透射电镜的样品制备 透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）． 透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤： ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直
接切割． ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来． ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ． ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等． 制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也
一种制备镁合金透射电镜样品的方法,涉及一种制备金属透射电镜薄膜样品的方法。其特征在于其制备过程是采用体积比组成为：硝酸8％-12％,甲醇或乙醇55％-65％,丙三醇或丙二醇或乙二醇25％-35％的电解液对试样进行电解液双喷法进行减薄的。在15-25V电压下电解双喷,温度控制在-35～-20℃之间。通过添加丙三醇并在低温电解可以有效避免电解液酸性过强, 而使样品表面氧化。该方法具有减薄过程无应力,减薄速率高,制备样品表面无腐蚀、薄区大等优点,非常适合于快速大量制备高质量镁合金薄膜样品。 一种制备镁合金透射电镜样品的方法,其特征在于其制备过程是采用体积比组成为：硝酸8％-12％,丙三醇或丙二醇或乙二醇25％-35％,余量为甲醇或乙醇的电解液对试样进行电解液双喷法进行减薄的。 一种制备镁合金透射电镜样品的方法 CN 101581640 B 摘要 一种制备镁合金透射电镜样品的方法，涉及一种制备金属透射电镜薄膜样品的方法。其特征在于其制备过程是采用体积比组成为：硝酸8％-12％，甲醇或乙醇55％-65％，丙三醇或丙二醇或乙二醇25％-35％的电解液对试样进行电解液双喷法进行减薄的。在15-25V电压下电解双喷，温度控制在-35～-20℃之间。通过添加丙三醇并在低温电解可以有效避免电解液酸性过强，而使样品表面氧化。该方法具有减薄过程无应力，减薄速率高，制备样品表面无腐蚀、薄区大等优点，非常适合于快速大量制备高质量镁合金薄膜样品。 权利要求(3) 1. 一种制备镁合金透射电镜样品的方法，其特征在于其制备过程是采用体积比组成为：硝酸8% -12%，丙三醇或丙二醇或乙二醇25%-35%,余量为甲醇或乙醇的电解液对试样进行电解液双喷法进行减薄的。 2.根据权利要求1所述的一种制备镁合金透射电镜样品的方法，其特征在于所述的试样的厚度为100μm，且双面剖光。 3.根据权利要求1所述的一种制备镁合金透射电镜样品的方法，其特征在于所述的进行电解液双喷法进行减薄的过程的电解电压为15-25V，温度为-35?-20°C。 说明 一种制备镁合金透射电镜样品的方法 技术领域 [0001] 一种制备镁合金透射电镜样品的方法，涉及一种制备金属透射电镜薄膜样品的方法。 [0002] 背景技术 [0003] 由于镁合金具有比重轻、强度高（镁合金的比强度高于铝合金和钢，略低于比强度最高的纤维增强塑料）、刚性好（比刚度与铝合金和钢相当，远高于
透射电镜样品制备方法 由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 一．取材的基本要求 组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。 （1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。 （2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。因为固定剂的渗 透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的 固定。 （3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。 （4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防
止细胞自溶。 （5）取材部位要准确。 二．取材方法 将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。 1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行） 动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的 小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的 1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以 上。 *固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。 2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行） 培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，
透射电镜样品制备流程 由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法： 一．负染色技术 负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。 样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。 二、超薄切片技术 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下： 1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。 2．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。
由透射电镜的工作原理可知，供透射电镜分析的样品必须对电子束是透明的；此外，所制得的样品还必须可以真实反映所分析材料的某些特征，因此，样品制备在透射电子显微分析技术中占有相当重要的位置，也是一个涉及面很广的题目。大体上透射电镜样品可分为间接样品和直接样品。我们下面将对间接样品的制备作简单介绍。 间接样品“复型”可以分为五步来进行： 第一步，在拟分析的样品表面滴一滴丙酮，将醋酸纤维素薄膜即A.C.纸覆盖其上，适当按压形成不夹气泡的一级复型； 第二步，待上述一级复型干燥后，小心地将其剥离，并将复制面向上平整地固定在玻璃片上； 第三步，将固定好复型地玻璃片连同一白瓷片置于真空镀膜室中，以垂直方向喷涂碳，以制备由塑料和碳膜构成地“复合复型”。白色瓷片表面在喷碳过程中颜色的变化可以表示碳膜的厚度。 第四步，将复合复型上要分析的区域剪为略小于样品台钢网的小方块后，使碳膜面朝里，贴在事先熔在干净玻璃片上的低熔点石蜡层上，石蜡液层冷凝后即把复合膜块固定在玻璃片上。将该玻璃片放入丙酮液中，复合复型的A.C.纸在丙酮中将逐渐被溶解，同时适当加热以溶解石蜡。
最后，待AC纸和石蜡溶解干净后，碳膜（即二级复型）将漂浮在丙酮液中，将其转移至清洁的丙酮液中清洗后，再转移至盛蒸馏水的器皿中。此时，由于水的表面张力，碳膜会平展地漂浮在水面，用样品铜网将其捞起，干燥后即可置于电镜下观察。 透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）． 透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤： ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直
机械切割→手工磨光→冲样→预减薄→最终减薄 1.机械切割： 将样品切成厚度为100～200微米的薄片；确定取样部位和试样的大小。为了防止组织的改变，切割时必须注意以下两点： （1）.防止切割时金属发生变形。 （2）.防止金属材料因受热引起组织的变化。 切割试样的工具有很多，比如手锯、锯床、砂轮切割机、显微切片机等。切割前应该根据试样的大小和材料的软硬，选择合适的方法切割。金属切样后的形状一般选择方柱形和圆柱形，其尺寸不宜过大或过小，尺寸太小，拿起来不太方便，且容易造成边缘缺陷和磨面不平坦；试样过大，研磨时耗费时间多，同样试样的磨面也易残留磨痕和其他缺陷。对于金属样品，一般采用线切割的方法。 2. 手工磨光： 金属试样机械切割后，表面都很粗糙且具有严重的变形层，故需要不同粒度的金相砂纸逐步磨光。 砂纸主要有两类： 1）干砂纸，是在干的条件下磨光，这类砂纸是刚玉砂纸，多半是混合刚玉磨料制成的砂纸，一般呈灰棕色。因为这类砂纸含有较软的相（Fe2O3），磨光时易碎化脱落，因此需要清理脱落的磨粒或更换砂纸；
2）水砂纸，在水冲刷的条件下使用最好。金属样品好像用的较少。手工磨光时，将砂纸铺在玻璃或平板上，将试样磨面轻压在砂纸上，并且向前推行，进行磨光，知道试样磨面仅留有一个方向的均匀磨痕为止。在磨光的回程中最好将试样提起拉回，步与砂纸接触。 磨光选用什么粒度的砂纸主要与磨平的试样表面的粗糙程度以及材料的软硬有关。磨光操作每更换细一号砂纸时，为了便于观察前一道砂纸留下的较粗磨痕的消除情况，磨面磨削的方向应该与前一号砂纸磨痕方向成90或45度。 3.冲样： 金属材料韧性比较好，可在冲样机上冲出直径为3mm的小圆片，也可用机械切片机（mechanical punch）将直径3mm薄圆片从材料上切下来。一个设计得很好的机械切片机只会在切下的小圆片的圆周上引起很小的损伤，但对某些材料机械切片时产生的冲击可造成剪切变形。 4.预减薄： 如果冲样前的试样磨得不是很好，此时可以在砂纸上再次手工研磨。然后再用凹坑减薄仪进行减薄。减薄后薄圆片样品出现一个碗状得凹坑，在碗得底部样品最薄，其它部分较厚，保证样品不易碎。
电镜样品制备步骤 1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年) 注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可 部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm） 2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min 3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min 注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察 4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min 再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差） 最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换） 注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。 5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小) ②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小) ③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥) 注：样品周围不能有气泡 6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。 7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm） 8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调 醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗 柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察 spurr包埋剂配制：ERL 2.5g NSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存 DER 2.5 g DMAE 0.1g 宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。Spurr树脂是嗜氧，聚合时不加盖 不同处理方法 7d后将培养基上的纤维素膜取出用水冲洗（除去膜表面杂质和残余培养基），浸泡于0.1mol/L浓度的NaoH溶液80℃保温一小时（去除非纤维结构和残余菌体），取出用去离子水冲洗至pH中性后干燥 碱煮：浸泡于0.1mol/L浓度的NaoH中，100℃煮沸30min，除去残留菌体与培养基杂质，再用0.5%的乙酸浸泡5min，后用水多次冲洗，至薄膜呈乳白色半透明，用吸水纸吸取表面水分，测试pH值，80℃干燥至恒重水煮：浸泡于蒸馏水中，100℃煮沸30min，后用水多次冲洗，用吸水纸吸取表面水分，测试pH值，80℃干燥至恒重 实验步骤 1，7d后将培养基上的纤维素膜取出用水冲洗，浸泡于0.1mol/L浓度的NaoH，取出冲洗后干燥 2，挖取一小块作为对照组A，电镜下观察微观结构 3，挖取两小块作为实验组B与C，分别碱煮与水煮，之后干燥，电镜下观察微观结构 实际应用 1，细菌纤维素有大表面积网状结构，因此具有很强抗压抗拉能力。（造纸，纸张耐折度与强度能够大幅度提高） 2，细菌纤维素内部有很多“孔道"，因而有良好的透水和透气性。（人造皮肤，创可贴，纱布，绷带）
透射电镜样品包埋块制作原理步骤 一、取材： 1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。 2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。 3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。 二、固定： 固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。 1.使用锇酸的注意事项： 锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS稀释成1%的锇酸溶液。 2.戊二醇 戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。 3.固定方法： 样本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。根据不同组织，可适当延长固定时间。由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。一般清洗3次，每次15min左右(或过夜)。 三、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂，如环氧树脂，大多都是非水溶性树脂，只 有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织，常用脱水剂是乙醇和丙酮。乙醇对细胞物质抽提少，组织收缩也少，但它和环氧树脂互溶性差，因此使用乙醇脱水时须用环氧丙烷作为中间溶剂。丙酮和酒精、环氧丙烷互溶，所以通常先用乙醇后再用丙酮的脱水方法。急剧脱水会引起细胞收缩，因此应采用逐级脱水 (50%-70%-90%-100%乙醇)而不能急剧脱水。更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%乙醇或丙酮中，并在4℃保存。 四、包埋 1.渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。一般可先用环氧丙烷对半稀释的包埋剂浸透1-2h，再用纯包埋剂37℃烤箱渗透2h左右。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。 2.包埋：目的是以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬固体。理想包埋剂应具备的条件：黏稠适中，有良好切割性；能经受电子轰击；透明度较好；对人体无害。目前常用国产环氧树脂618、Epon812环氧树脂、及低黏度包埋剂Spurr。 3.环氧树脂：环氧树脂为热塑性树脂，主要有两种化学反应基团，即环氧基和羟基。末端环氧基易与其他含活性氢原子化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。单体中羟基能与酸酐结合，形成分子间横桥连接。因此，把环氧树脂单体、胺类、酸酐等三者按一定比例混合，加上适当温度，可形成稳定的交链状聚合物。 包埋剂配制及使用过程中的注意事项： 1. 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的； 2.配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂； 3.配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。 4.常用树脂制方
透射电子显微镜样品制备技术 样品制备的方法随生物材料的类型以及研究目的而各有不同。对生物组织和细胞等，一般多用超薄切片技术，将大尺寸材料制成适当大小的超薄切片，并且利用电子染色、细胞化学、免疫标记及放射自显影等方法显示各种超微结构、各种化学物质的部位及其变化。对生物大分子（蛋白质、核酸）、细菌、病毒和分离的细胞器等颗粒材料,常用投影、负染色等技术以提高反差,显示颗粒的形态和微细结构。此外还有以冷冻固定为基础的冷冻断裂──冰冻蚀刻、冷冻置换、冷冻干燥等技术。 超薄切片术将小块生物材料，用液态树脂单体浸透和包埋，并固化成塑料块，后用超薄切片机切成厚度为500埃左右,甚至只有50埃的超薄切片。超薄切片的制备程序与光学显微镜的切片程序类似，但各步骤的要求以及所使用的试剂和操作方法有很大差别。 固定选用适宜的物理或化学的方法迅速杀死组织和细胞,力求保持组织和细胞的正常结构,并使其中各种物质的变化尽可能减小。固定能提高细胞承受包埋、切片、染色以及电子束轰击的能力。主要固定方法有： ①快速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他方法使生物材料急剧冷冻，使组织和细胞中的水只能冻结成体积极小的冰晶甚至无定形的冰──玻璃态。这样，细胞结构不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化学成分（如小分子有机物和无机离子）也不致流失或移位。用冷冻的组织块，可进行切片、冷冻断裂、冷冻干燥和冷冻置换等处理。用此法固定的样品既可提供组织、细胞结构的形态学信息，又可提供相关的细胞化学信息。②化学固定，固定剂有凝聚型和非凝聚型两种，前
者如光学显微术中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体,结构发生重大变化,常导致细胞的细微结构出现畸变。非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛类固定剂和四氧化锇，四氧化钼等，适用于电子显微。它们对蛋白质有较强的交联作用,可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚,避免了过分的结构畸变。它们与细胞蛋白质有较强的化学亲和力，固定处理后，固定剂成为被固定的蛋白质的一部分。如用含有重金属元素的固定剂四氧化锇（也是良好的电子染色剂）进行固定，因为锇与蛋白质结合，增强了散射电子的能力，提高了细胞结构的反差。采用一种以上固定剂的多重固定方法，如采用戊二醛和四氧化锇的双固定法，能较有效地减少细胞成分的损失。此外，固定剂溶液的浓度、pH 及所用的缓冲剂类型、渗透压、固定时间和温度等对固定效果都有不同程度的影响。 固定操作方法通常是先将材料切成1立方毫米左右小块，浸在固定液中，保持一定温度（通常为4℃）,进行一定时间的固定反应。取材操作要以尽可能快的速度进行，以减少组织自溶作用造成的结构破坏。对某些难以固定的特殊组织，如脑、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通过血管向组织内灌注固定液，使固定液在组织发生缺氧症或解剖造成损伤之前，快速而均匀地渗透到组织的所有部分。灌注固定的效果比浸没固定好得多。 脱水化学固定后，将材料浸于乙醇、丙酮等有机溶剂中以除去组织的游离水。为避免组织收缩，所用溶剂需从低浓度逐步提高到纯有机溶剂，逐级脱水。 浸透脱水之后，用适当的树脂单体与硬化剂的混合物即包埋剂，逐步替换组织块中的脱水剂，直至树脂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中。 包埋浸透之后,将组织块放于模具中,注入树脂单体与硬化剂等混合物，通
一、样品要求 1．粉末样品基本要求 （1）单颗粉末尺寸最好小于1μm； （2）无磁性； （3）以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪； 2．块状样品基本要求 （1）需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察； （2）如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察； （3）无磁性； （4）块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备；样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1．目的要明确：（1）做什么内容（如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等）；（2）希望能解决什么问题； 2．样品通过X-Ray粉末衍射（XRD）测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM；这样即可节省时间，又能在XRD 的基础上获得更多的微观结构信息。 3．做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的；同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。） 2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上； 3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微
试验材料为经过热处理后的钢材! 一、样品要求 1.粉末样品基本要求 (1)单颗粉末尺寸最好小于1μm; (2)无磁性; (3)以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪; 2.块状样品基本要求 (1)需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察; (2)如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察; (3)无磁性; (4)块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备;样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1.目的要明确：(1)做什么内容(如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等);(2)希望能解决什么问题; 2.样品通过X-Ray粉末衍射(XRD)测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM;这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。 3.做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的;同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1.选择高质量的微栅网(直径3mm)，这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步;(注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只;普通碳膜铜网免费提供使用。) 2.用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上(在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面)，轻轻平放在白色滤纸上; 3.取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上(如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。滴得太多，则粉末分散不开，不利于观察，同时粉末掉入电镜的几率大增，严重影响电镜的使用寿命;滴得太少，则对电镜观察不利，难以找到实验所要求粉末颗粒。建议由老师制备或在老师指导下制备。)
顶扣包埋：单层细胞透射电镜制样 细胞透射电镜样品的制备最常见的方法是先把贴壁的细胞酶解下来，然后离心成团，最终是对细胞团进行固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色，最后是电镜观察。然而有些细胞酶解下来时，会造成细胞内超微结构的改变，如贴壁生长的小鼠成纤维细胞细胞核中存在granule，胰酶消化会导致granule （如图一）的消失，这时需要一种原位处理的制样方法，也就是我们要介绍的顶扣包埋单层细胞透射电镜制样方法。 有些细胞对切片方向要求比较严格，细胞 的纤毛横截面，顶扣包埋会更适用, 可以 选用顶扣包埋。比如看到气管上皮能在一 个视野看到更多纤毛横截面（如 图二） 图一、小鼠成纤维细胞。箭头所指为 Granule 图二、气管上皮细胞纤毛
以活体皿（玻璃底）培养细胞为例，介绍顶扣包埋的具体操作方法： 1.PBS浸洗一次，10 min ； 2. 2.5%戊二醛固定，30 min； 3.PBS浸洗三次，每次10 min； 4.1%锇酸固定30 min ； 5.乙醇梯度脱水； 6.树脂渗透，树脂 7.聚合 注意：以上操作都在活体皿里进行，尽可能再空气干燥时制样，并做好防潮措施。 图三、活体皿中处理细胞，封口膜防潮 8.顶扣粘贴再聚合 A带玻璃底的活体皿，已完成聚合; B 40%的氢氟酸溶解玻璃底15 min,水洗，烘干; 图五、正在腐蚀活体皿的玻璃底
C从活体皿中取下圆形树脂块，单层细胞在树脂块里; 图六、圆形的树脂块 D分割圆形树脂块成小块; 图七、分割树脂块 E用液体树脂粘贴分割的小树脂块到空包埋块上（有细胞一面超外侧），然后再次聚合； 图八、粘贴树脂块 F修块，为超薄切片做准备; 图九、修块 9.超薄切片、染色和透射电镜观察。
实验二参观透射电子显微镜 时间：2015年12月1日 第一组：14:30-15:30 2013级金属材料工程专业一班 第二组：15:30-16:30 2013级金属材料工程专业二班地点：材料科学与工程学院一楼TEM室 讲解：龚伦军老师 实验二透射电镜结构原理、样品制备及观察 一、实验内容及实验目的 1．结合透射电镜实物介绍其基本结构及工作原理，以加深对透射电镜结构的整体印象，加深对透射电镜工作原理的了解。 2．掌握材料薄膜样品的制备方法—双喷电解减薄法和离子薄化法。 3．选用合适的样品，通过明暗场像操作的实际演示，了解明暗场成像原理。 4. 通过选区电子衍射的实际操作演示，加深对选区电子衍射原理的了解。 二、透射电镜的基本结构及工作原理 透射电子显微镜是一种具有高分辨率、高放大倍数的电子光学仪器，被广泛应用于材料科学等研究领域。透射电镜以波长极短的电子束作为光源，电子束经由聚光镜系统的电磁透镜将其聚焦成一束近似平行的光线穿透样品，再经成像系统的电磁透镜成像和放大，然后电子束投射到主镜简最下方的荧光屏上而形成所观察的图像。在材料科学研究领域，透射电镜主要可用于材料微区的组织形貌观察、晶体缺陷分析和晶体结构测定。 透射电子显微镜按加速电压分类，通常可分为常规电镜(100kV)、高压电镜(300kV)和超高压电镜(500kV以上)。提高加速电压，可缩短入射电子的波长。一方面有利于提高电镜的分辨率；同时又可以提高对试样的穿透能力，这不仅可以放宽对试样减薄的要求，而且厚试样与近二维状态的薄试样相比，更接近三维的实际情况。就当前各研究领域使用的透射电镜来看，其主要三个性能指标大致如下： 加速电压：80～3000kV 分辨率：点分辨率为0.2～0.35nm、线分辨率为0.1～0.2nm 最高放大倍数：30～100万倍
?透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。 ?由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。 ?根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。 透射电镜样品的要求： ?1. 样品必须对电子束透明。 ?2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。 主要方法： 粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。
?透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。 ?透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。
样品铜网的作用： ?承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。 ?样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。 样品台
透射电子显微镜样品制备 电镜观察时样品受到的影响： (1)真空的影响。含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观 察。 (2)电子损伤的影响。试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子 束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。 (3)电子束透射能力的影响。由于电子束透射能力较弱，一般 100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。
粉末样品制备 ?随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。 ?其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。
T E M制样方法及详细步 骤 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
由透射电镜的工作原理可知，供透射电镜分析的样品必须对电子束是透明的；此外，所制得的样品还必须可以真实反映所分析材料的某些特征，因此，样品制备在透射电子显微分析技术中占有相当重要的位置，也是一个涉及面很广的题目。大体上透射电镜样品可分为间接样品和直接样品。我们下面将对间接样品的制备作简单介绍。 间接样品“复型”可以分为五步来进行： 第一步，在拟分析的样品表面滴一滴丙酮，将醋酸纤维素薄膜即 A.C.纸覆盖其上，适当按压形成不夹气泡的一级复型； 第二步，待上述一级复型干燥后，小心地将其剥离，并将复制面向上平整地固定在玻璃片上； 第三步，将固定好复型地玻璃片连同一白瓷片置于真空镀膜室中，以垂直方向喷涂碳，以制备由塑料和碳膜构成地“复合复型”。白色瓷片表面在喷碳过程中颜色的变化可以表示碳膜的厚度。 第四步，将复合复型上要分析的区域剪为略小于样品台钢网的小方块后，使碳膜面朝里，贴在事先熔在干净玻璃片上的低熔点石蜡层上，石蜡液层冷凝
后即把复合膜块固定在玻璃片上。将该玻璃片放入丙酮液中，复合复型的A.C.纸在丙酮中将逐渐被溶解，同时适当加热以溶解石蜡。 最后，待AC纸和石蜡溶解干净后，碳膜（即二级复型）将漂浮在丙酮液中，将其转移至清洁的丙酮液中清洗后，再转移至盛蒸馏水的器皿中。此时，由于水的表面张力，碳膜会平展地漂浮在水面，用样品铜网将其捞起，干燥后即可置于电镜下观察。 透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真． 电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）．透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备． （１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可． （２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类
透射电镜试样制备 一、样品要求 1.粉末样品基本要求 (1)单颗粉末尺寸最好小于1μm; (2)无磁性; (3)以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪; 2.块状样品基本要求 (1)需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察; (2)如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察; (3)无磁性; (4)块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由经验的老师指导或制备;样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。所以块状样品制备之前，最好与TEM的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。 二、送样品前的准备工作 1.目的要明确：(1)做什么内容(如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等);(2)希望能解决什么问题; 2.样品通过X-Ray粉末衍射(XRD)测试、并确定结构后，再决定是否做HRTEM;这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。 3.做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的;同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。 三、粉末样品的制备 1.选择高质量的微栅网(直径3mm)，这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步;(注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只;普通碳膜铜网免费提供使用。) 2.用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上(在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面)，轻轻平放在白色滤纸上; 3.取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上(如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。滴得太多，则粉末分散不开，不利于观察，同时粉末掉入电镜的几率大增，严重影响电镜的使用寿命;滴得太少，则对电镜观察不利，难以找到实验所要求粉末颗粒。建议由老师制备或在老师指导下制备。) 4.等15 min以上，以便乙醇尽量挥发完毕;否则将样品装上样品台插入电镜，将影响电镜的真空。 四、块状样品制备 1.电解减薄方法 用于金属和合金试样的制备。(1)块状样切成约0.3mm厚的均匀薄片;(2)用金刚砂纸机械
一．取样 在平板上选取不同位置组织，用小刀切取1*2mm2的长方形样品。 Ps：取样时小心进行，切勿触碰样品表面，样品的培养基需全部刮除。 二．前固定 不同样品分别放入装有1mL2.5%戊二醛的1.5豪升的离心管中，常温固定5-6小时后于4℃冰箱中保存过夜。 Ps：戊二醛挥发性强，对人体有害。请于通风橱中进行。 三．冲洗 取出样品，立即放入装有1mL 0.1M PBS缓冲液的1.5豪升的离心管中，10分钟后换新PBS缓冲液，重复7-8次。 Ps：整个实验过程中，溶液加入量均不超过1mL。 四．后固定 取冲洗后的样品，立即放入装有按比例1 : 1（PBS 30uL: 锇酸30uL）配好的锇酸溶液的1.5豪升的离心管中，常温固定1-2小时。 Ps：锇酸挥发性强，对人体有害。请于通风橱中进行。 五．冲洗 取出样品，立即放入装有1mL 0.1M PBS缓冲液的1.5豪升的离心管中，10分钟后换新PBS缓冲液，重复7-8次。 Ps：锇酸废液放入制定回收瓶中，切勿乱倒。 六．梯度脱水 配好浓度分别为：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇，吸出1.5豪升的离心管中的PBS缓冲液，按浓度顺序加入梯度乙醇，每一级浓度乙醇脱水10min，最后100%乙醇重复2-3次，保证样品绝对无水。 Ps：操作过程中切勿伤及样品，各个梯度乙醇现配现用。 七．置换 吸除1.5豪升的离心管中的100%乙醇，加入100%丙酮，持续置换10min，重复3次。 Ps：丙酮以及上一步的无水乙醇都需要现开现用，以防浓度变化，影响结果。 八．浸透 吸除离心管中的丙酮，按照总体积80uL，Spurr树脂:丙酮（1:3）的比例，将混液加入样品管中。间隔8小时以上，加入总体积80uL，Spurr树脂:丙酮（1:1）比例的混液。间隔8小时以上，加入总体积80uL，Spurr树脂:丙酮（3:1）比例的混液。即终体积为240uL。 Ps：一个样品一个样品的在干燥环境中操作，以防止样品受潮，同时操作过程中切勿伤及样品，下同。 九．摆放样品并聚合 按照样品数量在聚合板上的样品槽中加入纯Spurr树脂，将浸透液中的样品小心取出，放在样品槽靠边位置（方便切片）。聚合板放在70℃烘箱中聚合。 十．制备切片 切片捞在100目0.3%Formvar膜覆盖的镍网上。 十一．染色 染色：用2%的醋酸铀25摄氏度染色10min，用重蒸水洗3次，每次20min 再用柠檬酸铅25摄氏度染色5min，用重蒸水洗3次，每次20min。 十二．电镜观察