交叉完成重组
Two FRT segments are synapsed by a tetramer of the FLP recombinase, carrying a tyrosine nucleophile in each active site; Only two of the four FLP monomers are active at a given time, as indicated by circles; These tyrosines directly attack the scissile phosphodiester bonds, resulting in covalent 3′ phosphotyrosine intermediates; The 5′ hydroxyl subsequently attacks the opposite phosphotyrosine, leading to the formation of a Holliday junction intermediate. Isomerization of the complex activates the other pair of tyrosines, initiating a second round of FRT cleavage and strand exchange reactions, which resolves the Holliday junction into recombinant products
图3 FLP 重组酶催化位点特异性重组的反应机制[29]
Fig. 3 Mechanism of site-specific recombination catalyzed by
the FLP recombinases
Holliday 交叉中间体；（5）异构化的四聚体激活另外2个FLP 单体，对FRT 位点进行第二次的切割及交叉连接, 从而解开Holliday 交叉实现重组。在FLP/FRT 系统介导的重组反应中，FLP 重组酶是除重组位点外唯一的必需因子，加上48 bp 的FRT 重组位点便可实现重组。
FLP 重组酶介导的FRT 位点之间的删除、插入、倒位和易位等重组反应是一个动态、可逆的过程
[30-31]
，
具体来说FLP 重组酶可以介导3种类型的特异位点重组反应（图4）：（1）当2个FRT 位点位于同一条DNA 链且同向排列时，重组结果会导致2个位点间的DNA 片段被切除；（2）当2个FRT 位点位于同一条DNA 链且反向排列时，重组结果则会导致2个位点间的DNA 片段发生倒位；（3）当2个FRT 位点分别位于不同的DNA 链上时，重组的结果则会导致2条DNA 链发生相互易位。
黑色和灰色的线条表示染色体DNA 链，DNA 链的方向用字母a—d 或者e—h 表示；灰色箭头显示出重组反应的进行具有可逆性
Black and gray lines represent chromosomal DNA, with orientation indicated by the letters a-d, or e-h; gray arrows indicate the reversible nature of each reaction
图4 FLP 重组酶介导的重组反应[31]
Fig. 4 Recombination reactions mediated by FLP
2 FLP/FRT 系统在高等真核生物中的
应用
FLP/FRT 位点特异性重组系统已经被广泛用于大肠杆菌、HIV 病毒等微生物以及拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物，是目前转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力的工具。特别是利用FLP/FRT 系统在高等真核生物中建立的诱导型基因打靶系统对基因靶位点在时间和空间上的精确调控，有效地推动了功能基因时代的生命科学、基因组学和疾病治疗等诸多领域研究的快速发展。 2.1 FLP/FRT 系统在植物中的应用
FLP/FRT 系统在植物中主要有3个方面的应用[32]：（1）定点转化植物。一旦在植物基因组的某个确定位置建立了FLP 重组酶识别位点（FRT 位点），该位点就可以作为外源基因定点插入和表达的靶位点被重复使用，从而实现定点转化植物；（2）删除标记基因。在选择标记基因两侧插入2个同向的FRT 位点，在FLP 重组酶存在时，可将选择标记基因删除，从而解决转基因植物特别是转基因农作物由于选择标记基因而引起的安全性问题；（3）特定组织器官或发育时期
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删除转入的外源基因。在转基因植物中外源基因转化位点片段两侧插入2个同向的FRT位点，当植物发育进行到某个特定的阶段，或者在某个特定的组织器官内诱导FLP重组酶表达，从而介导重组删除反应的发生，达到删除2个FRT位点间的外源基因片段的目的。
自从Lyznik等[33]于1993年将FLP/FRT系统用于玉米和水稻的原生质体转化瞬时表达以来，FLP重组酶已被广泛运用于包括烟草、拟南芥、玉米、番茄、大豆、油菜和水稻等多种转基因植物中进行位点特异性重组的研究。在不同种类的植物中，FLP/FRT系统的重组效率差别较大。Sonti等[34]在转基因拟南芥植株体内瞬时表达FLP重组酶介导2个反向的FRT位点发生重组，使2个识别位点之间的报告基因发生倒位现象，重组效率为20%。Hu等[35]发现FLP重组酶基因能够稳定地整合进入水稻基因组，试验结果表明在水稻植株体内表达产生的FLP重组酶能够有效识别靶位点并介导DNA间的重组，在F1代水稻植株体内FLP 介导的DNA间重组效率达到了25.6%；Li等[36]将能提高植物耐碱性的基因AtNHX1转入玉米基因组，同时利用FLP/FRT系统删除了作为选择标记的乙酰乳酸合成酶（als）基因，获得的F1代耐碱性杂合子转基因玉米植株中无选择标记的转基因植株比率为40.7%。
随着商品化转基因作物的不断出现，人们对遗传工程生物特别是转基因农作物的环境安全和食品安全问题的关注越来越多。利用诱导型启动子诱导重组酶表达，对作为转基因植物筛选标记的选择标记基因进行时空可控性的删除，逐渐成为近年来研究的热点。Kilby等[37]采用大豆热激蛋白基因启动子Gmhsp17.6L 实现了对重组酶FLP基因表达的随时控制；Luo等[38]在烟草中利用来自拟南芥的热诱导型启动子Hsp18.2诱导FLP重组酶表达，删除了位于2个loxP/FRT位点（改良型FLP重组酶识别位点）之间的异戊烯基转移酶基因（ipt）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）以及FLP重组酶编码基因，获得无选择标记的转基因烟草；Woo等[39]利用多重胁迫诱导的过氧化物酶（POD）启动子诱导FLP重组酶表达，删除了转基因烟草中作为选择标记的潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因，获得的F1代转基因植株中选择标记基因的删除效率最高可达41%。
2.2 FLP/FRT系统在哺乳动物中的应用
基于位点特异性重组技术的FLP/FRT系统作为一项基因功能研究的有效工具，在哺乳动物中多被应用于哺乳动物细胞和转基因小鼠的条件基因操作。O'Gorman等[40]首次利用FLP重组酶在哺乳动物细胞内实现将外源DNA片段整合进入预先确定的染色体位点；Dymecki[41]将FLP/FRT系统应用于小鼠的ES 细胞、EC细胞和转基因小鼠个体，发现FLP重组酶能够在胚胎细胞正常发育时期有效表达，证实了FLP 重组酶能够在转基因小鼠多种类型的细胞中催化重组反应的发生；Lo等[42]利用FLP/FRT系统构建了一种双元杆状病毒载体系统，该系统使FLP重组酶介导的哺乳动物细胞基因删除和重组效率得到了显著提高，其中在人胚肾（HEK293）细胞中的效率为75%，在幼仓鼠肾（BHK）细胞中的效率为85%，在原发性软骨细胞（primary chondrocytes）中的效率为77%，在间质干细胞（MSCs）中的效率达到48%。同时，该混合型杆状病毒系统大幅度地延长了杆状病毒介导的外源基因在哺乳动物细胞中持续表达的时间，提高了混合杆状病毒系统基因治疗的应用潜力。
相对于Cre/loxP系统在哺乳动物细胞和转基因小鼠中重组的高效性，FLP/FRT系统在ES细胞和转基因小鼠中的重组效率一直很低，一个很重要的原因在于2种酶具有不同的最适反应温度[43]（通常认为Cre 重组酶的最适反应温度是37℃，而FLP重组酶是30℃）。直到研究者构建出了在37℃也具有较好酶活性的耐热型FLP突变体（FLPe和FLPo）之后[44-45]，FLP/FRT系统才在基于ES细胞和转基因小鼠的生物医学研究中得到更广泛的应用。Raymond等[45]比较了野生型重组酶FLP和ФC31以及突变型重组酶FLPe、FLPo和ФC31o在小鼠ES细胞以及转基因小鼠个体的重组效率，发现突变型FLPo和ФC31o重组酶的重组效率基本上已经达到了与Cre酶在哺乳动物细胞和个体中重组的水平；Kondo等[46]利用腺病毒载体（AdV）系统在哺乳动物细胞中介导hFLPe重组酶（密码子优化型FLPe重组酶）表达，通过蛋白质印迹法比较鉴定发现，在相同条件下hFLPe重组酶的蛋白表达量是传统型FLPe重组酶蛋白表达量的10倍。该研究不但证实AdV系统能在哺乳动物细胞中定量测定酶活度，也证明这一最新的改良型FLP重组酶表达系统能够有效地运用于哺乳动物细胞系和转基因小鼠个体；Wu等[47]利用密码子优化型FLP突变体FLPo重组酶在C57BL/6品系小鼠中成功删除了位于2个同向的FRT位点之间的新霉素耐药基因（neo）和FLPo 编码序列，F1代小鼠的删除效率达到了100%，基因删除小鼠能够进行稳定的传代培养而不再依赖于FLPo重组酶。
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近年来，FLP/FRT系统在哺乳动物中的研究热点集中在利用FLP/FRT系统在哺乳动物细胞中表达外源基因产物。Wiberg等[48]利用FLP/FRT系统将抗体基因特异性整合进入中国仓鼠卵巢细胞（CHO cell）基因组，通过介导抗体基因在宿主细胞基因组特定位点的均一、稳定的表达，实现了抗-RhD重组多克隆抗体组合物（抗-RhD rpAb）—— Sym001的工业化生产。Wiberg等[48]首先利用同源重组的原理，在仓鼠卵巢细胞基因组特定位点插入1个FRT位点，建立含有单个FLP重组酶识别位点的宿主细胞系（FLP-in CHO cell line），然后将同样含有单个FRT位点的抗-RhD抗体表达载体以及FLP重组酶表达载体共转染宿主细胞系。编码抗-RhD rpAb的核苷酸片段在FLP重组酶的作用下被定点导入宿主细胞系各个细胞基因组的相同位点，从而有效克服了位置效应对抗-RhD rpAb外源DNA片段表达水平的影响。利用这种方法生产的抗-RhD重组多克隆抗体Sym001能够有效地运用于治疗新生儿溶血症（HDN）和特发性血小板减少性紫癜（ITP），因而Sym001可作为优于血浆来源的预防性和治疗性免疫球蛋白产物的替代品。Sym001已于2007年进入了临床开发阶段，成为首个用于人体试验的重组多克隆抗体。这项研究为人类重组多克隆抗体的工业化生产提供了一种非常有效的方法。
此外，FLP/FRT系统还多被用作与Cre/loxP系统联合构建基因打靶小鼠模型。Turakainen等[49]构建了转座载体Kan/Neo-loxP-FRT-Mu，该转座载体的抗性标记基因Kan或者Neo两端均含有1个loxP位点和1个FRT位点。将转座载体Kan/Neo-loxP-FRT-Mu转染小鼠的ES细胞，通过进一步的筛选培育获得的具有快速传代繁殖能力的基因敲除小鼠模型，能够在Cre或FLP重组酶的作用下实现小鼠基因组中2个loxP位点或FRT位点之间的抗性标记基因的精确删除。
2.3 FLP/FRT系统在昆虫中的应用
FLP重组酶在昆虫中的应用最早可以追溯到1989年，Golic等[50]利用果蝇内源性热激蛋白启动子Hsp70启动FLP重组酶基因表达，在果蝇染色体组实现了位点特异性重组。如今，FLP/FRT系统在昆虫中的研究热点几乎都集中在果蝇上，果蝇也是现今FLP/FRT系统运用得最为成熟和广泛的模式昆虫。在其它种类的昆虫物种中运用FLP/FRT系统的报道相对较少，目前仅有Morris等[51]证实FLP重组酶能够在埃及伊蚊（Aedes aegypti）胚胎细胞中介导FRT位点之间发生重组；Tomita等[52]在家蚕（Bombyx mori）细胞和胚胎中运用FLP/FRT系统实现了质粒之间的FRT重组，从而证实FLP酶在家蚕细胞和组织水平均具有位点特异性重组活性。
FLP/FRT系统已被广泛运用于在果蝇个体或种系中产生遗传嵌合[53]和染色体重排[54]。自Rong等[55]在果蝇中应用FLP/FRT系统实现了基因组大片度的删除突变以来，利用FLP/FRT系统介导产生基因删除果蝇逐渐成为了果蝇研究领域的一大热点；Parks等[56]通过使用FLP/FRT系统操作实现的黑腹果蝇基因删除，在分子水平上的缺失跨越已经超过整个果蝇基因组的56％。
FLP/FRT和Cre/loxP系统曾在果蝇中被联合应用于研究2个基因在基因组相同位置时的功能[57-58]。对于果蝇和其它昆虫系统来说，不同等位基因的转基因昆虫的直接比较往往会受到位置效应的影响。为消除位置效应对基因功能研究带来的影响，基于FLP/FRT 系统间隔区突变位点的异种特异性，一种被称为重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediated cassette exchange，RMCE）的技术逐渐发展起来，用来提高外源基因片段在染色体中定点整合的效率[59]。利用FLP-RMCE（FLP重组酶介导的盒式交换）技术可在已确定的染色体位点实现外源DNA片段精确的插入或者替换，其在真核生物细胞或个体基因组中实现位点特异性重组的原理和方法具有普遍性[60]：构建在选择标记基因（正选择或者负选择标记基因）两端含有2个具有异种特异性的FRT识别位点（如FRT和FRT3，FRT3和FRT5）的盒式交换供体质粒，FLP重组酶介导供体质粒和宿主动物细胞或个体基因组上相同的FRT位点之间的重组，从而实现标记基因与位于宿主基因组2个异种特异性FRT识别位点之间的目标基因的替换。
Horn等[61]利用FLP重组酶借助48 bp野生型FRT 位点及突变型FRT3位点在果蝇染色体和外源载体之间实现了盒式交换（图5）。在Horn设计的试验方案中，供体质粒pSL-FRT-EYFP-linotte-FRT3含有1个由同向平行的野生型FRT位点和突变型FRT3位点组成的盒式区域（cassette）。FRT和FRT3位点之间包含1个不具有启动子的EYFP基因和1个来自果蝇的内源性linotte基因序列（linotte基因已被证实能提高FLP重组酶对果蝇基因组中特异位点的识别准确率和效率[62]）。通过转基因技术，利用piggyBac转座载体pBac-3xP3-FRT-ECFP-linotte-FRT3将含有3xP3启动
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供体质粒含有1个由同向平行的野生型FRT位点（实心箭头）和突变型FRT3位点（空心箭头）组成的盒式区域；FLP重组酶识别位点之间包含1个不具有启动子的EYFP基因（空白框）和一段1.6 kb的果蝇内源性linotte基因序列（灰色框）；靶品系是一个转基因品系，转基因为一个与供体盒式区域相似的盒式结构，其包含3xP3启动子控制下的ECFP基因；辅助质粒FLP表达的重组酶介导任意一对FRT或FRT3位点发生重组反应，将整个供体质粒整合进入靶位点形成中间构型的重组品系；与发生整合反应相同靶位点对的FLP切除反应能够使中间构型返回原始构型；与发生整合反应不同靶位点对的FLP切除反应可实现盒式交换；由于FRT和FRT3位点具有异种特异性，盒式交换被认为是不可逆的反应（由单向的箭头表示）
The donor vector harbors a cassette bounded by a wild-type FRT site (filled arrowhead) and a mutant FRT3 site (open arrowhead) in parallel orientation;
A promoter-free EYFP gene (open box) and a 1.6 kb homing sequence (gray box) from the Drosophila linotte locus are placed internally to the FLP recombinase recognition sites; The target line is transgenic for a cassette identical to the donor cassette except for the ECFP gene that is placed under control of the 3xP3 promoter; Recombination at either pair of FRT or FRT3 sites, mediated by FLP-recombinase-expressing helper vector, results in intermediate configurations containing an integration of the entire donor vector plasmid; Intermediates can be resolved to the original configuration by FLP excision reusing the identical target site pairs; Alternatively, FLP excision using the different target site pairs leads to cassette exchange; Due to the heterospecificity of FRT and FRT3 sites, the formation of the cassette exchange product is regarded as an irreversible reaction (symbolized by an unidirectional arrow)
图5 活体内的FLP重组酶介导的盒式交换[61]
Fig. 5 FLP recombinase-mediated cassette exchange in vivo
子控制的ECFP基因的盒式结构插入到果蝇染色体特定位点而形成转基因靶品系。在FLP辅助质粒（FLP helper）产生的FLP重组酶的介导下，供体质粒和靶品系染色体上的1对FRT（或FRT3）位点之间发生整合作用形成中间构型的重组品系。在FLP重组酶的作用下，中间构型能够经由与发生整合作用相同的FRT（或FRT3）位点对之间的切除反应返回原始构型，或者是经由与发生整合作用不同的FRT3（或FRT）位点对之间的切除反应而实现盒式交换。随后，Horn 等[61]还利用该技术的原理与方法，实现了piggyBac转座子一个臂的切除而获得稳定的外源基因定点插入的果蝇转基因系。基于FLP/FRT系统的RMCE技术，在果蝇中可有效消除插入位置效应对基因表达的影响，为果蝇的基因功能研究、不同蛋白表达研究等提供了一个良好的基础。
此外，FLP/FRT系统在果蝇中的广泛运用还有效地推动了其它相关领域技术的发展。在果蝇神经学研究领域，传统的高尔基染色法（Golgi staining method）无法对活体生物的神经元细胞进行标记，而且存在不能稳定地标记所有神经元细胞的轴突分支和细小的末端树突分支等局限性。Lee等发明了MARCM（mosaic analysis with a repressible cell marker，嵌合体可抑制细胞标记分析）技术[63]，这项技术依赖于FLP重组酶在果蝇细胞有丝分裂期间，介导2条同源染色体上的FRT位点之间发生重组，使分裂产生的子代纯合突变株细胞成为唯一一种被标记的细胞类型，进而产生单一类型的果蝇神经元标记细胞[64]。MARCM技术有效地克服了传统的高尔基染色法的诸多缺点，为神经系统特定区域神经末梢和单个神经元基因敲除表型分析的研究提供了便利[65]。目前该技术已经被广泛应用于果蝇发育方面的相关研究，特别是在果蝇神经学领域，MARCM技术已经成为这些研究领域必不可少的研究方法之一。
2.4 FLP/FRT系统在其它高等真核生物中的应用
FLP/FRT系统在诸如线虫（Caenorhabditis elegans）、爪蟾（Xenopus laevis）、斑马鱼（Danio rerio）等其它种类的高等真核生物也有较为广泛与深入的研究。
与果蝇类似，线虫也是一种很重要的在动物发育和生理学研究方面被广泛运用的模式生物。然而线虫的研究人员在基因激活的可控性方面一直缺乏有效的研究工具和手段。特别是对同一基因在不同类型或不同发育时期的线虫细胞中的功能研究方面，这一缺点表现得尤为明显。Davis等[66]发明了一种在线虫特定发育时期和特定类型细胞中，基于FLP重组酶删除（FLP-out）原理的控制任一基因表达的方法。首先构建含有双荧光蛋白报告基因（mCherry，红色荧光蛋白；GFP，绿色荧光蛋白）并能够在线虫体细胞中介导外源基因表达的载体系统：启动子（promoter）与目的基因（ORF，开放阅读框）被“间隔盒”（off cassette）序列所阻隔，GFP报告基因位于“间隔盒”与目的基因之间，“间隔盒”由位于侧翼的2个同向FRT位点所包含的mCherry报告基因和转录终止子（terminator）组成。在FLP重组酶作用之前，红色荧光用于显示启
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动子的启动活性和判断目的基因是否存在于预期的细胞类型，转录终止子则有效地阻断了GFP报告基因和目的基因的转录表达。利用热诱导型启动子或者组织特异型启动子，在线虫特定发育时期或特定组织细胞中诱导FLP重组酶表达，2个同向FRT位点之间的mCherry报告基因和转录终止子被FLP重组酶删除并形成1个环状分子，使启动子与目的基因迅速靠近和匹配，进而启动下游的GFP报告基因与目的基因的融合表达。GFP报告基因表达产生的绿色荧光蛋白指示出了目的基因特定表达的细胞，该方法能够用来研究在较宽的范围内时空特异性地表达单个基因，或者是在单一的细胞类型中连续地表达多种基因。为验证这项发明的可行性，Davis等[66]利用这一系统在线虫体内表达了一种能够阻滞神经传递的人造线虫类神经毒素（tetanus toxin，破伤风毒素）基因，通过在成虫的少量神经元细胞中检测这种基因的表达活力，发现这些细胞的功能被有效地阻滞了。同年，Voutev等[67]将这一“FLP-out”系统运用于线虫功能基因研究，有效地推动了这项新技术在线虫类生物中的广泛运用。值得注意的是，Davis等发明的“FLP-out”系统仅被运用于线虫染色体外实现外源基因表达的调控。直到2010年，Vázquez-Manrique等[68]才首次利用与产生基因敲除小鼠相似的原理和方法，借助同源重组的技术构建了基因敲除线虫，然后利用FLP重组酶在线虫体细胞染色体上实现了2个同向的FRT位点之间的选择标记基因的删除。
Werdien等[69]检测了FLP和Cre重组酶在爪蟾体内的重组活性。通过显微注射将编码产生FLP（或Cre）重组酶的mRNA注入爪蟾胚胎，FLP（或Cre）重组酶表达之后删除了2个同向FRT（或loxP）位点之间的绿色荧光蛋白报告基因（GFP）序列，进而诱导下游的LacZ基因表达。Ryffel等[70]经过进一步的比较证明，Cre重组酶在爪蟾体细胞中的重组效率要高于FLP 重组酶介导的重组，但无论是FLP还是Cre重组酶，在爪蟾体细胞中表达之后都不会对爪蟾正常的发育产生干扰。
为验证FLP/FRT系统在斑马鱼体内的重组活性，Wong等[71]建立了基因组中含有由肌肉特异性启动子（muscle-specific promoter）启动的EGFP基因表达框的斑马鱼转基因系。其中EGFP基因表达框序列的侧翼含有2个同向排列FRT位点。通过雄性杂合转基因斑马鱼与雌性野生型斑马鱼杂交获得受精卵，随后利用显微注射将FLPe编码的RNA导入发育至单细胞阶段的胚胎（受精卵）。胚胎发育48 h之后，观察到注射FLPe重组酶mRNA的胚胎中，发绿色荧光的胚胎比例为7.7%，远远低于阴性对照中发绿色荧光胚胎的预期比例（50%）。利用PCR检测FLPe介导重组反应前后，转基因斑马鱼胚胎基因中的插入序列。通过比较分析发现在FLPe重组酶作用之后，转基因斑马鱼胚胎基因组中2个同向排列FRT位点之间的EGFP 表达框被删除。该研究结果证实了改良耐热型FLPe 重组酶在斑马鱼体内也具有较高的重组活性。
3 FLP/FRT系统存在的问题及展望
3.1 克服重组过程可逆性，提高重组反应效率
FLP/FRT系统在高等真核生物中应用的广泛性，往往会因为该系统在某些种类的生物中较低的重组效率而受到影响。虽然利用改良耐热型FLP突变体能够提高重组酶在哺乳动物体内的酶活性，进而提高重组反应的效率，但是由于FLP重组酶精确的介导重组反应过程中FRT位点的断裂与重接，使FRT位点在反应前后均保持结构的完整性，所以FLP重组酶仍能识别重组反应之后的位点，逆向进行的反应将严重影响重组反应的效率。利用反向重复突变型FRT位点能够在一定程度上克服可逆性重组对重组效率的影响。但是如前文所述，FLP重组酶对反向重复突变型FRT位点较低的识别效率，在反应的初期即制约了重组反应的进行。通过瞬时表达或者诱导型启动子实现对FLP 重组酶表达的可控性，使FLP重组酶在重组反应之后失活或者使FLP重组酶基因被降解、抑制，都将有助于克服可逆性重组反应的发生。有报道称，向动物细胞显微注射重组酶mRNA或脂质体介导纯化的重组酶进入细胞，亦可达到使重组酶只具有暂时活性的目的[72]。
3.2 建立突变基础材料，推动功能基因研究发展
随着科学技术的不断发展，生物基因组的研究逐渐进入了后基因组即功能基因组研究时代。位点特异性重组技术作为基因功能研究的一项重要手段，通过定点改造基因组中特定基因，在细胞甚至个体水平上研究特定基因的功能和调控机制，日益受到科研工作者的重视。例如在转基因昆虫研究领域，一旦利用FLP/FRT系统结合转基因技术建立起一个定点突变转基因系，该突变位点便能成为供体质粒的一个稳定的接纳位点，待研究的外源基因将被定点整合进入该接纳位点，从而有效地克服位置效应对基因功能研究的影响。获得的定点突变细胞和基因突变型个体作为功
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能研究的基础材料，为阐明基因的功能提供了最直接的途径。
3.3 拓展实践研究领域，探求生命的本质
位点特异性重组技术作为新兴的遗传工具，无论是在理论研究还是在实践应用方面都有着广阔的前景。通过设计不同的方法来运用FLP/FRT系统，可以实现目的片段的插入（inserts）、切除（removal）、细菌人工染色体的线性化（linearization of bacterial artificial chromosomes）、生物素末端标记（biotin end labeling）、条件性诱变（conditional mutagenesis）、基因表达转换（gene expression switches）、染色体易位（chromosomal translocations）、重组酶介导的盒式交换（RMCE）、多用途等位基因的转化（conversions of multipurpose alleles）等多种基因操作。
在高等植物中应用FLP/FRT位点特异性重组系统来删除转基因植物中的标记基因，提高转基因作物的安全性，并且通过利用包括FLP/FRT系统在内的多个位点特异性重组技术发展起来的基因叠加（gene stacking）技术[73]来实现外源基因在植物基因组相同位点的高效叠加，将达到缩短新品种研发和市场化年限的目的，有利于转基因植物在世界范围内的推广。在转基因动物研究领域，利用诸如小鼠、果蝇等模式生物来建立人类疾病动物模型对临床及病理研究具有非常重要的作用，而利用FLP/FRT位点特异性重组技术能有效克服利用外源基因随机整合所带来的不确定性，缩短建立自发或诱发病理动物模型的时间。通过FLP/FRT位点特异性重组系统克服位置效应的影响，也将实现使有益昆虫外源蛋白的最优化表达，推动诸如家蚕[74]等昆虫作为蛋白质生物反应器的发展研究。此外，利用FLP/FRT系统建立的条件诱导型重组酶表达系统通过实现对基因靶位点时空上的精确调控，为分子遗传学、发育生物学、免疫学及医学等学科领域提供一个全新的研究手段。
总而言之，FLP/FRT位点特异性重组技术与转基因技术相结合应用于高等真核生物的研究领域，为人类探求生命的本质提供了强有力的工具。随着技术的不断发展与进步，FLP/FRT系统在后基因组时代基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗等多方面的生物技术应用领域，必将发挥重要的作用。
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（责任编辑岳梅）