（生物科技行业）生物化学免费辅导讲义蛋白质
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第壹章蛋白质化学
本章结构简图
蛋白质
壹、蛋白质的功能多样性
蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。自然界中最小、最简单的生物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。没有蛋白质也就没有生命。自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多。概括起来，蛋白质主要有以下功能：
1.催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有酶，
生物体内的各种化学反应就无法正常进行。例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。
2.结构功能蛋白质能够作为生物体的结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细胞外结构蛋白，参和结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的1/4。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白和脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。
3.运输功能脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。壹些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要和甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。
4.贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。
5.运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。
6.防御功能高等动物的免疫反应是机体的壹种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血和纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。
7.调节功能某些激素、壹切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。
8.信息传递功能生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传递有视紫红质参和，感受味道需要味觉蛋白。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。
9.遗传调控功能遗传信息的储存和表达都和蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，和特定基因的表达有关。β－半乳糖苷酶基因
的表达受到壹种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。
10.其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。如某些植物在被昆虫咬过以后会产生壹种毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。
二、蛋白质的水解【常见考点】
氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发现是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水解主要有三种方法：
1.酸水解用6MHCl或4MH2SO4，105℃回流20小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。用3mol/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸壹样用外推法求其含量。
2.碱水解用5MNaOH，水解10－20小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。
3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。壹般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。
第二节氨基酸
一、20种氨基酸简述
名称英文三字
符单字
符
结构特性
甘氨酸glycine Glu G 无手性C 丙氨酸alanine Ala A
缬氨酸valine Val V 大脂肪侧链
亮氨酸leucine Leu L
异亮氨酸isoleucine Ile I
甲硫氨酸methionin
e
Met M
脯氨酸proline Pro P 唯壹成环氨基酸，氨基酸的侧
链既和碳原子结合又和
氨基N-原子结合，缺少
H-bonddonor，无法形成α螺
旋结构
苯丙氨酸phenylala
nine
Phe F 侧链有芳香环,疏水氨基酸
酪氨酸tyrosine Tyr Y 酪氨酸的芳香环有壹个羟基。
和其他氨基酸侧链呈化学惰性
相比，酪氨酸的羟基有化学反
应性，疏水性弱。
色氨酸tryptopha
n Trp W 吲哚基团替代丙氨酸侧链的氢
原子。吲哚基团有的俩个环融
合在壹起，壹个环有NH基团。
有NH故疏水性弱。
丝氨酸serine Ser S 侧链有极性但不带电荷。侧链
有羟基和脂肪链相连。亲水，
其反应活性比丙氨酸和缬氨酸
大得多。
苏氨酸threonine Thr T 侧链有极性但不带电荷。侧链
有羟基和脂肪链相连。亲水，
其反应活性比丙氨酸和颉氨酸
大得多。有第二个不对称碳原
子，但蛋白质的苏氨酸只有壹
种构型。
天冬酰胺asparagin
e Asp A 极性但不带电荷。含酰胺的极
性氨基酸
谷氨酰胺glutamine Gln Q 极性但不带电荷。含酰胺的极
性氨基酸
半胱氨酸cysteine Cys C 极性不带电。结构上类似苏氨
酸，可是用巯基替代了羟基。
巯基比羟基活泼。壹对巯基靠
近能够形成二硫键，稳定蛋白
质的结构。
赖氨酸lysine Lys K 带电荷的氨基酸，高度亲水，
侧链长，末端是氨基，在中性
pH时侧链末端带正电荷。
精氨酸arginine Arg R 带电荷，高度亲水，侧链长，
末端是胍基，在中性pH时侧
链末端带正电荷。
组氨酸histidine His H 带电荷，高度亲水，侧链含有
咪唑基，咪唑基是芳香环，可
质子化后带正电荷。咪唑的
pKa值接近于6，在中性pH
附近的溶液中咪唑基既可质子
化也可不带电荷，取决于咪唑
基团所在的局部环境。组氨酸
常在酶的活性中心。在酶促反
应中咪唑环既可结合质子，又
可释放质子。
天冬氨酸aspartate Asp D 酸性氨酸。常被称为天冬氨酸
盐，主要是强调在生理pH溶
液中侧链基团解离，因此带负
电荷。在有些蛋白质中这俩种
氨基酸的作用是接受质子，对
蛋白质功能起重要作用。
谷氨酸glutamate Glu E 酸性氨酸。主要是强调在生理
pH溶液中侧链基团解离，因
此带负电荷。在有些蛋白质中
1.按照R基的化学结构分类
（1）R为脂肪烃的氨基酸（5种）：Gly、Ala、Val、Leu、Ile
A.R基为中性烷基（Gly为H），对分子酸碱性影响很小，几乎有相同的等电点（6.0）
B.从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile是这20种3氨基酸中脂溶性最强的之壹（除Phe2.5、Trp3.4、Tyr2.3以外）
C.壹般位于在蛋白质内部，侧链不被修饰
（2）R中含有羟基的氨基酸（2种）：Ser和Thr
A.Ser的-OH基是极性基团，易和其它基团形成氢键，具有重要的生理意义，在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基
B.Thr中的-OH是仲醇，具有亲水性，但形成氢键的能力较弱，在酶的活性中心很少出现
（3）R中含硫的氨基酸（2种）：Cys、Met
A.Cys（半胱氨酸）R中含巯基-SH俩个Cys的-SH氧化生成二硫键，生成胱氨酸。Cys-SH+Cys-SH——Cys-S-S-Cys，二硫键利于蛋白质结构的稳定
B.Met中含有甲硫基（-S-CH3）在生物合成中是壹种重要的甲基供体
（4）R中含有acidicgroup的氨基酸（2种）：Asp、GluAsp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86；Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25它们在生理条件下带有负电荷
（5）R中含有酰胺基团的氨基酸（2种）：Asn、Gln
易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义。
（6）R中含氨基的氨基酸（2种）：Basicaminoacids，Lys、Arg
A.Lys的R侧链上含有壹个氨基，pKa为10.53，生理条件下Lys侧链带有壹个正电荷。此外，它的侧链有4个C，柔性较大，使侧链氨基的反应活性增大
B.Arg是碱性最强的氨基酸，pKa为12.48，生理条件下完全质子化
（7）R中含有芳香基的氨基酸（2种）：Phe、Tyr
都具有共轭π电子体系，易和其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物(charge-transfercomplex)，在分子相互识别过程中具有重要作用。
这2种氨基酸在紫外区有特征吸收峰。
（8）R为杂环的氨基酸（3种）：Trp、His、Pro
A.在280nm，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱
B.His的咪唑环pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的壹种，在接近中性pH时，可离解平衡，具有缓冲能力
C.Pro是唯壹的壹种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的壹部分，因此具有特殊的刚性结构。多肽链中，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用。
2.按照R基的极性能够分为4类
（1）非极性氨基酸Nonpolaraminoacids（8种）
Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro，在水中溶解度较小，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
（2）不带电荷的极性氨基酸Polar,unchargedaminoacids（7种）
Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly，这类氨基酸的侧链都能和水形成氢键，因此很容易溶于水。
（3）带负电荷的氨基酸（酸性氨基酸）Acidicaminoacids（2种）：Glu和Asp
（4）带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）Basicacids（3种）Arg、Lys、His 非极性氨基酸壹般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于蛋白质表面。酶的活性中心：His、Ser
二、肽peptide
（壹）肽和肽键的结构
壹个氨基酸的α羧基和另壹个氨基酸的α氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单
位称氨基酸残基。
肽键：氨基酸间脱水后形成的酰氨键。俩个氨基酸形成的肽——二肽。少于10个氨基酸
的肽——寡肽。多于10个氨基酸的肽——多肽。
肽键的结构特点：（1）酰胺氮上的孤对电子和相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性，６个原子几乎处在同壹平面内（酰氨平面）。
（3）肽键亚氨基在pH0-14内不解离
（4）肽链中的肽键壹般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反俩种构型
（二）肽的重要性质
1.旋光性：壹般短肽的比旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和
2.肽的酸碱性质
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离。肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ2
和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。在长肽或protein中，可解离的基团主要是sidegroups（侧基）。
3.肽的化学反应
肽的α-羧基，α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生和游离氨基酸相似的反应。凡是
有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定性、定量分析。
双缩脲反应是peptide和protein特有的反应，游离氨基酸无此反应。CuSO4和双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色复合物。
（三）天然存在的活性肽
活性肽：生物体内有很强生物活性的寡肽或多肽
1.谷胱甘肽Glu—Cys—Gly
在细胞内参和氧化仍原过程，清除内源性过氧化物和自由基。维护protein活性中心的巯基处于仍原状态。
2GSH——GS—SG
H2O2+2GSH——2H2O+GS—SG
2.短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环，抗菌。
L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Va
Orn－鸟氨酸
3.脑啡肽（5肽，具有镇痛作用，已发现几十种。）
Met---脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
Leu---脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
4.生物体内寡肽的来源：
（1）合成蛋白质的剪切、修饰
（2）酶专壹性逐步合成（如谷胱甘肽）
（3）动物肠道可吸收寡肽
三、Sequenceprimarystructure（壹级结构序列，共价结构）
壹级结构意义：protein壹级结构（序列）中含有形成高级结构全部必需的信息，壹级结构决定高级结构及功能。
推断：氨基酸序列（壹级结构）——空间结构
预测：空间结构（高级结构）——功能
蛋白质测序步骤
（壹）protein测序的壹般步骤
1.测定protein分子中多肽链的数目
2.拆分protein分子中的多肽链
3.测定多肽链的氨基酸组成
4.断裂链内二硫键
5.分析多肽链的N末端和C末端
6.多肽链部分裂解成肽段
7.测定各个肽段的氨基酸顺序
8.确定肽段在多肽链中的顺序
9.确定多肽链中二硫键的位置
（二）protein测序的基本策略
对于壹个纯protein，理想的方法是从N端直接测至C端，目前只能测60个N端氨基
酸。
1.直接法（测protein的序列）
俩种之上特异性裂解法：
NC
A法裂解A1A2A3A4
B法裂解B1B2B3B4
2.间接法（测定核酸序列，推断氨基酸序列）
（三）测序前的准备工作
1.protein的纯度及均壹性鉴定
要求：纯度97%之上，均壹
俩种之上纯度鉴定方法才可靠
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求壹条带
⑵DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）测N端氨基酸
2.测定分子量
用于估算氨基酸残基数n=M/110
方法：SDS-PAGE、凝胶过滤法、沉降系数法、渗透压法
3.确定亚基种类及数目
⑴拆离四级结构：SDS-PAGE测亚基分子量，8mol/L尿素，SDS
⑵拆离二硫键
过甲酸氧化—S—S—+HCOOOH→—SO3H或β巯基乙醇仍原
举例：血红蛋白(α2β2)
分子量：M拆亚基：M1、M2俩条电泳带拆二硫键：M1、M2俩条电泳带
分子量关系：M=2M1+2M2
4.测定氨基酸组成
酸水解、碱水解
确定肽链中各种氨基酸出现的频率，便于选择裂解方法及试剂
5.端基分析
①N端分析
DNS-Cl法：黄绿色荧光，灵敏度高，薄层层析，方法简便
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，液相色谱等
PITC法：Edman法，逐步切下，无色PTH-氨基酸，液相色谱分析
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH
无水肼NH2NH2，100℃，5-10h
A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，
Gln、Asn、Cys、Arg不能用此方法
B．羧肽酶法（Pro不能用此方法）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
（四）肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1.化学裂解法
①溴化氰—Met—X—产率85%
②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%
③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
④羟胺NH2OH—Asn—Gly—约150个_______氨基酸出现壹次
2.酶法裂解
①胰蛋白酶Lys—X(X≠Pro)，Arg—X__②胰凝乳蛋白酶Tyr—X(X≠Pro)
Trp—X，Phe—X
③胃蛋白酶
Phe(Trp、Tyr、Leu)—Phe(Trp、Tyr、Leu)
③Glu蛋白酶Glu—X
④Arg蛋白酶Arg—X
⑤Lys蛋白酶X—Lys
⑥Pro蛋白酶Pro—X
3.肽段的分离纯化
①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）：根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法：根据肽段的极性分离
④凝胶过滤根据分子量大小分离
4.肽段纯度鉴定
分离得到的每壹个肽段，需分别鉴定纯度。常用ＤＮＳ－Cl法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单壹
（五）肽段的序列测定及肽链的拼接
1.Edman法：壹次水解壹个Ｎ端氨基酸
（1）耦联PITC＋H２N—A-B-C-DpH8-9，40℃
——PTC—A-B-C-D
（2）裂解PTC—A-B-C-D+TFA无水三氟乙醇
——ATZ—A+H2N—B-C-D
（3）转化ATZ—A——PTH—A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（-氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（-氨基酸）
2.DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段
Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
3.有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂
4.自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60－70肽
1967液相测序仪，自旋反应器，适于大肽段
1971固相测序仪，表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端1981气相测序仪，用Polybrene反应器（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol20-40肽97%
气相：5pmol60肽98%
5.肽段拼接成肽链
16肽，N端H，Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT
Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS
（六）二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定
1.二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解protein
第壹向电泳：过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳：分离出含二硫键的俩条短肽，测序。
和拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2.酰胺的确定
Asp—Asn、Glu—Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp仍是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln
3.糖、脂、磷酸基团位置的确定
糖类通过Asn、Ser和protein连接，-N-糖苷-0-糖苷
脂类：Ser、Thr、Cys
磷酸：Ser、Thr、His
经验性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)，Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)
氨基用叔丁氧甲酰基（BOC）保护
C端→N端
挂接→去保护→中和→缩合→（去保护→中和→缩合）n→多肽__第三节蛋白质的高级结构
壹、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
（壹）肽链的构象（conformation）
多肽链上α-碳原子都参和形成单键，壹个多肽主链可能有无限多种构象。
已知壹个蛋白质的多肽链在生物体内只有壹种或很少几种稳定构象，这种构象称天然构象。天然构象蛋白质具有生物活性，主链上的单键不能自由旋转。
1.肽链的二面角（dihedralangle）
α碳原子连接的俩个键（α-N1和α-C2）是单键，能自由旋转。
绕α—N1键旋转的角度为Φ绕α—C2键旋转的角度称Ψ
当Φ的旋转键Cα-N1俩侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2俩侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1见，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2见，顺时针旋转Cα-C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
2.多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在。
二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于俩个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小和带电性影响Φ和Ψ。
蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子（non-covelently-bondedatom）间的最
小接触距离，确定了哪些二面角（Φ、Ψ）所确定的俩个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，且且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
⑴实线封闭区域（壹般允许区）：非键合原子间的距离大于壹般允许距离，此区域内任何二
面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域（最大允许区）：非键合原子间的距离介于最小允许距离和壹般允许距离之间，立体化学允许但构象不够稳定。
⑶虚线外区域（不允许区）：该区域内任何二面角确定的肽链构象非键合原子间距离小于最小允许距离。
（二）二级结构的基本类型：
驱使蛋白质折叠的主要动力－熵效应主要有俩点：第壹暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。第二要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1.α螺旋（α-helix）
（1）特征：多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都有相同的二面角Φ、Ψ。
①二面角Φ=-57°,Ψ=-48°，右手螺旋；
②每圈3.6个氨基酸残基，高度0.54nm；
③每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm；
④氨基酸残基侧链向外；
⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎和中心轴平行；肽键上N-H氢和它后面（N
端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键
典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括
13个原子。封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
（2）R侧链对α-螺旋稳定性的影响
一、选择题 1．下列有关mRAN的论述，正确的一项是（） A、mRNA是基因表达的最终产物 B、mRNA遗传密码的阅读方向是3′→5′ C、mRNA遗传密码的阅读方向是3′→5′ D、mRNA密码子与tRNA反密码子通过A-T，G-C配对结合 E、每分子mRNA有3个终止密码子 2．下列反密码子中能与密码子UAC配对的是（） A、AUG B、AUI C、ACU D、GUA 3．下列密码子中，终止密码子是（） A、UUA B、UGA C、UGU D、UAU 4．下列密码子中，属于起始密码子的是（） A、AUG B、AUU C、AUC D、GAG 5．下列有关密码子的叙述，错误的一项是（） A、密码子阅读是有特定起始位点的 B、密码子阅读无间断性 C、密码子都具有简并性 D、密码子对生物界具有通用性 6．密码子变偶性叙述中，不恰当的一项是（） A、密码子中的第三位碱基专一性较小，所以密码子的专一性完全由前两位决定 B、第三位碱基如果发生了突变如A G、C U，由于密码子的简并性与变 偶性特点，使之仍能翻译出正确的氨基酸来，从而使蛋白质的生物学功能不变 C、次黄嘌呤经常出现在反密码子的第三位，使之具有更广泛的阅读能力，（I-U、I-C、I-A）从而可减少由于点突变引起的误差 D、几乎有密码子可用或表示，其意义为密码子专一性主要由头两个 碱基决定 7．关于核糖体叙述不恰当的一项是（） A、核糖体是由多种酶缔合而成的能够协调活动共同完成翻译工作的多酶复合体 B、核糖体中的各种酶单独存在（解聚体）时，同样具有相应的功能 C、在核糖体的大亚基上存在着肽酰基（P）位点和氨酰基（A）位点 D、在核糖体大亚基上含有肽酰转移酶及能与各种起始因子，延伸因子，释放因 子和各种酶相结合的位点 8．tRNA的叙述中，哪一项不恰当（） A、tRNA在蛋白质合成中转运活化了的氨基酸 B、起始tRNA在真核原核生物中仅用于蛋白质合成的起始作用 C、除起始tRNA外，其余tRNA是蛋白质合成延伸中起作用，统称为延伸tRNA D、原核与真核生物中的起始tRNA均为fMet-tRNA 9．tRNA结构与功能紧密相关，下列叙述哪一项不恰当（） A、tRNA的二级结构均为“三叶草形” B、tRNA3′-末端为受体臂的功能部位，均有CCA的结构末端 C、TyC环的序列比较保守，它对识别核糖体并与核糖体结合有关
第一章蛋白质的结构与功能 [测试题] 一、名词解释：1．氨基酸 2．肽 3．肽键 4．肽键平面 5．蛋白质一级结构 6．α-螺旋 7．模序 8．次级键 9．结构域 10．亚基 11．协同效应 12．蛋白质等电点 13．蛋白质的变性 14．蛋白质的沉淀 15．电泳 16．透析 17．层析 18．沉降系数 19．双缩脲反应 20．谷胱甘肽 二、填空题 21．在各种蛋白质分子中，含量比较相近的元素是____，测得某蛋白质样品含氮量为15.2克，该样品白质含量应为____克。 22．组成蛋白质的基本单位是____，它们的结构均为____，它们之间靠____键彼此连接而形成的物质称为____。 23．由于氨基酸既含有碱性的氨基和酸性的羧基，可以在酸性溶液中带____电荷，在碱性溶液中带____电荷，因此，氨基酸是____电解质。当所带的正、负电荷相等时，氨基酸成为____离子，此时溶液的pH值称为该氨基酸的____。 24．决定蛋白质的空间构象和生物学功能的是蛋白质的____级结构，该结构是指多肽链中____的排列顺序。25．蛋白质的二级结构是蛋白质分子中某一段肽链的____构象，多肽链的折叠盘绕是以____为基础的，常见的二级结构形式包括____，____，____和____。 26．维持蛋白质二级结构的化学键是____，它们是在肽键平面上的____和____之间形成。 27．稳定蛋白质三级结构的次级键包括____，____，____和____等。 28．构成蛋白质的氨基酸有____种，除____外都有旋光性。其中碱性氨基酸有____，____，____。酸性氨基酸有____，____。 29．电泳法分离蛋白质主要根据在某一pH值条件下，蛋白质所带的净电荷____而达到分离的目的，还和蛋白质的____及____有一定关系。 30．蛋白质在pI时以____离子的形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以____离子形式存在，在pH 实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH 三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2 滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。 蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型： ●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。 生物化学-蛋白质化学练习含答案 第三章蛋白质化学练习卷 一、填空题 (一)基础知识填空 1. 组成蛋白质的碱性氨基酸 有、 和。酸性氨基酸有 和。 2. 在下列空格中填入合适的氨基酸名称。 (1) 是带芳香族侧链的极性氨基酸。 (2) 和是带芳香族侧链的非极性氨基酸。 (3) 和是含硫的氨基酸。 (4) 是最小的氨基酸， 是亚氨基酸。 (5)在一些酶的活性中心起重要作用并 含有羟基的分子量较小的氨基酸 是，体内还有另两个含羟基的氨基酸分别是 和。 3. 氨基酸在等电点时，主要以 离子形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以离子形式存在，在 pH 6. 个以内的氨基酸残基所组 成的肽称为寡肽。 7. 1953年维格诺尔德（D. Vingneaud） 第一次用化学法合成了具有生物活性 的肽—，因而获得诺贝尔奖。 9. 人工合成肽时常用的氨基保护基有、、、 。 10. 胰蛋白酶能水解和 的氨基酸的羧基所形成的肽键。 11. 胰凝乳蛋白酶能水解、 和的氨基酸的羧基侧所形成的肽键。 12. 溴化氰能水解羧基侧所 形成的肽键。13. 拆开蛋白质分子中二硫键的常用的 方法有一种还原法，其常用的试剂 是。 14. 蛋白质之所以出现各种无穷的构象 主要是因为键和键 能有不同程度的转动。 15. Pauling等人提出的蛋白质α螺旋模型，每圈螺旋包含 氨基酸残基，高度为 nm。每个氨基酸残基上升 nm。 16. 一般来说，球状蛋白质的 性氨基酸侧链位于分子内部， 性氨基酸侧链位于分子表面。 17. 维持蛋白质一级结构的化学键是 和。 18. 维持蛋白质二级结构的化学键 是。 3 生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月 实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆 2．移液管的使用： 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3．离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 4．分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 5．水浴锅的使用 三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写） 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论 实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾－碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 （一）淀粉酶的观察 1、取3支大试管，编号后按表操作 2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应 植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.doczj.com/doc/c22253675.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨 简单蛋白质：完全由氨基酸构成的蛋白质 结合蛋白质：由AAs和其他非蛋白质化合物所组成 球状蛋白质：多肽链能够折叠，使分子外形成为球状的蛋白质。 纤维状蛋白质：能够聚集为纤维状或细丝状的蛋白质。主要起结构蛋白的作用，其多肽链沿一个方向伸展或卷曲，其结构主要通过多肽链之间的氢键维持。 单体蛋白质：仅含有AAs 寡聚蛋白质：由两个以上、十个以下亚基或单体通过非共价连接缔合而成的蛋白质。 等电点：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。符号为pI。 氨基酸残基：在多肽链中的氨基酸，由于其部分基团参与了肽键的形成，剩余的结构部分则称氨基酸残基。它是一个分子的一部分，而不是一个分子。氨基酸的氨基上缺了一个氢，羧基上缺了一个羟基。简单的说，氨基酸残基就是指不完整的氨基酸。一个完整的氨基酸包括一个羧基（—COOH)，一个氨基(—NH2)，一个H，一个R基。缺少一个部分都算是氨基酸残基,并没有包括肽键的。 钛键：氨基和羧基脱去一分子水形成的化学键。 钛键平面：肽键所在的酰胺基成为的刚性平面。由于肽键具有部分双键性质，使得肽基的六个原子共处一个平面，称为肽平面。 同源蛋白质：在不同有机体中实现同一功能的蛋白质。（结构和功能类似的蛋白质。） 蛋白质一级结构：蛋白质多肽链的氨基酸通过肽键连接形成的线性序列。 蛋白质二级结构：指多肽链借助H键折叠盘绕成沿一维方向具有周期性结构的构象。 构象：分子的三维结构即分子中的所有原子在空间的位置总和。 构型：分子中的原子在空间的相对取向。 α-螺旋：它是蛋白质当中最为常见、最丰富的二级结构。多肽主链沿中心轴盘绕成右手或左手螺旋；每个螺旋周期有3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm，螺旋直径0.5nm；氨基酸残基侧链伸向外侧；同一肽链上的每个残基的酰胺氢原子和位于它后面的第4个残基上的羰基氧原子之间形成氢键，并且与螺旋轴保持大致上的平行。此外，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部氢键，也能与水分子形成外部氢键。 β-折叠：常见的蛋白质的二级结构之一。呈片状,肽链主链取锯齿状折叠构象；肽链走向可能是平行的，也可能是反平行的。两条或多条肽链之间侧向聚集在一起，相邻多肽链羰基氧和酰胺氢之间形成氢键，氢键与肽链的长轴几乎呈直角；侧链R基交替分布于片层平面两侧。 β-转角：它大多分布在球状蛋白质分子表面，以改变肽链。它是一个发夹式转折，其特点是在于多肽链中第n个残基的一CO基与第n+3个残基的-NH基形成氢键。因此，一个多肽链的走向可以得到很好的扭转。因此，β-转角在球状蛋白质中是重要的二级结构，起到连接其他二级结构的作用。 超二级结构：蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，以充当三级结构的构件。 结构域：对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种独立的折叠单位称为结构域。 蛋白质三级结构：指多肽链在二级结构的基础上借助各种次级键进一步盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。 蛋白质四级结构：具三级结构的球状蛋白质以非共价键缔合在一起，形成的聚集体称为蛋白质的四级结构。其中每个球状蛋白质称为亚基。 疏水相互作用：非极性的基团在极性溶液中相互靠近的相互作用。 别构蛋白质：是指除了具有结合底物的活性部位，还具有结合调节物别构部位的蛋白质。别构蛋白的活性部位和别构部位可以分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位与调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。 生物化学实验报告 姓名： 专业： 院系： 学号： 实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体 积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成： Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积；Vi内体积；Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。本文对蛋白质相互作用方法进行总结。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cdna文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜 结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白(GFP)的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部 实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL 4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％) 得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。 生物化学 第一章蛋白质化学 第一节蛋白质的重要性 ?蛋白质是机体最丰富的有机分子，占人体重量的16~20%，占干重的45%，肺组织高达80%。 ?蛋白质的生物学功能：生物催化作用、调节作用（激素，基因表达调控作用）、免疫防御与保护作用（细胞因子、补体、抗体）、转运和储存作用（转运蛋白）、结构功能（保护和维持细胞、组织、器官的正常生理形态，细胞骨架）、运动与支撑作用、信息接收 传递作用（受体蛋白）、生物膜功能 ?蛋白质组学：蛋白质组指的是基因组编码的全部蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质；蛋白质组学本质上指的是在机体整体水平上系统地研究蛋白质的 特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白 质水平上的关于疾病发生、细胞代等过程的整体而全面的认识。 第二节蛋白质的化学组成 ?蛋白质含氮量平均为16%，蛋白质的含量=含氮量x6.25。 ?天然存在的氨基酸约180种，组成蛋白质的氨基酸只有20余种（基本氨基酸）。 ?基本氨基酸的共同特点：①除脯氨酸为α-亚氨基酸外，其他组成蛋白质的基本氨基酸均为α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子为手性碳原子，且天然蛋白质中基本氨基酸皆为L-型；③不同的氨基酸的R链不同，对蛋白质的空间结构和理化性质有重要影响。 ?20种常见氨基酸的名称和结构式（见书P11） ?氨基酸的分类非极性R基氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；极性不带电R基氨基酸（易溶于水）：甘氨酸、丝氨酸、 氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；带负电的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；带正电的R基氨基酸：赖氨酸、组氨酸、精氨酸。 ?氨基酸的物理性质：①高熔点，200℃以上，以离子状态存在；②一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋 光性。 ?氨基酸的化学性质：①两性解离与等电点：pH高于等电点带负电，低于等电点带正电。 等电点时主要以两性离子存在，极少量以中性分子存在。中性氨基酸的pI在微酸性围，践行氨基酸的pI在碱性围，酸性氨基酸的pI在酸性围。②紫外吸收性质：色氨酸（280nm）、酪氨酸（275nm）和苯丙氨酸（257nm）含有苯环共轭双键系统，具有紫外吸收特性。③茚三酮反应：与大多数α-氨基酸加热反应产生蓝紫色物质，与脯氨酸、羟脯氨酸反应呈黄色，与天冬酰胺反应呈棕色；④α-羧基的反应：与碱、醇、硼氢化锂反应；⑤R基的反应：Million反应（Tyr-红色）、Folin反应（Tyr-蓝色）、坂口反应（Arg-红色）、Pauly反应（His、Tyr-橘红色）、乙醛酸的反应（Trp-紫红色环）。 ?氨基酸的功能：①寡肽、多肽、蛋白质的基本结构单位；②多种生物活性物质的前体； ③作为神经递质或神经营养素；④参与生物体的物质代和能量代。 第三节蛋白质的分子结构 ?蛋白质的一级结构包括：①组成蛋白质的多肽链的数目；②多肽链的氨基酸顺序；③多肽链或链间二硫键的数目和位置。 ?体多肽和蛋白质生物合成时，均是从氨基端开始，延长到羧基端终止，因此N末端被定为多肽链的头。 ?蛋白质一级结构的概念：蛋白质是由不同种类、数量和排列顺序的氨基酸，通过肽键而构成的高分子有机含氮化合物。它是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学 第一章生命大分子物质的制备 某一骨骼肌的无细胞粗抽提液每毫升含蛋白质32mg，在适宜条件下，10／-l该抽提液以每分钟O．14,umol 的速度催化一个反应。用硫酸铵沉淀法分级分离50ml上述抽提液，将饱和度为20% - 40%的沉淀物重新溶于10ml溶液中，测得其蛋白质含量为50rng/m1’取ioy.i该溶液催化一反应，其速度为每分钟o．65弘mol。试计算纯化倍数和回收率。(2. 97，92.8%) 第二章沉淀法 1．兔肌醛缩酶的p常数与盐析常数（在离子强度为摩尔浓度时）分别为6.30和2. 84。试求硫酸铵浓度分别为2mol/L、3mol/L时的溶解度。(4.2mg/ml，6.03 X10-3 mg/ml) 2．含25%硫酸铵饱和度的细胞色素c溶液150ml，需加多少克硫酸铵或多少毫升饱和硫酸铵溶液，才能使其达55%饱和度? (28. 95g, 100ml) .10．某一蛋白质的盐析范围为饱和硫酸铵30%-60%，试简述具体操作（若有500ml盐析液）。 第三章吸附层析 7. 利用薄层层析如何确定蛋白质的纯度？ 第四章疏水层析 1．疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有何区别？为什么？(P63 , T1) 第五章离子交换层析 1．离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？ 2．弱酸性和弱碱性的纤维素离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内应用？为什么？ 7．影响离子交换剂膨胀度的因子有哪些？其中哪个为关键因子？为什么？ 8．在层析柱中污染杂质后应如何处理？为什么某些亲水性离子交换剂在含乙醇的乙酸盐溶液中可以防止微生物污染？ 9．试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4．0、6.0、7.5和9.0的蛋白质合液的方案，并简述理由。并绘制洗脱曲线。 10．梯度溶液的变化速率、交换剂的膨胀程度、装柱的均匀度等因子，对样品的分辨率有何影响？11．梯度溶液的变化速率是受哪些因素控制的？试举例说明如何借助速率变化来提高分离效果？13．用离子交换剂测定蛋白质的等电点时，为什么一定要用强性离子交换剂？ 第三章蛋白质化学练习卷 一、填空题 (一)基础知识填空 1. 组成蛋白质的碱性氨基酸有、和。酸性氨基酸有和。 2. 在下列空格中填入合适的氨基酸名称。 (1) 是带芳香族侧链的极性氨基酸。 (2) 和是带芳香族侧链的非极性氨基酸。 (3) 和是含硫的氨基酸。 (4) 是最小的氨基酸，是亚氨基酸。 (5)在一些酶的活性中心起重要作用并含有羟基的分子量较小的氨基酸 是，体内还有另两个含羟基的氨基酸分别是 和。 3. 氨基酸在等电点时，主要以离子形式存在，在pH>pI的溶液中， 大部分以离子形式存在，在pH 单元测试一：蛋白质化学 班级：姓名：分数： 一．填空题（每空1.5分，共30分） 1.当溶液pH等于某种氨基酸的等电点时，其带_ 零 _电荷；当溶液pH大于某种氨基酸的等电点时，其带_ 负 _电；溶液pH小于某种氨基酸的等电点时，其带_ 正电。 2.盐浓度低时，盐的加入使蛋白质的溶解度_ 增大 _，称为_ 盐溶__现象。当盐浓度高时,盐的加入使蛋白质的溶解度降低，称为盐析现象。 3.由甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸6种氨基酸残基组成的肽链 有 5 个肽平面，有 3 个游离羧基。 4.蛋白质分子结构包括一级结构和二级结构。 蛋白质的一级结构是由氨基酸通过肽键连接而成的多肽链。 6.蛋白质分子的基本组成单位是氨基酸。蛋白质的一级结构维持作用力是肽 键。蛋白质的分子结构决定蛋白质的性质和功能。 7.蛋白质二级结构主要有 a螺旋和B折叠形状，维持其稳定结构的化学键是 氢键。 判断题 1．用凝胶过滤(Sephadex G-100)柱层析分离蛋白质时，总是分子量大的先被洗脱下来，分子量小的后下来。对 2．变性后，蛋白质的溶解度增加（减小），这是因为电荷被中和（空间结构被破坏），以及水化膜破坏所引起的。错 3．变性后（物理变性不可逆，化学变性可逆，可复性）的蛋白质在一定条件下，有些还能复性，恢复其生物学功能。对 4．有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质的优点是有机溶剂容易蒸发除去，且不会使蛋白质变性。错 5.蛋白质分子的种类和差别，是由其空间结构决定的。错（一级结构） 6．蛋白质主要是由C、H、O、N四种元素组成。对 7．氨基酸通过肽键连接而成的化合物称为肽。对 8．天然蛋白质的基本组成单位主要是L-α-氨基酸。对 9．肽键(-CO-NH-)中的C-N键可自由旋转，使多肽链出现多种构象。错（不可旋转） 10．维持蛋白质二级结构的化学键是氢键及范德华力（不是）。错 11．蛋白质一级结构对空间结构起决定作用，空间结构的改变会引起功能的改变。对 12．维持蛋白质二级结构稳定的主要作用力是氢键。对 13．蛋白质必须具有四级结构才具有生物活性。错（肌球蛋白是三级结构可存活） 14．蛋白质四级结构中的每个亚基单独都具有生物活性。错（不具有活性） 15．具有四级结构的蛋白质分子一定是由两条或两条以上的多肽链组成的。对 16．溶液中带电粒子在电场中向电性相同（相反）的电极移动，这种现象称为电泳。错 17．溶液pH值等于7时，蛋白质不带电荷。错 18．加热、紫外线、X射线均可破坏蛋白质的空间结构。对《生物化学》实验讲义
蛋白质组学研究方法选择及比较
生物化学-蛋白质化学练习含答案
生化实验讲义2010(10个)
果实蛋白质组学研究的实验方法
生物化学名词解释——蛋白质
生物化学实验讲义
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