芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析
万红贵,袁建锋,单咸旸,朱明新,宗素艳,石楠
(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009)
摘 要 从筛选自新疆罗布泊沙漠的1株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPS 和EP S ,其中EPS 为主要成分,占总糖的89 5%,EP S 为糖蛋白,其分子质量为96 292ku,多糖含量为93 79%,蛋白含量为5 62%,不含糖醛酸,是由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75。EPS 为 型吡喃糖,经高碘酸氧化和Smit h 降解,EPS 中含有(1 ),(1 3)和(1 4)糖苷键,且(1 )和(1 4)糖苷键的比例为1 24 05,其中的糖肽是O 糖苷键。关键词 芽孢杆菌,糖蛋白,结构分析
第一作者:硕士,研究员。
收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-19
细菌多糖主要以3种形式存在:胞内多糖、胞壁
多糖和胞外多糖。广义上的胞外多糖指的是糖被(gly cocalyx ),包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团,对细菌本身来说它具有很多的功能。例如:保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等;狭义上的胞外多糖指的是黏液层,是一种扩散到培养基中的多糖,也是人们通常所说的胞外多糖
[1]
。
细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外,更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而备受关注
[2]
。近些年来,一
些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视,它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样,对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。因此,它们作为一种新型糖,成为科学工作者研究的一个新热点。本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPS 的理化性质和一级结构,为以后的进一步生物学功效的研究打下基础。
1 材料与方法
1 1 供试菌株
芽孢杆菌(Bacillus),筛选自新疆罗布泊沙漠。1 2 仪器和试剂
TGL 16G 高速离心机,上海安亭科学仪器厂;RE 52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;All tech 高效液相色谱仪,426型H PLC 泵,ELSD 2000
检测器,Alltech 色谱工作站,美国奥泰科技有限公
司;SH B 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅H H 4,国华电器有限公司;PH S 3C 精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;DZF 602型真空干燥箱,上海博讯实业有限公司;BS 100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;N ico let380FT IR,美国热电公司T herm o;TU 1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;柱层析系统;BS124S 电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。
活性炭;Sephadex G-100(Wolsen);标准葡聚糖(Dex tran)(A R,国药集团化学试剂有限公司);其余试剂除注明外都为分析纯试剂。1 3 培养基和培养条件
培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。16h 的种子以1%(体积比)的接种量转接至发酵培养基,500mL 发酵摇瓶的装液量为50mL,于30 ,200r/m in 的条件培养48h 。1 4 胞外多糖EPS 的制备
发酵液经离心除去菌体,得到的上清液使用Sevag 法除去杂蛋白,调节pH 值为7 0,以1 4的体积比加95%的乙醇,4 放置24h,10000r/m in,10m in 离心收集沉淀,真空干燥得粗多糖。
将粗多糖溶解后上活性炭柱(1 5cm 24cm ),先用蒸馏水60mL 洗脱,再用60%乙醇60mL 洗脱,最后使用95%乙醇60m L 洗脱,每150s 收集1管洗脱液,硫酸 苯酚法跟踪多糖分布,同时用考马斯亮蓝法跟踪蛋白质分布,收集主峰部分。经过真空浓缩,上SephadexG 100柱纯化,硫酸苯酚法监测,收集其主峰部分,使用95%乙醇沉淀,真空干燥得到多
糖纯品。
1 5 多糖的理化性质及组成分析
1 5 1 EPS 的分子质量测定
采用凝胶过滤色谱法测定[3]。
1 5
2 多糖的组成分析
1 5
2 1 多糖含量测定
采用硫酸 苯酚法[4],以葡萄糖作标准曲线,490 nm检测波长。同样的操作,取1m L的样品液,测定490nm吸收值,由标准曲线计算多糖含量。
1 5
2 2 蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法[5],以牛血清蛋白作标准曲线,检测波长595nm。
1 5
2
3 多糖中糖链 肽链的连接方式的确定( 消除反应)[4]
称4mg样品,溶解于3mL蒸馏水中,加入3 mL的0 4mol/L NaOH,于25 下反应,在开始和反应后的1 5h,分别进行紫外测定,根据碱处理后的多糖在240nm处光吸收值的变化,即是否出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收,来判断多糖中糖与蛋白质结合的连结方式。
1 5
2 4 单糖组成分析
称取3mg样品,按1 5 2 3操作,除去蛋白质肽链,调节pH值为7 0,经过透析袋透析12h,流水透析24h,然后加入5mL的2mol/L三氟乙酸,塞紧试管塞子,于80 下水解2h,结束后加入3mL的甲醇,60 下真空浓缩除去三氟乙酸,所得样品进行H PLC分析,用标准单糖进行外标,确定单糖组成。
色谱分析条件:Prevail Carbohydrate ES(250 mm 4 6mm,5 m)糖柱;流动相:V(乙腈) V(纯水)=75 25;流速:1 0m L/min;检测器ELSD 2000漂移管温度:80 ;气体流量:2 0L/m in;进样量:80 L。
1 5
2 5 糖醛酸含量分析
采用硫酸咔唑法[6]。
1 6 多糖一级结构的初步分析
1 6 1 光谱全波长扫描
配制1mg/mL多糖溶液,以蒸馏水作为对照,于200~600nm波长区域扫描。
1 6
2 红外光谱测定
采用KBr压片法[4]。
1 6 3 高碘酸氧化[4]
称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30 mmo l/L NaIO4溶液,定容至25m L,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48 h间隔取样0 1 m L,蒸馏水稀释250倍后,使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。至光密度值达到稳定值时,加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量,即可推算出每个糖基的高碘酸量。取2mL上述反应溶液,使用0 01m ol/L的NaOH标准溶液测定甲酸的生成量,剩余部分进行Sm ith降解。
1 6 4 Smith降解[4]
将1 6 3操作所剩下的溶液加入乙二醇并搅拌30m in以还原剩余的高碘酸。对流水透析48h,蒸馏水透析过夜,于40 以下减压浓缩至10mL左右,加入70mg硼氢化钾于室温,暗处搅拌18~24h以还原多糖醛。用0 1mol/L醋酸中和至pH6~7,对流水透析48h,蒸馏水透析24h,减压蒸干,加1 m ol/L H2SO42mL,封管,100 水解8h,用BaCO3粉末中和,定量滤纸过滤,滤液减压浓缩。
薄层色谱法检测降解产物,展开剂为V(正丁醇) V(乙酸) V(水)=4 l 5;显色剂为A gNO3。点样采用甘露糖、赤藓醇、甘油标准品作为对照。
2 结果
2 1 理化性质分析
纯化后的多糖样品EPS 为棕灰色粉末,易溶于水,不溶于高浓度的乙醇、甲醇、以及丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂。其水溶液呈棕灰色黏稠状,与咔唑 乙醇液反应呈粉红色,苯酚 硫酸液反应呈黄棕色,蒽酮 硫酸液反应呈蓝绿色,与碘溶液不反应。
2 2 分子质量的测定
用蓝色葡聚糖-2000上Sephadex G-100柱,测得外水体积V o,用标准分子质量的葡聚糖上柱测得各自的洗脱体积V e。用V e/V o值对标准分子质量对数(Lo g M W)绘制标准曲线,得到回归曲线方程y =-1 8322x+2 2259(R2=0 9987),由EPS 上柱的洗脱液体积V e计算得分子质量为96 292ku。
2 3 多糖组分分析
2 3 1 多糖含量和蛋白质含量分析
以葡萄糖为标样,采用苯酚 硫酸法在490nm处测定不同标糖光密度值,以葡萄糖质量(g)为横坐标,光密度值为纵坐标制作标准曲线。测得样品光密度值,根据回归曲线方程y=0 07247x+0 00563(R2 =0 9983),计算得出纯化后的EPS 糖含量为
93 79%。
以牛血清白蛋白为标准品,考马斯亮蓝法在595 nm波长处测定蛋白质含量,得到标准曲线,根据回归曲线方程y=0 5695x-0 0095(R2=0 9986)得到EPS 中蛋白质含量为5 62%。
2 3 2 糖链 肽链连接方式的确定
EPS 经0 4mo l/L NaOH于25 水解1 5h 后,对比240nm处的紫外吸收值,其结果如表1所示,在240nm处有明显的增大趋势,即出现了羟基不饱和氨基酸的特征吸收,因而可确定EPS 中糖肽的结合方式为O 糖苷键。
表1 碱处理前后EPS 在240nm处的紫外吸收
处理方式时间/h240nm吸光度
碱处理前
01 265 1 51 694
碱处理后
01 264 1 51 265
2 3 3 单糖组分分析
EPS 经1 5 2 4操作与D 葡萄糖、D 木糖、D 甘露糖、D 鼠李糖、D 半乳糖、D 葡萄糖醛酸、D N 乙酰葡萄糖胺进行H PLC分析,结果如图1。D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,响应时间分别为2 254,7 025和8 726。与EPS 的图谱进行比对,确定EPS 的单糖组成为D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,它们的摩尔比是2 36 0 98 1 75。
图1 标准单糖溶液和EPS 的色谱图
2 3 4 糖醛酸含量测定
以标准葡萄糖醛酸作为对照,通过硫酸咔唑法,制作糖醛酸含量标准曲线,由回归曲线方程y= 3 4634x-0 0101(R2=0 9994),得EPS 中不含糖醛酸。
2 4 多糖一级结构的初步分析
2 4 1 光谱全波长扫描分析
EPS 的光谱扫描(图2)表明,在260nm未发现核酸特征吸收,但在280nm发现有极微弱的蛋白吸收,这与蛋白含量测定中,蛋白质含量较低相对应。
图2 EP S 的紫外吸收图谱
2 4 2 红外光谱分析
EPS 的红外光谱(图3)表明,在3500cm-1~ 2800cm-1和1665cm-1~1635cm-1的吸收峰表明EPS 为糖类化合物,其中3420cm-1为羟基O H 的伸缩振动,2925cm-1为糖类的C H伸缩振动,1 650cm-1为糖的乙酰氨基的特征峰;1250cm-1~ 950cm-1的一组吸收峰,是吡喃糖环的醚键(C-O-C)和羟基吸收峰,890cm-1附近是吡喃糖 型C-H 变角振动的特征峰,由此可以推断EPS 中有 型糖苷键。
图3 EP S 的红外吸收图谱
2 4
3 高碘酸氧化和Sm ith降解
在高碘酸氧化反应过程中,每间隔12h取样检测反应液的光密度,由图4可见,在100h后光密度趋于稳定,终止反应,根据高碘酸标准曲线y=0 046 6x-0 0590(R2=0 9998),此时高碘酸的消耗量为1 202mm ol,同时,生成的甲酸量为0 025mm ol,即EPS 中含有(1 )末端糖苷键,高碘酸氧化后的反应液经硼氢化钾还原为多糖醇,经硫酸水解后薄层层析鉴定水解产物。由图5可见,EPS 经Smith降解后产生甘露糖和赤藓醇,说明EPS 中包含(1 3)和(1 4)糖苷键,而(1 3)糖苷键链接的糖在高碘酸氧化中不消耗高碘酸,Sm ith降解后仍为原来的糖,即有部分甘露糖以(1 3)糖苷键链接,且(1 )末端糖苷键与(1 4)的比例为1 24 05。
图4 高碘酸氧化进程
图5 Sm ith降解产物薄层层析
3 结果与讨论
(1)纯化后的糖蛋白EPS 经水解后进行H PLC 分析单糖组成,由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75,通过红外光谱分析、高碘酸氧化和Smith降解分析推测EPS 为 型糖苷键连接的吡喃糖,其中含有(1 3)糖苷键,(1 4)糖苷键及末端(1 ),糖肽的链接方式为O 糖苷键,但因试验条件所限,甲基化反应和核磁共振分析工作无法进行,因而具体的连接方式和构型无法准确得出。
(2)与蛋白质、核酸相比,多糖的结构相当复杂,测定和分析工作量很大,而且需要多种大型精密仪器,成本高,因而本研究仅对EPS 的一级结构作了初步分析,为以后进一步的研究打下基础,如要精确测定其二级、三级甚至四级结构,还需大量的工作,进行更系统的研究。
参考文献
1 李江,陈靠山,郝林华,等 细菌胞外多糖的研究进展
[J].海洋科学,2006,30(4):74~77
2 Elena L,Isr ael R,A nzeles S M Ex tr acellular po lysaccha
rides product ion by A r thr obacter viscosus[J].Jo urnal of Fo od Eng ineer ing,2003,60:463~467
3 郭勇 现代生化技术[M].广州:华南理工大学出版社,
1995 1~222
4 张惟杰 糖复合物生化研究技术(第二版)[M].杭州:浙
江大学出版,1999 1~540
5 Bradford M M A r apid and sensitiv e method fo r the quan
titatio n of micro gr am quantities o f pro tein utilizing t he principle of pro tein dy e binding[J].A naly tical Biochem is try,1976,72:248~254
6 Dische Z A new specif ic colo r reaction o f hexuro nic acids
[J].Jo urnal o f Bio lo gical Chemistr y,1947,167:189~ 198
Study on Structure of Exopolyseccharide of the Bacillus
Wan H onggui,Y uan Jianfeng,Shan Xianyang,
Zhu M ingx ing,Zong Suyan,Shi N an
(College o f Life Science and Phar macy,N anjing U niver sity o f T echnolog y,N anjing210009,China)
ABSTRAC T T he ex opolysaccharides EPS and EPS from fermentation filtrate o f Bacillus obtained fr om LU OBU PO Deser t w ere studied.A s the m ain com po nent,EPS w as acco unted fo r89.5%o f total sugar. This paper mainly reported the phy sical and chem ical pr operties and pr im ary str ucture of EPS .The results show ed that EPS w as protein-bo und polysaccharide.T he averag e m olecular weight of EPS w as96.292 KDa and po lysaccharide co ntent w as93.79%, 5.62%fo r protein,but had no ur onic acid.It w as co mpo sed of D N acetylg lucosamine,D x y lose and D m annose in the m olar r atio of2.36 0.98 1.75.T he mo nosac char ides of EPS w ere py ranose.Analy sis by periodate o xidation and Sm ith deg radatio n indicated that EPS w as composed of(1 ),(1 3)and(1 4)gly cosidic linkag es and the ratio of(1 )and(1 4)w as1 24.05.EPS w as ex pressed O linked glycoprotein.
Key words Bacillus,glycoprotein,structural analy sis
酶在植物多糖的提取方面的应用现状 植物的有效成分大多包裹在细胞壁中，对这些有效成分的提取，传统的热水、酸、碱、有机溶剂浸提法，受细胞壁主要成分纤维素的阻碍，往往提取效率较低，恰当地利用植物精提复合酶处理这些中药材，可改变植物细胞壁的通透性，降解杂质（如蛋白，果胶，鞣质，灰分和粘性物质等）对中药有效成分提取的干扰，沉清提取液，易于滤过，提高药效成分的提取率。本文就植物精提复合酶的作用机理，影响酶促反应的因素及目前用于中药有效成分的提取的研究情况作一概述。 1. 植物精提复合酶水解作用机理 1.1纤维素分子是由许多吡喃型的D-葡萄糖残基通过β-1,4葡萄糖苷键连接而成的多糖链，天然纤维素为直链式结构，链与链之间有晶状结构和排列次序较差的无定形结构；纤维素分子以结晶或非结晶方式组合成微原纤维，微原纤维集束形成微纤维，以微纤维为基本构造构成纤维素。 纤维素酶由三类组成：(1)内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，也称EG酶或Cx酶)；(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)或C1酶；(3) β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3-2-1-21),简称BG。 纤维素酶解是一个复杂的过程，其最大特点是协同作用。内切葡聚糖酶首先作用于微纤维素的无定型区,随机水解β-1，4-糖苷键，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素，外切葡聚糖酶从这些非还原性末端上依次水解β-1，4糖苷键，生成纤维二糖及其它低分子纤维糊精。 1.2果胶酶可分为作用于甲酯键的果胶脂酶（PE）和分解α-1.4-半乳糖醛键的解聚酶，解聚酶中的内切果胶酶（endo-pl）和内切聚半乳糖醛酸酶（cndo-pl）对中药提取液有极好的澄清效果，彻底分解果胶，降低提取液粘度。 1.3半纤维素酶能裂解植物细胞壁，释放出更多的有效成分，可快速分解果胶和其它阿拉伯糖长键分子，降低果汁粘度。 1.4木聚糖酶作用于戊聚糖链，降解葡聚糖及戊聚糖等高分子粘性物质，其降解产物为糊精，纤维二糖及昆布二糖等。 1.5中温α-淀粉酶能够水解淀粉分子的β-1，4-葡萄糖苷键，任意切割成长短不一的短链糊精及少量的低分子糖类、直链淀粉和支链淀粉，均以无规则形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下降。 夏盛集团技术中心专门开发出植物提取专用复合酶，有SPE-001、SPE-002、SPE-005、SPE-006、SPE-007A、SPE-007B、SPE-008等复合酶以及食品级的纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等一系列植物提取用单酶。经本研发中心试验及国内大的植提厂家中试及大试表明，植物精提复合酶各酶系之间有极强的协同作用，相互促进，一方面破坏植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出，降解植物提取液
晶体结构解析基本步骤 Steps to Crystallographic Solution (基于SHELXL97结构解析程序的SHELXTL软件，尚需WINGX和DIAMOND程序配合) 注意：每一个晶体数据必须在数据所在的目录(E:\STRUCT)下建立一子目录(如E:\STRUCT\AAA)，并将最初的数据备份一份于AAA目录下的子目录ORIG，形成如右图所示的树形结构。 一. 准备 1. 对IP收录的数据, 检查是否有inf、dat和f2(设为sss.f2, 并更名为sss.hkl)文件; 对CCD 收录的数据, 检查是否有同名的p4p和hkl(设为sss.hkl)文件 2. 对IP收录的数据, 用EDIT或记事本打开dat或inf文件, 并于记录本上记录下相关数据(下面所说的记录均指记录于记录本上)： ⊕从% crystal data项中，记下晶胞参数及标准偏差(cell)；晶体大小(crystal size)；颜色(crystal color)；形状(crystal habit)；测量温度(experiment temperature)； ⊕从total reflections项中，记下总点数；从R merge项中，记下Rint＝?.???? % (IP收录者常将衍射数据转化为独立衍射点后传给我们); ⊕从unique reflections项中，记下独立点数 对CCD收录的数据, 用EDIT或记事本打开P4P文件, 并于记录下相关数据： ⊕从CELL和CELLSD项中，记下晶胞参数及标准偏差; ⊕从CCOLOR项中，记下晶体颜色; 总点数；从CSIZE项中，记下晶体大小; ⊕从BRA V AIS和SYMM项中，记下BRA V AIS点阵型式和LAUE群 3. 双击桌面的SHELXTL图标(打开程序), 呈 4. New, 先在“查找范围”选择数据所在的文件夹(如E:\STRUCT\AAA), 并选择衍射点数据文件(如sss.hkl),?单击Project Open,?最后在“project name”中给一个易于记忆和区分的任务名称(如050925-znbpy). 下次要处理同一结构时, 则只需Project 在任务项中选择050925-znbpy便可 5. 单击XPREP , 屏幕将显示DOS式的选择菜单: ⊕对IP收录的数据, 输入晶胞参数后回车(下记为
多糖结构总结
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期： ?
1 红外分析（IR ） 从硒化壳聚糖[图1（b)]与壳聚糖［图１（ａ)]的数据和图形对比可以看出，亚硒酸根主要连接在C 2的氨基本上和C ６的羟基上,主要是由以下的光谱图形和光谱 数据变化得到证明:壳聚糖C 2的氨基硒化后，NH 的弯曲振动由159４．52c ｍ-1变为1523．29cm －1，壳聚糖Ｃ2 位氨基上未脱干净的乙酰基的羰基振动峰为
1650.32cm －1，而硒化壳聚糖C ２位上未脱干净的乙酰基的羰基振动峰为1６３ 2.88cm -1,可能是受到C ６位的羟基上亚硒酸基的影响；同样由于硒化壳聚糖C 2位氨基上和C 6位羟基上亚硒酸根的影响，壳聚糖C －O 伸缩振动峰由 10７9．４５cm -1变为1０90．４1c ｍ-1。同时，在8０0．００c ｍ-1处观察到亚硒酸酯的Ｓｅ=O 双键的振动峰。上述红外分析结果表明:壳聚糖与亚硒酸可能是通过Ｃ6位上的酯化反应和Ｃ2位上氨基的静电作用完成的。（硒化壳聚糖的制备及其表征) 从羧甲基壳聚糖与硒化羧甲基壳聚糖的红外光谱图图３、图4的对比中可以看出, 亚硒酸根主要连接在Ｃ2位的羧甲基和C 6的羟基上。主要由以下光谱图形和光谱数据变化得到证明: 羧甲基壳聚糖１６２７ｃm -1处的－COOH 反对称吸收峰在硒化羧甲基壳聚糖中红移至１599ｃm －1， 这可能是羧甲基壳聚糖中的-CO ＯH 与亚硒酸钠发生反应, 从而使键力削弱。111９cm -1处的C-O 伸缩振动在硒化羧甲基壳聚糖中红移至1064ｃm -１, 说明Ｃ６上的羟基也参与了硒化反应。此 外, 在硒化羧甲基壳聚糖的红外光谱中观测到位于80６.1２5cm -１的Se=O 双键振动峰。（硒化羧甲基壳聚糖的合成及表征） ２．Ｘ－射线衍射 X 射线衍射法是研究多糖的结晶构型的有效方法。多糖通常是不能结晶的,但在适宜的条件下,它可以微晶态存在。所以进行衍射分析的样品必须通过外界的诱导使其中相当部分呈现微晶态。进行衍射的香菇多糖样品一般先制成碱性溶液,然后在水中透析,进一步处理制备。孙艳等将从香菇中分离而得的多糖经Ｘ2衍射分析,确定其立体结构为右手心三度螺旋,晶格为六角形, 晶格常数ａ
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
shelxtl open new name xp fmol kill $q proj select the good direction exit telp 0 -30 plotfile enter file name draw file name select file(ps file) black and white cell fmol kill $q matr 1=a 2=b 3=c pbox 5 15 pack select (space=keep, enter=del) fmol telp cell enter file name draw file name select file type(a=psfile) black and white(enter) plane xp read file name fmol mpln atom1 atom 2..... enter angle xp read file name fmol
mpla n(atom number) atom1 atom 2..... mpla n(atom number) atom1 atom 2..... mpla n(atom number) atom1 atom 2..... enter fmol kill link matr pbox pack undo c**? C**? telp cell xl 计算方法 在ins中任何地方插入 mpla 虚拟平面的原子个数（例如六个原子只有四个可能共平面，即输入4），后面连续输入可能共平面的4个原子，后面在输入其他两个平面外的原子。 例如c1 c2 c3 c4 c5 n1中，c1 c2 c4 c5 共平面 mpla 4 c1 c2 c4 c5 c3 n1 txt 运行xcif 选择t 两次回车 输入文件名.txt 选择def 回车直到选择q 理论加氢 在ins中输入 HFIX 要加氢的原子 保存ins 运行XL 打开RES 拷贝相应的数据到ins中即可。 CHEMICAL DRAW 选中画笔 点出两个点 按ESC 点选择键 选中画笔 鼠标移动至出现小手
植物多糖提取、分离及检测 实验目的 学习并掌握植物多糖提取、分离及检测的原理和方法 实验原理 植物多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（c6h10o5）n表示。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。多糖普遍存在于自然界植物体中，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动的四大基本物质之一，同维持生命功能密切相关。 多糖的提取分离，含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物。在多糖的检测方面采用单糖衍生物的GC/ MS 分析可以对多糖中的具体结构进行定性分析。 实验材料 材料山茶叶片 仪器组织粉碎机、烘箱、超声波提取机、恒温水浴锅、索氏提取器、旋转蒸发仪、冰箱、离心机、分液漏斗、GC/ MS 分析仪 试剂活性炭、95%乙醇、Sevag 试剂、无水乙醇、丙酮、无水乙醚、2mol·L - 1的硫酸、BaCO3 粉末、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐、氯仿 实验步骤 1、多糖提取分离称取粉碎、干燥好的山茶叶150g ,加入1500mL 蒸馏水,超声波提取20min ,于90 ℃恒温浸泡2h ,提取两次;得棕色滤液, 用活性炭对其脱色，活性炭量为活性炭：溶液=0.5%。过滤脱色后的滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL ,抽滤,加入200mL 95 %乙醇沉淀多糖,于冰箱醇析24h ,得棕色絮状物,离心,收集沉淀。 Sevag 法去蛋白Sevag 试剂的配制:用氯仿与正丁醇以4∶1 混合。取上述粗多糖加水溶解,于溶液中加入溶液1/ 3 倍体积的Sevage 试剂,剧烈震荡至无白色絮状物析出,离心15min ,除去水相与有机相交界处的变性蛋白,Sevage 法脱蛋白重复3 次。剩余液体加入200mL 无水乙醇,充分振荡摇匀,于冰箱静置24h ,得棕色絮状物,离心收集沉淀。沉淀经无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤两次,干燥,得棕色多糖211g。 2 、多糖的检测 （1）、多糖水解称取50mg 山茶叶多糖,加入浓度为2mol·L - 1的硫酸10mL ,封管,超声振荡3～5min 至多糖完全溶解后,在100 ℃恒温水浴振荡水解2h ,然后将试管置于烘箱中于110 ℃反应6h。反应完成后冷却至室温,加BaCO3 粉末中和至中性, 离心, 过滤, 真空干燥, 得到水解后的单糖混合物10.5mg。 （2）糖腈乙酸酯衍生物的制备称取10mg 单糖样品和10mg 盐酸羟胺,用20mL 吡啶溶解,封管,95 ℃恒温水浴振荡30min 后冷却至室温;加入016mL 乙酸酐,封管,95 ℃恒温水浴振荡30min ,反应完成后冷却至室温,得糖腈乙酸酯衍生物。加入2mL 蒸馏水破坏乙酸酐,氯仿萃取,待测。 （3）单糖衍生物的GC/ MS 分析色谱条件:RTX25 石英毛细管柱(30m ×0125mm ×0125μm) ;载气为高纯氦气。柱箱初始温度100 ℃,进样口温度240 ℃,流速0166mL·min - 1 ,分流比30∶1 ,进样量1μL 。程序升温:初始温度为100 ℃,以10 ℃·min - 1升至250 ℃,保持1min。 （4）质谱条件:离子源为EI 源,灯丝电流016mA ,离子源温度200 ℃,电离能量70eV ,接口温度250 ℃,电子倍增管电压1120kV ,扫描周期015s ,扫描范围30100～400100m/ z ,溶剂延迟3min。
多糖结构总结．
IR红外分析（）1 的数据和图形对比可以看出，亚硒酸根[图1(a)]从硒化壳聚糖[图1(b)]与壳聚糖主要是由以下的光谱图形和光谱数据C的羟基上，主要连接在C的氨基本上和62-1变为C的氨基硒化后，NH的弯曲振动由1594.52cm变化得到证明：壳聚糖2-1为基的酰的干未基位C聚1523.29cm，壳糖氨上脱净乙基羰振动峰2
-1，而硒化壳聚糖C位上未脱干净的乙酰基1650.32cm的羰基振动峰为2-1，可能是受到C位的羟基上亚硒酸基的影响；同样由于硒化壳聚糖1632.88cm6C位氨基上和C位羟基上亚硒酸根的影响，壳聚糖C-O伸缩振动峰由62-1-1-1处观察到亚硒酸酯的800.00cm1090.41cmSe=O1079.45cm。同时，在变为双键的振动峰。上述红外分析结果表明：壳聚糖与亚硒酸可能是通过C位上的6酯化反应和C位上氨基的静电作用完成的。(硒化壳聚糖的制备及其表征) 2 的对比中可以图4、从羧甲基壳聚糖与硒化羧甲基壳聚糖的红外光谱图图3主要由以下光谱图形C的羟基上。看出, 亚硒酸根主要连接在C位的羧甲基和62-1反对称吸收峰在羧甲基壳聚糖: 1627cm-COOH处的和光谱数据变化得到证明-1
与亚1599cm-COOH, 这可能是羧甲基壳聚糖中的硒化羧甲基壳聚糖中红移至-1伸缩振动在硒化羧甲基壳处的C-O1119cm硒酸钠发生反应, 从而使键力削弱。-1在硒化羧上的羟基也参与了硒化反应。此外, 聚糖中红移至1064cm, 说明 C6-1（硒化羧806.125cm甲基壳聚糖的红外光谱中观测到位于双键振动峰。的Se=O 甲基壳聚糖的合成及表征） 2.X-射线衍射,X射线衍射法是研究多糖的 结晶构型的有效方法。多糖通常是不能结晶的但在适宜的条件下，它可以微晶态存在。所以进行衍射分析的样品必须通过外界的诱导使其中相当部分呈现微晶态。进行衍射的香菇多糖样品一般先制成碱进一步处理制备。孙艳等将从香菇中分离 而得的多糖经,性溶液,然后在水中透析a=b=1. 晶格为六角形确定其立体结构为右手心三度螺旋衍射分析X2,,, 晶格常数 5nm, c =0. 6nm。ZhangP等经X-衍射分析表明:天然香菇多糖具β三股绳 状螺旋型立体结构,但加入尿素或二甲亚砜后立体构型改变,转变为单绳螺旋结 构。（香菇多糖结构分析和构效关系研究进展） 3.拉曼光谱法 拉曼光谱在检测多糖分子的振动相同原子的非极性键和异头物方面效果较好。它侧重于探测多糖生物大分子的空间结构，如平铺折叠或螺旋状等。研究 -1-1926cm954和有很强的拉曼吸收，此外在-D 表明，α螺旋直链淀粉在 865cm-1内对多糖的类500-1500cm有C-O-C 糖苷键的伸缩振动吸收，拉曼 光谱在处 型和糖苷的连接方式的检测灵敏，比红外光谱表现出了更高的分辨率,许多复杂-1区域内。的拉曼吸收谱带都在低于600cm 2.1 Seleno-LP的拉曼光谱 -1-1附近的吸收峰亚硒酸酯中和Seleno-LP的激光拉曼光谱在 911cm699cmSe=O和Se-OH的伸缩振动，而LP在这两处均没有吸收峰。这证实了seleno－LP中存在Se=O键。（兰州百合多糖硒酸酯的合成及表征）
晶体结构解析的过程 (2010-06-10 16:49:31) 转载 分类：晶体解析 标签： 杂谈 1、挑选直径大约为0.1–1.0mm的单晶。 CCD的准直管直径有0.3mm，0.5mm，0.8mm；分别对应得晶体大小是0-0.3mm, 0.3-0.5mm, 0.5-0.8mm. 2、选择用铜靶还是钼靶？ 铜靶要求θmax〉=66度，最大分辨率是0.77埃 钼靶要求θmax〉=25度，最大分辨率是0.36埃 3、用smart程序收集衍射数据：得到大约一千张倒易空间的衍射图像，300M 大小。其中matrix图像45张，分成三组，每组15张，用以判定晶体能否解析。 4、用saint程序还原衍射数据：得到很多文件，但是只有三个文件是我们需要的：-ls，p4p，raw。 -ls文件中包含有最大的和最小的θ角，有效地精修衍射点数目。好像不同的机器或者还原程序得到的文件不同，有的是hkl，abs。 5、用shelxtl程序处理上述数据，并画出需要的图形。 5.1 装好shelxtl程序，新建一个project，输入要建立工程的名字，然后打开要解析的p4p或者raw文件。 5.2 用xprep程序确立空间群，建立指令文件 这个过程基本上是一直按回车键的过程（除了在要输入化学成分的时候改动一下和在是否建立指令文件的时候输入Y即可），一般不会出错。如果出错，那就要重新对空间群进行指认（出错可能是出现在下面的精修过程中）。 一般Mean（I/sigma）〉2才可以，越大越好。
得到ins，hkl，pcf三个重要数据文件。 其中ins文件：包含分子式，空间群等信息； hkl文件：包含的是衍射点的强度数据； pcf文件：记录了晶体物理特征，分子式，空间群，衍射数据收集的条件以及使用的相关软件等信息。 5.3 选择要解析的方法：直接法（TREF）还是帕特深法（PATT）？ 如果晶体中含有重原子如金属原子，那就要用PATT法；如果晶体中没有原子量差异特别大的原子，就用TREF法。默认的方法是直接法。 5.4 用xs程序解析粗结构 得到res文件：包含了ins文件的内容和所有的Q峰信息。 5.5 用xp程序与xl程序完成原子的指认，付利叶加氢或理论加氢，画图等。 达到比较好的结果标准： A 化学上合理（键长、键角、价态） B R1 <0.08（0.06），wR2 <0.18（0.16），goof=S=1+-0.2(1.00) C R(int)<0.1,R(singma)<0.1 D Maximum=0.000 5.5.1 原子的指认 打开xp 输入fmol
论文题目：植物多糖的提取、分离和含量测定的研究 姓名：刘通 班级：08级药学1班 学号：200810720071 1、利用百度搜索引擎查找相关资料 2、利用中国知网的期刊全文数据库查期刊中发表的论文的相关结果
3、利用中国知网学位论文全文数据库查找论文相关资料
4、利用读秀查图书馆收藏的与论文有关资料 5、利用图书馆OPAC查我馆收藏的印刷型图书
植物多糖的提取、分离和含量测定的研究文献综述 对多糖的研究, 最早是在20 世纪40 年代, 但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60 年代, 经过40 余年的不断发展, 人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识, 使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一[ 1 ]。越来越多的研究发现多糖对人体具有极大的利用价值, 按其来源可分为三类: 动物多糖、植物多糖和微生物多糖L 其中植物多糖如人参、黄芩、刺五加、红花、芦荟等所含多糖均具有显著的药用功效, 如免疫增强作用, 抗肿瘤作用, 抗辐射作用等L据文献[ 2 ]报道, 已有近100 种植物的多糖被分离提取出来L 这类多糖来源广泛且没有细胞毒性, 应用于生物体毒副作用小,因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。 1 植物多糖的提取分离纯化 多糖的提取分离纯化是指多糖研究中获取研究对象的过程L一般这一过程包括提取分离、纯化和纯度鉴定3 步L其中纯化是多糖研究的关键, 其成 功与否、效果的好坏都会直接影响后续研究的可行性与可信度[ 3 ]。
1.1 提取分离 一般植物细胞壁比较牢固, 需在提取前进行专门的破细胞操作, 包括 机械破碎(研磨法、组织捣碎法、超声波法、压榨法、冻融法)、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解L因此常用的提取方法有: 热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法和酶法L 其中前3 种为化学方法, 酶法为生物方法。此外, 更有研究者[ 4, 5 ] 在细胞破壁方面进行研究, 利用超声波、微波等技术有效地提高多糖的提取率和产品质量, 并缩短了反应时间。 1.2 纯化 分离沉淀后获得的多糖提取物中, 常会有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物(如低聚糖) 等杂质, 必须分别除去L 多糖的纯化就是指将粗多糖中的杂质去除而获得单一多糖组分。一般是先脱除非多糖组分, 再对多糖组分进行分级L而脱除非多糖组分是先脱除蛋白质再去除小分子杂质。 1.2.1除蛋白天然植物中多糖与蛋白质 两种高分子成分共存, 且分子量相近, 另外糖常常与蛋白形成糖蛋白 复合物, 使蛋白质的脱除更加困难。但也许正是结合了这部分蛋白质, 多糖才具有众多独特的生理功能, 如各种蛋白质聚糖、糖蛋白具有生理功能一样L常用的除蛋白质的方法有Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、酶法等。Sevage 法为实验室常用法, ,该法以正丁醇与氯仿混合再进行萃取; 蛋白酶法是目前认为较好的方法, 将蛋白质水解再透析去除。 1.2.2 脱色 对于植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深, 对其进行脱色可使其 应用范围更加广泛。常用的脱色方法有: 离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等) LDEA E- 纤维素是目前最常用的脱色剂, 通过离子交换柱不仅达到脱色的目的, 而且还可以分离多糖。 1.2.3 除小分子杂质 通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质,这样得到的就是多糖的半精品。
植物多糖的功能 多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。 植物多糖的提取 一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅
多糖结构分析 多糖在生物学上的重要意义，尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但由于多糖结构的复杂性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖（半乳葡萄甘露聚糖）作为实验材料，对其一级结构做初步的分析。 多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。 【实验目的】 1.了解多糖结构分析的内容及方法。 2.了解多糖一级结构分析的基本原理。 3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。 一、糖含量测定 【实验原理】 苯酚—硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm 处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。 【实验材料】 1. 实验器材 721型分光光度计。 2. 实验试剂 (1)98％的浓硫酸。 (2)80％苯酚：80g苯酚加20ml水使之溶解，可置冰箱中避光长期贮存。 (3)6％苯酚：临用前用80％苯酚配制。 (4)标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至1L。 (5)多糖样品：半乳葡萄甘露聚糖溶液（0.1 mg/ml）。 【实验操作】 1. 制作标准曲线： 取9支干燥试管，按下表操作 横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。 2. 样品含量测定： 取样品液1.0ml，按上述步骤操作，测光密度。
3．计算: 糖含量(%)=C /（C0× V）×100% C: 由标准曲线查得的糖微克数 C0：样品溶液的浓度（0.1 mg/ml） V：测定时用的样品溶液体积（1.0ml） 二、单糖组成分析 【实验原理】 多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。 【实验材料】 1. 实验器材 水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。 2. 实验试剂 ⑴标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。 ⑵展层剂：正丁醇：乙酸：水=4：l：5 (上层)。 ⑶显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100 ml，加苯胺0.93g（相当于0.9 ml）。 ⑷BaCO3；1mol/L硫酸。 【实验操作】 l．完全酸水解： 称取20 mg多糖样品，加入1mol/L H2S04 2ml；封管，l00℃水解8小时，然后加入BaC03中和，定量滤纸过滤，滤液留作分析。 2．纸层析： 将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条，距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为36小时。 3．显色： 将滤纸取出，自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100℃条件下15分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是：半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。与标准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。 三、糖链的序列测定 （一）高碘酸氧化 【实验原理】 高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。 【实验材料】
多糖结构研究方法 多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要的作用。多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最基本的4类生命物质。由于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切，因此清楚认识多糖的结构是进行多糖研究和利用的基础。多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，可以说是自然界中最复杂的生物大分子。从化学观点来看，多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复杂性。糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法，即多糖的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要十分丰富。测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；(4)各单糖残基的D-或L．构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间的连接顺序；(6)每个糖苷键所取的a-或B．异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链和非糖部分连接情况；(9)主链和支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四。多糖结构的分析手段很多。不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。 1质谱(MS) 由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。近年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱(FAB—MS)，电喷雾质谱(ESI—MS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展。 (1)快原子轰击质谱(FAB—MS) FAB-MS是上世纪80年代初发展起来的一种新的软电离质谱技术。其显著区别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子的轰击，可直接在基质溶液中电离。FAB-MS的引入使传统质谱技术难以分析的极性强，难挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析，而且对生物大分子的研究取得了重大突破。FAB-MS已被证明是分析糖结构最为有力的方法之一，它不仅可以测定寡糖及其衍生物的分子量，而且可以测定聚合度高于30的糖的分子量。同时，FAB-MS还可以确定糖链中糖残基的连接位点和序列，已广泛用于糖类的分析。 (2)电喷雾质谱(ESI-MS) ESI-MS是将溶液中分子转变成气相离子非常有效的手段，是目前最软的一种电离方式。这种电离方式所产生的分子离子往往带有多电荷。因此ESI-MS可
晶体结构解析步骤Steps to Crystallographic Solution (基于SHELXL97结构解析程序和DOS版SHELXTL画图软件。在DOS下操作) 注意：1. 每一个晶体数据必须在D:/STRUCT下建立一子目录(如D:\STRUCT\AAA)，并将最初的数据备份一份于AAA目录下的子目录ORG; 2. 此处用了STRUCT.BA T批文件，它存在于C:\根目录下，内有path= c:\nix; c:\exe; d:\ struct; c:\windows\system32 (struct为工作目录，exe为SHELXL97程序，nix为SHELXTL画图) 3. 在了解DOS下操作之后，可在WIN的WINGX界面下进行结构解析工作，画图可用XP 或DIAMOND软件进行。 一. 准备 1. 检查是否有inf、dat和f2(设为sss.f2)文件 2. 用EDIT或记事本打开dat或inf文件, 并于记录本上记录下相关数据(下面所说的记录均指记录于记录本上)： ⊕从% crystal data项中，记下晶胞参数及标准偏差(cell)；晶体大小(crystal size)；颜色(crystal color)；形状(crystal habit)；测量温度(experiment temperature)； ⊕从R merge项中，记下Rint＝?.???? %； ⊕从total reflections项中，记下总点数； ⊕从unique reflections项中，记下独立点数 3. 双击桌面的DOS图标(或Win2000与WinNT的“命令提示符”) 4. 键入STRUCT(属于命令，大小写均可。下同) 5. 进入欲处理的数据所在的文件夹(上面的1~2工作也可在这之后进行) 6. 键入XPREP sss.f2 (屏幕显示DOS的选择菜单) 7. 选择[4]，回车(下记为) 8. 输入晶胞参数(建议在一行内将6个参数输入，核对后) 9. 一系列运行(对应的操作动作均为按)之后，输入分子式(如, Cu2SO4N2C4H12。此分子式仅为估计之用。注意：反应中所有元素都应尽可能出现，以避免后续处理的麻烦) 10. 退出XPREP运行之前，机器要求输入文件名，此时一定要输入文件名，且不与初始的文件名同名。另外，不要输入扩展名。如可输入aaa 11. 检查是否产生有PRP、PAR和INS文件(PRP文件内有机器对空间群确定的简要说明) 12. 更名：REN aaa.f2 aaa.hkl 13. 用EDIT或记事本打开aaa.ins文件，在第二~三行中，用实际的数据更改晶胞参数及其偏差(注意：当取向改变了，晶胞参数也应随之对应)，波长用实际波长。 二．解结构 14. 键入SHELXS aaa或XS aaa，(INS文件中, TREF为直接法，PATT为Pattersion法) 15. XP，(进入XP程序)(可能产生计算内址冲突问题，注意选择处理) 16. READ or REAP aaa (aaa.res 为缺省值，若其它文件应是文件名.扩展名，如aaa.ins) 17. FMOL, (不要H原子时，为FMOL LESS $H，或FMOL后，KILL $H, ) (读取各参数，屏幕上显示各原子的键合情况) 18. MPLN/N, (机器认为最好取向) 19. PROJ, (随意转动，直至你认为最理想取向)
经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。 检查纯度最常用的判断方法： （1）用G C 、HPLC测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。 用不同的柱型测定结果更为可靠。 （2）电泳只出现一条带。 如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。 （3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。 阴离子交换层析纯化 用DEAE一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/LNaCl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一对称峰。 按照Ye等报道,采用DEAE一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。DEAE一纤维素凝胶预处理:称取DEAE一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性。处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用. 糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子层析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行分段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制DEAE 一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaCI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。 初步纯化多糖得率计算公式: 多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% 葡聚糖凝胶层析纯化 采用Sephadex G-100凝胶层析法对DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexG一100)的预处理:称取sephadexG一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比(ml/g )的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1MNa2SO4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3个柱体积备用。
一：多糖中的单糖组分分析 一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.5~3M硫酸或1~6M盐酸，80℃~100℃水解2.5~8h 即可。或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100℃水解15min，30min，45min 等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。 二：相邻单糖基连接方式分析 将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。结合13C-NMR确定连接位置。 三：端基碳苷键构型分析 1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无α-苷键，与纤维素酶有作用者，存在β-苷键。2；IR：α-型差向异构体的C-H键在844±8cm￣1处有一个吸收峰；β-型的C-H键在891±7cm￣处有一个吸收峰。但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的α-型和β-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。 3：1H-NMR：端基碳的δ值大于5.00ppm者，糖苷键为α-型，小于5.00ppm者，则为β-型。4；13C-NMR：α-型连接的C?化学位移在97-101ppm，β-型的在103~105ppm。对甘露聚糖不能用化学位移判断α-型或β-型。可用裂分常数决定，一般1Jｃ-ｈ=170HZ，为α-型，160HZ 者为β-型。 四：不同苷键组成比例及直链或环状结构分析 不同糖苷键糖基比例分析可通过测13C-NMR光谱相对面积来完成。可通过连接苷键的C-1相对峰面积的测定确定苷键糖基的比例。α-（1-4）在直链和环状结构中其C?与C?的化学位移值均有差异，与文献值对照便可判断是直链或是环状结构。在IR中：一般地，吡喃糖苷在1100-1010 cm￣1间有三个强吸收峰，而呋喃苷在相应区域只有两个峰。 以上摘自盛家荣等多糖的提取、分离及结构分析广西师院学报（自然科学版）1999年12月第16卷第4期 一：多糖的纯度检查： 1：比旋度法：比旋度相同者为均一组分。