肿瘤抗原细胞毒性Ｔ淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展
吴亚红高艳锋
祁元明
郑州大学生物工程系 郑州４５０００１
祁元明，女，教授，博士研究生导师，郑州大学生物工程系主任。主要从事肿瘤免疫、结核免疫与多肽药物的相关研究，为教育部高等学校生物科学与工程教学指导委员会委员，国家“８６３”项目与国家级精品课程评审专家，享受政府特殊津贴专家，中国生物化学与分子生物学会理事，河南省生物化学与分子生物学会副理事长，河南省杰出人才基金获得者，河南省教育厅学术与技术带头人。先后承担包括国家自然科学基金、河南省科技创新杰出人才基金、河南省重点科技攻关基金、河南省基础与前沿技术和河南省医学创新人才基金等项目。共发表论文８０余篇，其中ＳＣＩ论文１４篇，研究成果获省部级科技进步二等奖３项、三等奖２项，国家发明专利２项。
主编普通高等教育“十二?五”规划教材１部，副主编教材２部。
△女，１９５７年１月生，博士，教授，研究方向：肿瘤免疫与多肽药物，Ｅ－ｍａｉｌ： ｑｙｍ＠ ｚｚｕ． ｅｄｕ．ｃｎ
肿瘤抗原；细胞毒性Ｔ淋巴细胞；表位；多肚疫苗
恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要疾病之一，尽管手术治疗联合化疗／放疗能够延长患者的生存期，但是这些治疗手段也会损伤正常细胞，产生
很多不良反应，再加上很多恶性肿瘤具有侵袭转移和复发等特征，因此，急需发展新的方法来治疗肿瘤患者［１］。随着人们对免疫系统及其调节方式的逐渐认识，肿瘤的免疫治疗已成为传统疗法的必要补充，由于其不良反应小，且能在机体内建立免疫记忆，因此引起了人们的广泛关注。细胞毒性Ｔ淋巴
细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）介导的特异性细胞免疫在抗肿瘤免疫过程中发挥着主要作用。ＣＴＬ不仅能通过颗粒酶和穿孔素等物质直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌一些细胞因子如ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α等间接地杀伤肿瘤细胞［２］。Ｔ细胞特异性活化的第一步是其表面的Ｔ细胞受体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）与存在于肿瘤细胞或抗原提呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）表面的抗原肽－ＭＨＣ（人类ＭＨＣ称为ＨＬＡ）复合物的特异性结合，即Ｔ细胞所识别的是肿瘤特异性抗原或相关抗原中能与相应的ＨＬＡ分子槽状结合部位相匹配的称为抗原表位的
小肽片段。因此，寻找能够激活肿瘤特异性ＣＴＬ的抗原肽表位一直是该领域的研究热点和前沿课题。研究［３］表明，肿瘤细胞表面的抗原肽能够有效地诱导针对肿瘤细胞的免疫应答，且抗原肽为基础的疫
苗具有一些独特的优势，比如结构和产物相对简单、化学性质稳定、安全性高、成本低和制备方便等，此外表位肽还可以通过修饰来提高免疫原性，包括形成多表位疫苗或引入非天然的氨基酸，因此抗原肽疫苗是肿瘤免疫治疗的理想候选。但是如何筛选更
特异性的肿瘤抗原、提高抗原肽的免疫原性以及选择更好的佐剂及载体仍然是发展抗原肽疫苗亟待解决的问题。该文主要就ＣＴＬ表位肽相关研究的策略和进展进行阐述。国家自然科学基金资助项目 ３０８７２３８１，３０９０１３６２
万方数据
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＠＠［２４］Ｃｌａｅｓｓｏｎ ＭＨ． Ｗｈｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆａｉｌ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｅｓ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００９， １ （４） ：５１３
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＠＠［２６］Ｗａｎｇ Ｈ， Ｓｕ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｔｅｉｎ ６５ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＡＤＲＥ ａｎｄ ＨＢＶ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ
ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ＨＢＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ［Ｊ］． Ｖａｃｃｉｎｅ， ２０１１， ２９（１２）：２３２８
２０１１－０７－０５
食管鳞状细胞癌组织中ＨＩＦ－１α、ＣＣＲ７和ＶＥＧＦ－Ｃ蛋白的表达赵富周△杨鲲鹏庞志刚张典谷博
郑州大学第二附属医院胸外科郑州 ４５００１４
△男，１９７４年９月生，硕士研究生，主治医师，研究方向：食管癌和肺癌的治疗，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｆｕｚｈｏｕ＠ １２６．ｃｏｍ
食管肿瘤；鳞状细胞癌；缺氧诱导因子－ｌα；趋化因子受体７；血管内皮生长因子Ｃ；淋巴结转移
Ｒ７３５．１
目的：检测食管鳞状细胞癌（ＥＳＣＣ）组织中缺氧诱导因子－ｌα（ＨＩＦ－１α）、趋化因子受体７（ＣＣＲ７）及血管
万方数据
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方 法 作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林 【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性 细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。 1 单个细胞水平测定CTL活性 目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。 1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细
胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。 1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平, 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平, 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。当然, ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量, 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量, 而且, 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中, 随着ELISPOT技术的发展, ELISA法的应用已逐渐减少。 1.3 固相酶联斑点法( Enzyme linked immuno spot, ELISPOT) 基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅灵敏度大为提高, 而且能得到分泌细胞因子的细胞频数。CTL受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子, 就被预包被的抗体直接捕获, 通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数, 从而反映抗原特异性CTL的活性。此法的优点在于: (1)激活的T细胞周围环境中
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
细胞毒性检测方法总结！ 细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 细胞增殖能力分析试剂 原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。 二.荧光素发光法细胞生存能力检测 原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量 。 三.LDH法细胞毒性检测 原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度 特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测
抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择 原则 （1）药物相互作用原则 有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。 如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。 （2）刺激性原则 使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良 反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。 （3）细胞动力学原则 生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀 灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。 生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。 用药顺序 1、联用顺铂化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除 率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制 FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。 PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书 2、联合长春新碱化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效 VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细 胞内渗出而提高细胞内浓度 VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药 3、甲氨蝶呤 化疗方案联用药物用药顺序原因 CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制 剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂
微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验的质量保证 岳文勇 （152医院检验科，河南平顶山 467000） [关键词]微量淋巴细胞毒法 HLA-B27试验质量保证 国内外研究表明，强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原阳性率为83%-95.19%[1,2]。对患者进行 HLA-B27检测已经成为临床排除、提示或预防强直性脊柱炎的一个重要的辅助手段。目前,检测血清中HLA-B27的方法有微量淋巴细胞毒法、ELISA法、流式细胞仪法、PCR-SSP 法等。相比而言，ELISA法特异性和敏感性较差;流式细胞仪和PCR-SSP两种方法试验要求高,均需价格昂贵仪器而普及受限;微量淋巴细胞毒法特异性好、操作无须特殊仪器,适合二级以下医院推广使用[4,5]。但由于试验条件难以控制、HLA高度多态性等因素，微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27时容易出现误判漏判，因此临床检验工作者更应该加强微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验时的质量保证意识。2003年-2007年,笔者临床应用微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27共1886人份,总结出几点经验,供大家交流探讨。. 微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27试验原理简介:通过淋巴细胞分离液分离外周抗凝血中有活性的淋巴细胞,与检测板上已知的B27抗体反应,若待检淋巴细胞膜上有B27抗原存在, 则在补体的参与下,在细胞膜上打孔,细胞死亡,加入染料透入后而着色。 1 实验材料的质量保证 1.1 淋巴细胞分离液与HLA-B27反应板 1.1.1 淋巴细胞分离液保存淋巴细胞分离液必须避光、无菌、4℃冷藏保存,保证分离液的成分不受破坏。笔者的经验是:根据平常工作所需要的量，一次性把250ml分离液无菌操作，分装在多个大玻璃试管中,随用随取，可以避免批次间交叉污染。 1.1.2 HLA- B27反应板选择 HLA- B27反应板必须选择有质量保证和批准文号的合格试剂板，保证检测结果高度稳定性。 1.2 外周血抗凝剂选择抗凝剂EDTA-K2较肝素好。2003-2007年，笔者随机选择本院门诊疑似AS患者1006例，经患者同意后抽取5ml静脉血液，分为A、B两组，A组用肝素完全抗凝血液 2.5ml，B组用EDTA-K2完全抗凝血液2.5ml。离心前，两组抗凝血液均作血涂片观察记录淋巴细胞形态，便于比较离心后两组淋巴细胞形态情况；两组均分离血浆，观察有无溶血，溶血的血液不选用。离心时，两组均使用同一天平配平，使用同一台离心机。离心后，两组均由同一人员规范操作，提取淋巴细胞。 本研究就四个方面对两组进行比较，比较结果：EDTA-K2最大的优点是对细胞形态影响小，不会造成对死活细胞的误判，见表1。 表1 两组患者不同抗凝剂比较 肝素组（n=1006）例数 % EDTA-K2 组（n=1006） 例数 % 有淋巴细胞聚集现象41 4.07 20 1.99 有溶血现象 3 0.29 2 0.19 有血小板碎片混入现象102 10.14 112 11.1 淋巴细胞形态有改变20 1.99 2 0.19 2 实验操作的质量保证 2.1 配平及离心淋巴细胞分离前，要用高精度天平配平后方可放入水平离心机中沉淀分离。因分离液分离淋巴细胞是利用细胞的密度不同进行密度梯度离心法进行分层的,配平不
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检 测方法 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林 【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性 细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。 1 单个细胞水平测定CTL活性 目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血
单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。 1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。 1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平, 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平, 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。当然, ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量, 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量, 而且, 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中, 随着ELISPOT技术的发展, ELISA法的应用已逐渐减少。
实验方案 繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制 1. 病毒的克隆 1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代 1.1.1复苏 （a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。待长成单层后，进行传代培养。 （b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。 1.1.2传代 取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。 1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖 1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV） (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液； (2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL； (3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。吸附1h后，倒出接种病毒液，再加入含3％BCS的维持液，置37℃培养。 (4) 收获每日观察细胞的CPE。接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE，或根据CPE 的形成情况，适当缩短观察间隔时间，待细胞形成80％的CPE时，冻融三次后－20℃冻存。 1.2.2 病毒增殖 (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液，洗2－3
淋巴增殖实验: 第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下 ⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀; (2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀; ⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次; (4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min; (5)悬于1mL DMEM 中; (6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d; (7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。 取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法 1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。 2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50μl含20μg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。向每孔中加入淋巴细胞悬液50μl，培养物总体积为100μl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10μg/m1，设 3 重复孔。细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。每孔加 5mg/m1MTT 溶液10μl，继续培养3h 后，加入100μl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。 3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50μl 含10μg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50μl，设 3 重复孔。每孔中
微量淋巴细胞毒试验操作规程 SXYJ-GZ-0214 1目的规范微量淋巴细胞毒试验操作，正确进行HLA抗体鉴定。 2适用范围适用于HLA抗体鉴定。 3职责检测者负责依据此程序进行微量淋巴细胞毒试验操作。 4材料与设备肝素抗凝剂、淋巴细胞分离液、凝血酶、补体、伊红染液、12%甲醛、甘油； 空白72孔微量反应板、微量加样枪（1μl、2μl、5μl）、倒置相差显微镜、水平式离心机、血细胞计数池、KUBOTA KA5100型离心机等。 5操作方法 5.1待检标本准备及要求移植前交叉淋巴细胞毒患者不抗凝标本3ml,供者肝素抗凝静脉 血5ml；习惯性流产女方不不抗凝标本3ml，男方肝素抗凝静脉血5ml。不抗凝标本充分退缩，分离出血清备用；肝素抗凝静脉血充分混匀，室温放置备用。 5.2淋巴细胞制备 5.2.1肝素抗凝静脉血，室温放置20分钟，2000转/分离心10分钟，吸取白膜层于装有2ml 盐水的试管中，混匀； 5.2.2缓慢加在装有3ml Ficoll液面上，2000转/分离心30分钟，取淋巴细胞层，于另一 小试管中，加盐水至3ml,3400转/分离心1分钟（SERO 3键）； 5.2.3弃掉上清，加1ml盐水，将细胞轻轻吹起，3400转/分离心15秒钟（SERO 2键），去 除血小板的干扰； 5.2.4弃掉上清，加入3ml的生理盐水，并将细胞轻轻吹起，3400转/分离心1分钟（SERO 3 键），弃掉上清，用1640保养淋巴细胞； 5.2.5淋巴细胞浓度调节混匀淋巴细胞后冲入血细胞计数池，倒置相差显微镜下观察细胞浓 度为2500-3000个/μl（中方格内的每个小格约20-30个细胞）。 5.3加样 5.3.1在空白72孔微量反应板中加液体石蜡，8ul/孔； 5.3.2每孔加相应血清1ul(阴性对照孔加血小板配型试剂中阴性对照血清)； 5.3.3每孔加淋巴细胞1μl 置室温35分钟； 5.3.4每孔加补体5μl，室温65分钟； 5.3.5每孔加伊红2μl，室温2分钟； 5.3.6每孔加甲醛8μl，盖板；
T淋巴细胞亚群报告的阅读与分析 彭晓 在细菌感染性疾病，我们已经习惯了用白总分检查来了解感染的状态和做出相应的处理。作为细胞免疫重要内容的T淋巴细胞及亚群的检测在一些疾病中也有相应的结果，根据这些结果可以解释发病机理、对患者的免疫功能和预后做出判断以及指导治疗。这些疾病主要包括：1.病毒感染性疾病；2.肿瘤性疾病； 3.自体免疫性疾病； 4.器官移植患者； 5.其他免疫缺损或异常的患者。在各大型医院，T细胞亚群已经成为以上疾病中常规使用的项目。 在白细胞中淋巴细胞是非常重要的一类。它分为主要参与细胞免疫的T淋巴细胞（CD3+）和主要参与体液免疫的B淋巴细胞（CD19+）。而T淋巴细胞又分为辅助性T淋巴细胞（CD3+CD4+）和抑制性/细胞毒性T淋巴细胞（CD3+CD8+）。在正常情况下，各群淋巴细胞的数目和相对比例都在一定的范围内。 淋巴细胞和主要的亚群 T h1 辅助T(分泌I F N等) (C D3+C D4+) T淋巴细胞T h2 (C D3+)(分泌I L-4等) C D28(+) 淋巴细胞抑制T\细胞毒T杀伤性细胞毒（肝炎） (C D3+C D8+) C D28（-） B淋巴细胞抑制性（肿瘤） (C D19+) （方框内为T细胞亚群报告中所包括的内容） T淋巴细胞亚群报告中包括实验室报告和医生报告。前者主要是供实验室人员进行条件和质量控制所用，后者是供医生阅读,较为方便清晰。 在T淋巴细胞亚群的医生报告中提供了以下内容： 1. 总T（CD3+）淋巴细胞的绝对计数： 就如白总分中的白细胞计数一样，该细胞的绝对计数(个/ul)一般也在一定范围内。在一些情况下，如病毒感染、化学和物理因素、免疫系统的衰竭或其它功能紊乱、造血系统异常等疾病时此值可能会有异常。曾有人报道淋巴瘤患者的淋巴细胞数目多时预后较好。由此可以推测，肿瘤患者的T淋巴细胞数目较高时（在正常范围内）预后也应该较好。 2. 辅助T（CD3（+）CD4（+））细胞的绝对计数和百分比。 3. 抑制T（CD3（+）CD8（+））细胞的绝对计数和百分比。 如上图所示，无论是CD3（+）CD4（+）还是CD3（+）CD8（+）细胞，都可以进一步划分为更进一步的亚群。 4. CD3(+)细胞中的CD4、CD8双阳性或双阴性细胞：
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela :人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9 :昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21 (baby hamster kidney )细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV
四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3 x 105个/ml 2）p H范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37C 昆虫细胞28-30 C 五、常用细胞分散剂与作用原理 1 、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质 水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA :与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。 六、营养液 1 、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1 ）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30min 3）血清的作用
人的外周血淋巴细胞培养 摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析 前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
细胞毒性实验设计方案 1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜 灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头 2. 实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 (SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型： 培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
细胞毒性实验方案 Prepared on 22 November 2020
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包μm滤膜 灭菌：50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：