微生物多样研究中的—微生物深度分析概述
一、微生物深度分析方法核心思想
?复杂微生物群落解构的核心思想：
不预设任何假定，客观地观测整个微生物组所发生的一系列结构性变化特征，最终识别出与疾病或所关注的表型相关的关键微生物物种、基因和代谢产物。
?进行微生物群体关联分析，需要结合两大类传统的统计分析方法：1）无监督学习（Unsupervised learning）
2）有监督学习（Supervised learning）
?无监督学习：基于对数据结构的自然分解和观察。
?主要包括以下三类方法：
1）主成分分析（Principal component analysis，PCA）；
2）多维尺度分析（Multidimensional scaling，MDS）；
3）聚类分析（Clustering analysis）
二、微生物深度分析方法—关联分析
?有监督的学习：则是基于某种已知的样品间相互关系，尽可能地按照这种关系提取原始数据中的相关信息。
?传统的有监督学习方法包括：
?冗余分析（Redundancy analysis，RDA）
?典型相关分析（Canonical analysis）
?偏最小二乘判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）?……等约束排序方法（Constrained ordination）。
三、微生物深度分析方法—多维度结合分析
※考虑微生物群落成员之间的系统发育关系，可以将这些有监督的学习方法与无监督的多维尺度分析相结合。
即：把通过给定样品间距离进行线性变换分解得到的新变量用于有监督的学习。由此衍生出基于距离的冗余分析（Distance-based redundancy analysis，db-RDA ）和主坐标典型相关分析（Canonical analysis of principal coordinates，CAP）
▲通过约束排序，可以对群落样品间的相互关系是否遵循已知样品分布规律做出判断。
四、随机森林算法
?随机森林（Random Forests）方法找寻关键变量。
?随机森林：是一种基于决策树（Decision tree）的高效的机器学习算法，可以用于对样品进行分类（Classification），也可以用于回归分析（Regression）。
?随机森林属于非线性分类器，因此可以挖掘变量之间复杂的非线性的相互依赖关系。
五、ROC 曲线
?接收者操作特征曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）也是一种有效的有监督学习方法。
?ROC 分析属于二元分类算法，用来处理只有两种分类的问题，可以用于选择最佳的判别模型。
六、LEfSe分析
?LEfSe分析：基于线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA）效应量（Effect size）的分析方法。
?本质是将线性判别分析与非参数的Kruskal-Wallis 以及Wilcoxon 秩和检验相结合，从而筛选关键的生物标记物（也就是关键群落成员）。
七、基于微生物成员之间的网络推断分析
?这类分析的根本目的：考察不同群落成员之间的相互作用，通过关联分析的方法，找寻群落成员在不同生境下共同出现（Co-occurrence）或彼此排斥（Co-exclusion）的相互作用模式，从而推断不同微生物类群之间可能的“协作”或“竞争”关系。
八、基于微生物成员之间网络推断分析的延伸和发展
?发展延伸的领域：肠道元基因组学领域的一系列研究又在此概念的基础上更进一步，发展出了
?“丰度共变化的基因类群”（Co-abundance genegroups，CAGs）
?“元基因组学物种”（Metagenomic species，MGS）
?……等新名词，对于阐释元基因组学的复杂数据提供了全新的思路和办法。
安庆师范学院本科毕业（学位）论文 姓名：王婷婷 年级： 2 0 0 7级 专业：环境科学 论文题目：微生物多样性对植物 群落影响的研究进展 完成日期：2011年4月27日 指导老师：潘少兵 安庆师范学院资源环境学院 二O一一年四月二十七日
微生物多样性对植物群落影响的研究进展 作者：王婷婷指导老师：潘少兵 （安庆师范学院资源环境学院安徽安庆246011） 摘要：土壤是微生物的主要存在场所，它承载了大部分生命的基因多样性。微生物群落在各种生态进程中具有重要作用，但是对于微生物多样性与执行生态功能能力的联系却研究的很有限。这篇文章以微生物多样性在植物群落方面的作用为基础，探讨微生物群落在执行生态功能中的冗余现象。 关键词：微生物多样性；功能冗余；植物多样性 Advancement of Effect of Microbial Diversity on Plant Diversity Autor：Wang Tingting Instructor: Pan Shaobing （School of Resources and environmental science,Anqing Teachers’College,Anqing 246011,Anhui） Abstract: Microbes are abundant in soil and comprise a large portion of Life's genetic diversity. Soil microbes play key roles in a large number of important ecosystem process- es. But the relativity between soil microbial diversity and their ecological functions is still poorly understood. Here we approach the functional redundances during soil microb- es influencing the ecological functions based on the various roles that they play in plant diversity. Key words：microbial diversity, functional redundances, plant diversity 引言： 土壤是微生物的主要存在场所，微生物在土壤养分转化与腐殖质形成过程中有着非常重要的作用。土壤生态系统是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础[1],对全球的生态环境变化有着深远的影响。土壤微生物群落是土壤中的活性组分, 包括细菌、真菌、放线菌和原生动物、病毒和小型藻类[2],每克土壤中栖息着大约100 亿个微生物[3]。土壤微生物群落对全球生态系统功能如养分转化、有机物的分解、土壤基本结构的维持、
微生物多样研究中的—β多样性分析概述
一、β-多样性分析介绍 1. β（Beta）Diversity： 是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。 ?β多样性分析前的数据“来源”： 1）OTUs的丰度信息表； 2）OTUs之间的系统发生关系， 计算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距离。 ?通过多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。
2. PCA & PCoA分析 ?主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。 ?主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。 ?多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。
3.UniFrac距离 ?由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。 ?因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 ?基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度。
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
生物多样性 2012, 20 (5): 572–580 Doi: 10.3724/SP.J.1003.2012.10129 Biodiversity Science http: //https://www.doczj.com/doc/c114638112.html, —————————————————— 收稿日期: 2012-06-13; 接受日期: 2012-08-10 基金项目: 国家自然科学基金重点项目(30930005) ? 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: guold@https://www.doczj.com/doc/c114638112.html, 中国微生物物种多样性研究进展 郭良栋* (中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101) 摘要: 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 具有丰富的物种多样性。我国地域辽阔, 跨越热带至寒温带, 气候条件多样, 地理环境与生态系统类型复杂, 是世界上生物多样性最丰富的国家之一。我国已开展了大量微生物多样性研究, 并证实我国多样的生境蕴藏着丰富的微生物物种多样性。目前我国已报道真核微生物(菌物)约14,700种, 其中包括真菌约14,060种、卵菌约300种、黏菌约340种, 而真菌中有药用菌473种、食用菌966个分类单元。特别是近年来通过免培养的分子生物学技术发现我国存在丰富的原核微生物多样性。本文概述了传统方法和现代分子生物学技术在我国原核微生物(古菌、细菌)和真核微生物(真菌、卵菌、黏菌)物种多样性研究的最新进展。 关键词: 真核微生物, 原核微生物, 物种多样性, 培养方法, 分子技术 Progress of microbial species diversity research in China Liangdong Guo * State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101 Abstract: Microbes with rich species and genetic diversity are widely distributed throughout various habitats in the world. China possesses a variety of climate zones, geographic environments, and complex ecosystems, which play a large role shaping the complex biodiversity of this country. Microbial diversity has been widely studied and well documented by Chinese scientists. For example, a total of ca. 14,700 eukaryotic microbe species have been recorded, including ca. 14,060 fungi, ca. 300 oomycetes, and ca. 340 slime molds. Within the Fungi, there have been 473 medicinal fungal species and 966 edible fungal taxa recorded. However, re-cent studies have documented much high species diversity of prokaryotic microbes using molecular tech-niques, which have greatly promoted the study level of microbial diversity in China. This review paper sum-marizes recent research progress of microbial (i.e., archaea, bacteria, fungi, oomycetes, and slime molds) di-versity in China based on traditional and molecular techniques. Key words: eukaryotic microbe, prokaryotic microbe, species diversity, cultivation method, molecular technique 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 可利用各种有机化合物、无机盐等作为能源, 在有氧或无氧条件下, 在寒冷的极地、高达100℃的热泉或高盐碱度等极端环境中生活。微生物具有丰富的物种和遗传多样性, 并以高度的变异性适应不同的生境。作为生态系统中的重要组分, 微生物在自然界的物质与能量循环、生态系统的演替以及生物多样性的维持中发挥重要的生态功能。微生物与人类的生活休戚相关, 在直 接或间接地为人类提供了极其丰富的物质资源的同时, 也为人类带来了巨大危害。 Woese 和Fox(1977)以核糖体RNA(rRNA)的小亚基(原核生物的16S 、真核生物的18S 基因)序列为依据, 提出了独立于真细菌(Eubacteria)和真核生物(Urkaryotes)之外的第三种生命形式——古菌(Archaea), 认为它和真核生物以及真细菌是从一个具有原始遗传机制的共同祖先分别进化而来。随后Woese 等(1990)提出了三域(Domain)分类系统, 将
第一章微生物的概述 一.微生物是一群个体微小，结构简单，肉眼不能直接看见的微小生物的总称，必须借助显微镜。 二．微生物类型非细胞型微生物；这类微生物无细胞结构，可由一种核酸和蛋白质衣壳组成，有的仅为一种核酸或仅有蛋白质而没有核酸，它们必须寄生于活的易感细胞中生长繁殖。此类微生物如病毒，类病毒，阮病毒。 原核细胞型微生物；这类微生物由单细胞组成，细胞核分化程度低，无核膜，核仁，染色体为裸露的DNA分子，胞浆中缺乏完整的细胞器。此类微生物包括古菌，细菌，蓝细菌，放线菌，支原体，衣原体，立克次体和螺旋体。除古菌外，其他原 核细胞型微生物由于它们细胞水平的结构和组成相近，故被列入广义的细菌范畴。 真核细胞型微生物；这类微生物细胞核分化程度高，有核膜，核仁和染色体，胞浆内有完整的细胞器。此类微生物有真菌，单细胞藻类和原核生物 三．17世纪列文虎克发明了显微镜巴斯德微生物之父巴氏消毒法Florey分离青霉素 第二章微生物的生理与代谢 一.微生物的化学组成；固体物质是由氢，氧，氮，磷，硫，钾，钙，镁，铁等主要化学元素组成，其中碳，氢，氧，氮是组成有机物的四大元素，占90％-97％.极微的硼，锌，钼，钴，碘，镍，钒等微量元素。 二．原核原核微生物；肽聚糖，磷壁酸，D型氨基酸，二氨基庚二酸，吡啶二羧酸。 三.微生物的营养物质；水，碳源，氮源，无机盐，生长因子。 四.微生物的生长繁殖条件；1.水，碳源，氮源，无机盐，生长因子 2.最适ph为7.2-7.6 3.最适的生长温度为37度。 4.需氧气和二氧化碳，有的需要氮。 五.细菌以二分裂方式进行无性繁殖，大多数细菌20-30分钟即可繁殖一代。 六.细菌的生长曲线 1.迟缓期 2.对数期意义1此时期菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适年龄，生产 上用于接种的最佳菌龄。2发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度。3是生理代谢及遗传研究的最 佳时期。4观察研究细菌的性状，均应选用该期的细菌以获得准确的结果。 3.稳定期意义1发酵生产产物形成的重要时期，产物积累达到最高，生产上应尽量通过补充营养物质，调节温度和ph等措施， 延长稳定期，以提高产量。2.活细胞数目稳定，用于计数细菌的最大生长量。 4.衰亡期 七．病毒，立克次体，衣原体等必需在活细胞内才能增殖，所以实验室分离培养这类微生物主要用动物接种，鸡胚培养法，细胞培养法。 八．细菌的合成代谢产物包括热原质，毒素和侵袭物质，细菌素，色素，抗生素以及维生素 1.热原质又称致热原，是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质。 2.抗生素是由某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死某些病原微生物和肿瘤细胞的物质。 第三章微生物的分布与控制 一.人类体表与外界相通的腔道，如上呼吸道，口腔，泌尿生殖道存在不同种类和数量的微 生物，这些微生物通常对人体无害，成为人体的正常微生物群，称正常菌群。 二.正常菌群的作用；1.生物屏障与拮抗作用。2免疫作用。3营养作用。4.抗衰老作用。5.抗肿瘤作用。 三.但在一定条件下，正常菌群与宿主之间的生态平衡被打破，原来不致病的正常菌群也可引起疾病，这种在通常情况下不致病，但在一定条件下能引起疾病的菌群，称条件致病菌。 四.引起机会性感染的条件；1寄居部位改变。2免疫功能低下。3菌群失调。 五.医院感染；又称为医院内感染，系指包括医院内各类人群所获得的感染。 六.消毒；杀死物体中的病原微生物，但不一定杀死芽孢和部分非病原微生物的方法，称消毒。用于消灭化学药品为消毒剂。 七．灭菌；杀死物体上所有微生物，包括芽孢与繁殖体，病原菌与非病原菌的方法称为灭菌。 八.无菌操作；在特定条件下，防止微生物进入操作对象的操作方法称为无菌操作。进行微生物实验时，外科手术和制备无菌制剂时，必须严格进行无菌操作。 九.巴氏消毒法；1 63度，加热30分钟。2高温瞬时法，即72度加热15-30秒。
微生物概述
微生物 一、微生物的探究历程 1、荷兰人列文.虎克：显微镜的发明者，1674年观察发现了杆菌、球菌和原生动物，他称为“小动物”，并向英国皇家学会写信介绍自己的发现，首次揭示了一个崭新的微生物世界。 2、巴斯德（法国，近代微生物的奠基人，微生物学家） （１）否定“自然发生说”……“生生说”（曲颈瓶实验）：将营养液(如肉汤)装入带有弯曲细管的瓶中，弯管是开口的。巴斯德将瓶中液体煮沸，使肉汤中的微生物全被杀死，然后放冷静置，结果瓶中不发生微生物。空气可无阻地进入瓶中，而空气中的微生物则被阻而沉积于弯管底部，不能进入瓶中。 （２）巴氏消毒法（62度，30分钟）：用于牛奶、奶酪、啤酒 （３）发明了炭疽病疫苗和狂犬病疫苗 3、科赫：1843-1910年德国细菌学家： ?1876年，科赫发明了固体培养基，将微生物样品稀释后，用针尖沾取少量的稀释菌液在固体培养基上划线，不久培养基的表面就会长出多种菌落。他用实验证实了“生生论” ?1882年发现并分离出了引起肺结核的病原菌和结核分支杆菌； ?1905年，科赫因结核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学及医学奖。
二、微生物的种类 1、古细菌：生活在极端环境下 细胞壁组成与真细菌不同 青霉素不能抑制细胞壁的形成 对抗生素利富平不敏感。（利富平抑制细菌RNA的合成） 2、真细菌 （１）结构细胞壁：与植物细胞壁成分（纤维素和果胶）不同，为肽聚糖细胞质：只有核糖体这一种细胞器，还存在质 粒（小型环状DNA分子，基因工程目 的基因的运载体） 细胞膜： 拟核：分布DNA （２）芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。 （３）绝大多数属于分解者，也有属于生产者（蓝细菌、光合细菌、硝化细菌）。 3、真菌（酵母――单细胞，出芽或孢子生殖。霉菌――青霉、根霉、曲霉。蕈（xun）――蘑菇、香菇、平菇、金针菇）真核细胞壁细胞核细胞膜细胞质液泡
变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） 普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。 实验流程图： 实验结果 实验结果包括以下内容 1 引物设计 以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。 引物序列（5’-3’）
细菌 16S V3 区扩 增引物 357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 518r ATTACCGCGGCTGCTGG 引物 序列（5’-3’） 真核 18S V1-3区扩增引物 Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG EukA516r-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC 2 基因组DNA 抽提电泳检测图 针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。 说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。 3 目的片段PCR 检测 说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。 Reconditioning PCR： 第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之
微生物概述习题（一） 1.(2018年护理类高考题）属于非细胞型微生物的是 A.衣原体 B.病毒 C.原虫 D.真菌 答案：B 分析：本题考查微生物的分类。微生物分为三：①非细胞型微生物：如病毒；②原核细胞型微生物：如细菌，支原体，衣原体，螺旋体等；③真核细胞型微生物：如真菌。病毒属于非细胞微生物。所以答案选A。 2.(2018年护理类高考题）下列属于细菌特殊结构的是 A.极体 B.荚膜 C.质粒 D.中介体 答案：B 分析：本题考查细菌的特殊结构。细菌的特殊结构包括鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢。所以答案选B。 3.(2018年护理类高考题)与致病性有关的组菌代谢产物是 A.维生素 B.热原质 C.色素 D.细菌素
答案：B 分析：本题考查细菌的合成代谢产物及意义。其中具有致病性的是热原质、毒素和侵袭性酶，维生素、色素好细菌素是不致病的。所以答案选B。 4.(2018年医药类高考题）细菌的测量单位是 A.纳米 B.微米 C.毫米 D.厘米 答案：B 分析：本题考查细菌的测量单位。细菌的测量单位是微米。所以答案选B。 5.(2015年山东高考题）关于细菌荚膜的说法，错误的是 A.与其致病性有关 B.具有免疫原性 C.多由蛋白质构成 D.具有抗干燥作用 答案：C 分析：本题考查细菌荚膜的特性。细菌荚膜具有抵抗吞噬细胞的吞噬作用，与细菌致病性有关；荚膜成分具有免疫原性；多数细菌的荚膜为多糖；荚膜还具有抗干燥作用。所以答案选C。 6.(2015年山东护理类高考题）细菌的合成代谢产物中一般不致病的是 A.维生素
B.毒素 C.侵袭性酶 D.热原质 答案：A 分析：本题考查细菌的合成代谢产物及意义。其中具有致病性的是热原质、毒素和侵袭性酶。细菌合成的维生素是不致命的，并可供人体吸收利用。所以答案选A. 二、简答题 1.(2018年医药类高考题）简述细菌生长繁殖的条件，金黄色葡萄球菌的主要致病物质。 答：细菌生长繁殖的条件：营养物质、酸碱度、温度和气体； 金黄色葡萄球菌的主要致病物质：凝固酶、葡萄球菌溶茶、杀白细胞素和肠毒素。 练习题 1.关于原核细胞型微生物的特点，正确的的是 A.有细胞壁但不含肽聚糖 B.无核膜、核仁，核质为裸露环状DNA C.细胞核内含染色体遗传物质 D.含有线粒体、内质网、溶酶体等细胞器 2.原核细胞型微生物不包括
姓名：崔靖璞学号：2010212802 专业：生物科学 微生物多样性研究进展 摘要：微生物资源丰富,开发潜力巨大,是生命科学发展的主要动力之一.本文介绍了几种常用的研究微生物多样性的分子生物学技术,主要包括:16SrDNA测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等,并对微生物多样性研究技术的未来发展进行了展望，同时本文也介绍几种微生物多样性的研究实验方法。 关键词:微生物多样性聚合酶链式反应基因芯片平板纯培养 微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发,是21世纪生命科学发展的主要动力之一.由于微生物的微观性,微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处,包括:生存环境多样;生长、繁殖速度多样;营养、代谢类型多样;生活方式多样.微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的,研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量.近年来,随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等技术的发展,微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展.各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观.现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性.目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:16SrDNA 测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。 1核酸探针杂交技术 核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术.该技术快速、灵敏、具有高度特异性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中.用于微生物多样性研究的探针主要有三类:双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针,杂交方式主要有荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、全细胞杂交(whole-cell hybridization)、数量印迹杂交(quantitative dot blot)及生物芯片(biochip).对于环境微生物样品解析而言,最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术,在原位杂交技术中,应用最广泛的是荧光原位杂交技术。
课堂报告名称：微生物的基本特征 一、课堂报告依据的知识背景 食品微生物学是基础微生物学的一个重要分支，属于应用微生物学的范畴，今年来随着分子生物技术的不断发展，许多新技术也越来越多的应用到食品微生物学的领域。要了解微生物学，首先要了解什么是微生物，其基本特征有哪些，然后我们才能对其进一步的研究、应用。微生物种类资源丰富，目前利用率不高，开发微生物不像稀有动物，微生物繁殖快，属于可再生资源。适应能力强，用途广。 二、撰写课堂报告的目的 本次报告主要通过对微生物的定义、分类、基本结构、结构功能等方面进行讲述，使大家对微生物有基本的了解，另外，在此基础上能够了解不同微生物再结构与功能上的差异。 三、撰写课堂报告的思路 根据本次课堂报告目的，从微生物的三大类原核生物、真核生物、病毒分别对其形态、结构以及功能进行阐述 四、课堂报告的正文 （一）原核微生物 1.单个细菌形态 a)球菌：细胞球形或椭圆形，当几个球菌连在一起是
接触面扁平。 单球菌：细胞沿一个平面进行分裂，子细胞分散而单独存在。 双球菌：细胞沿一个平面分裂，子细胞成双排列。 链球菌：细胞沿一个平面分裂而第二次细胞分裂与第一次分裂面平行，子细胞呈链状排列。 四联球菌：细胞按两个互相垂直的平面分裂，子细胞呈田字形排列。 八叠球菌：细胞按三个互相垂直平面进行分裂，子细胞t 特征性叠在一起呈立方体排列。 葡萄球菌：细胞分裂无定向，子细胞呈葡萄状排列。 b)杆菌：杆状或类似杆状的细菌。各种杆菌的大小、长短、弯度、粗细差异较大。排列一般分散存在，无一定排列形式。排列一般分散存在，无一定排列形式。 c)螺旋菌：细胞呈弯曲状的细菌。 弧菌，细胞短，不满一圈仅有一次弯曲，呈弧状，如脱硫弧菌。 螺旋菌，细胞为2次以上弯曲、呈螺旋形，较坚韧，如小
第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
抗微生物药物概论 [基本内容] 化疗、抗菌药物、抗菌谱、抗菌活性、抑菌药、杀菌药、化疗指数和抗菌后效应等概念。抗菌药物的作用机制。细菌耐药性及其产生机制。抗微生物药物的合理应用。 [基本要求] 掌握：抗菌谱、抗菌活性、抑菌药、杀菌药、化疗指数及抗菌后效应的概念；抗菌药物的作用机制。 了解：细菌的耐药性和抗微生物药物的合理应用。 一、基本概念 化学治疗（简称化疗）： 是指用化学药物抑制或杀灭机体内的病原微生物（包括病毒、支原体、衣原体、立克次体、细菌、螺旋体、真菌）、寄生虫及恶性肿瘤细胞，消除或缓解由它们所引起的疾病。所用的药物简称化疗药物。 抗菌药物： 由生物包括微生物（如细菌、真菌、放线菌）、植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响其他生物功能的有机物质---抗生素及由人工半合成、全合成的一类化学药物的总称。 抗菌谱：每种药物抑制或杀灭病原菌的范围，分为广谱抗菌药和窄谱抗菌药。 抗菌活性：抗菌药物抑制或杀灭病原菌的能力。 抑菌药：仅有抑制病原菌生长、繁殖而无杀灭作用的药物。 最低抑菌浓度（MIC）：抑制培养基内细菌生长的最低浓度。 杀菌药：不仅能抑制而且能杀灭病原菌的药物。 最低杀菌浓度（MBC）：杀灭培养基内细菌（即杀死99.9%供试微生物）的最低浓度。化疗指数： 评价药物的安全性，通常用某药的动物半数致死量（LD50）与该药对动物的半数有效量（ED50）的比值来表示。 抗菌后效应（PAE）： 当抗菌药物和细菌接触一定时间后，药物浓度逐渐下降，低于最小抑菌浓度或药物全部排出以后，仍然对细菌的生长繁殖继续有抑制作用，此种现象称为抗菌后效应。
微生物物种多样性研究进展 微生物是分布最为广泛的生命形式，几乎分布到地球上的所有生境，可利用各种有机化合物、无机盐等作为能源，在有氧或无氧条件下，在寒冷的极地、高达100℃的热泉或高盐碱度等极端环境中生活。微生物具有丰富的物种和遗传多样性，并以高度的变异性适应不同的生境。作为生态系统中的重要组分，微生物在自然界的物质与能量循环、生态系统的演替以及生物多样性的维持中发挥重要的生态功能。微生物与人类的生活休戚相关，在直接或间接地为人类提供了极其丰富的物质资源的同时，也为人类带来了巨大危害。Woese和Fox(1977)以核糖体RNA(rRNA)的小亚基(原核生物的16S、真核生物的18S基因)序列为依据，提出了独立于真细菌(Eubacteria)和真核生物(Urkaryotes) 之外的第三种生命形式——古菌(Archaea)，认为它和真核生物以及真细菌是从一个具有原始遗传机制的共同祖先分别进化而来。随后Woese等(1990)提出了三域(Domain)分类系统，将地球上的生物分别归为细菌域(Domain Bacteria)、古菌域(Domain Archaea)和真核生物域(Domain Eukarya)，其中古菌在进化谱系上更接近真核生物，但在细胞构造上与细菌较为接近，同属原核生物而真菌与动物、植物等生物属于真核生物域。 我国地域辽阔，跨越热带至寒温带，气候条件多样，地理环境与生态系统类型复杂，是世界上生物多样性最丰富的国家之一。而多样的生境蕴藏着丰富的微生物多样性。特别是近年来微生物多样性的研究由传统的培养方法，逐渐转向以免培养的分子生物学技术为主，如DNA的指纹图谱、分子杂交、克隆文库测序、高通量测序(pyroseqencing)、稳定性同位素探测(stable isotope probing，SIP)、基因芯片(gene chip)以及转录组学等技术。我国学者利用先进的分子生物学技术，极大地提高了我国微生物多样性的研究水平。 1 古菌多样性 目前古菌域包括5个门：广古菌门、泉古菌门、奇古菌门、纳米古菌门和初古菌门。古菌主要生活在极端环境中，如海底、陆地热泉、火山口以及盐碱湖等，最近发现古菌也在土壤、湖泊以及动物肠道等中温环境中广泛存在。据Mora等(2011)的不完全统计，目前全世界已报道可培养的古菌有503种。 我国在古菌多样性研究方面取得了重要进展，如在ISI Web of Knowledge 数据库中检索结果表明，自1999年以来我国学者在国际微生物分类学界公认的权威期刊International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM，2000 年前为International Journal of Systematic Bacteriology)和Extremophiles上发表了50篇古菌分类文章，总共报道了61种可培养的古菌新种。如Xu等(1999)从我国西藏盐碱湖底泥中分离到两种嗜盐碱古菌新种Natronorubrum bangense和N. tibetense，随后我国学者相继从新疆的盐湖、内蒙古碱湖、云南腾冲热泉、江苏和福建等地的盐场、山东胜利油田、青藏高原高寒湿地和柴达木盆地内陆咸、淡水湖，以及黑龙江大庆的盐碱地土壤等样本中分离得到了嗜/耐盐碱古菌、嗜热酸的硫化叶菌、产甲烷古菌、极端嗜热古菌新种。 由于古菌常生活在极端环境中，仅凭常规的分离培养方法难以全面反映自然环境中古菌的多样性。因此，近年来我国学者利用免培养的分子生物学技术开展了大量的古菌多样性与功能研究。如利用克隆文库测序和SIP技术发现水稻根际土壤中具有丰富的古菌多样性，而且RC-I (Rice Cluster I)古菌类群在稻田
微生物概述 （一）微生物（microorganism, microbe）的概念 微生物是指广泛存在于自然界，体形微小，具有一定形态结构，能在适宜的环境中生长繁殖以及发生遗传变异的一大类微小生物。 包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。 （二）微生物的特点 1、种类多、分布广：现在已经知道的微生物有十万种左右；微生物在土壤中的数量最多，据统计，一克土壤中含有几千万到几百亿的微生物。 2、个体小、胃口大：每毫克大肠杆菌细胞的表面积比每毫克人细胞的表面积大30万被左右；积极活动 的大肠杆菌，每小时能消耗它体重2000倍的乳糖； 3、繁殖速、转化快：细菌一般每20~30分钟既可分裂一次；生产味精的谷氨酸短杆菌，在52小时内细 胞数目增加了32亿倍；乳酸菌每小时可产生为其体重1000~10000倍的乳酸；一种产朊假丝酵母合成蛋白质的能力是大豆的100倍，比食用公牛强10000倍； 4、适应强、变异易：一九四三年分离到的青霉素产生菌，在每毫升发酵液中只能分泌20单位左右的青 霉素，通过60多年来的不断育种，加上其他条件的改进，目前每毫升已经超过10万单位。 （三）微生物的分类： 1、按微生物的作用分：有用的（污水外理）、无害的（肠道菌丛）、有害的（引起腐烂）、危 险的（致病菌）。 2、按革兰氏染色反应分： 3、按温度分：嗜冷菌、嗜温菌（金葡球菌）、嗜热菌（芽孢杆菌） 4、按PH分：嗜酸菌（乳酸杆菌）、嗜中性菌（芽孢杆菌）、嗜硷菌（弧菌） 5、按食物来源分：自养型和异养型 6、按对氧气的需求分类：需氧菌和厌氧菌 7、按形态人结构分：主要分细菌、真菌、病毒。人们研究得最多、也较深入的主要有细菌、放线 菌、蓝细菌、枝原体、立克次氏体、古菌、真菌、显微藻类、原生动物、病毒、类病毒和朊病毒等。 现择要介绍：细菌放线菌霉菌酵母菌病毒及其产物 各类微生物简介 （一）细菌： 1、细菌是一类细胞细而短、结构简单、细胞壁坚韧，以二等分裂方式繁殖的原核微生物，分布广泛。 2、细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中 央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。可作为鉴定细菌种的依据。 （二）放线菌 ?放线菌的形态、大小和结构 1、放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细 丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。 2、根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是 放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其形态如下图所示。
环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不
基于二代高通量测序的环境微生物多样性分析 一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究，而变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发现困难等因素无法达到深入分析环境微生物多样性的目的。高通量测序技术的出现，极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。 微生物群落中物种的多样性依然是目前研究的重点。对群落结构的研究，将有助于了解种群结构的稳定性，进而了解种群内物种间的相互依赖、相互制约的内在联系，为将来构建功能性种群服务。鉴于微生物群落是一个多物种的集合体，其中高达95%以上的微生物物种无法分离也不能独立培养，拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现，细菌16S 或真菌ITS测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石。 一、高通量测序背景介绍 高通量测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对PCR扩增产物直接进行序列测定成为可能。极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前高通量测序的主要平台代表有Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）、罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。微生物多样性分析中，以Illumina 及454测序平台应用最为广泛。 二、工作流程 1 PCR引物的设计 2 PCR扩增条件摸索 3琼脂糖凝胶电泳检测结果 4 全部样品进行PCR 5 PCR产物的凝胶回收及检测 6 PCR产物精确定量（Qubit 2.0 ）