第二十章酶免疫技术
Chapter 20 Enzyme Immunoassay
第一部分教学内容和要求
一、目的要求
·掌握：酶联免疫吸附试验、免疫印迹技术、BAS-ELISA的方法类型、原理、技术要点及临床应用；熟悉：其它酶免疫技术的类型及应用；了解：酶免疫技术中常用的酶及其底物的种类、特性，酶标记方法及其评价，标记物的纯化、鉴定及保存。
二、教学内容
1。概述：原理，酶及底物，酶标记抗体或抗原的方法，酶标记物的纯化及鉴定，酶标分析仪，酶免疫技术的类型。
2。酶免疫组织化学技术：酶标记抗体免疫组化技术，非标记抗体酶免疫组化技术，酶标记免疫电镜技术。3。酶联免疫吸附试验：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价。
4. 膜载体的酶免疫技术：斑点-酶联免疫吸附试验，斑点-酶免疫渗滤试验，免疫层析试验，免疫印迹法。
5. 生物素-亲和素系统酶联免疫吸附试验：BAS，BAS-ELISA
6. 酶免疫测定的应用。
第二部分测试题
一、选择题
(一)单项选择题（A型题）
1.HRP的活性基团是
A.糖蛋白
B.亚铁血红素
C.白蛋白
D.球蛋白
E.色氨酸
2.表示HRP纯度（RZ）的是
A.λ403nm/λ275nm
B.λ420nm/λ275nm
C.λ403nm/λ290nm
D.λ275nm/λ403nm
E.λ290nm/λ275nm
3. HRP（用于标记）的RZ值应大于
A.3.0
B.3.1
C.3.2
D.3.3
E.3.4
4.β-Gal的常用底物是
A.OPD
B.TMB
C.5-ASA
D.ABTS
E.4MUG
5.下列酶-底物-颜色反应组合中，正确的是
A.HRP—OPD—蓝色
B.HRP—TMB—红色
C.AP—P-NPP—黄色
D.HRP—P-NPP—蓝色
E.AP—TMB—蓝色
6.EMIT测定可以测定
A.大分子抗原
B.小分子抗原或半抗原
C.补体
D.PcAb
E.McAb
7.应用最广泛的均相EIA是
A.CEDIA
B.SPEIA
C.EMIT
D.ELISA
E.IFA
8.关于酶免疫技术的特点，正确的是
A.酶标记物催化抗原抗体反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度
B.酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差
C.底物经酶催化后的成色，使酶标记免疫反应结果得以放大
D.选择高质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提
E.酶免疫技术检测方法较为繁琐
9.关于固相化抗体的制备，正确的是
A.抗体包被固相载体后，再用小牛血清白蛋白包被一次为了稳固载体对抗体的吸附
B.化学偶联法包被抗体，可有效提高包被抗体的结合量、均一性和牢固程度
C.为提高抗体的包被量，包被液的浓度应较高
D.吸附法包被抗体时，选用偏酸性的缓冲液，可提高包被抗体的稳定性
E.包被抗体时，温度越高越有利于提高包被抗体的稳定性
10.关于载体的选择，正确的是
A.醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全
B.高分子微颗粒载体含有的基团易与抗体蛋白形成化学偶联，且结合容量大
C.塑料制品吸附蛋白分子的稳定性和均一性好
D.固相微颗粒因体积小，不易与磁性材料组合使用
E.膜载体吸附抗体蛋白一般是采用化学偶联法
11.酶免疫技术用于样品中抗原或抗体的定量测定是基于
A.酶标记物参与免疫反应
B.固相化技术的应用，使结合和游离的酶标记物能有效地分离
C.含酶标记物的免疫复合物中酶可催化底物成色，其颜色的深浅与待测物含量相关
D.酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测值呈正比
E.酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测值呈反比
12.关于HRP，描述正确的是
A.HRP由具酶活性的蛋白主酶和亚铁血红素辅基构成
B.测定HRP的RZ值，可判断酶活性的高低
C.HRP对酶催化反应中的受氢体专一性要求不高
D.酶变性后，其RZ值不变
E.邻苯二氨底物液被HRP催化显蓝色，其最大吸收波长为492nm
13.均相酶免疫测定的基本特征是
A.反应平衡后，抗原抗体复合物中酶活性会发生变化
B.酶标抗原与抗体在固相介质表面形成复合物后，作用于底物成色
C.不用分离B、F即可确定待测物质的含量，表明其反应不易受内源性酶的干扰
D.反应属于非竞争结合，测定的灵敏度较高
E.测定方法较为复杂，且不易用于自动化检测
14.属于均相酶免疫测定的方法是
A.酶联免疫化学发光测定
B.dot-ELISA
C.双抗体夹心法 ELISA
D.酶增强免疫测定技术
E.竞争法ELISA
15.反应结束时，阴性对照管的呈色最强，此情况常见于
A.双抗体夹心法ELISA
B.竞争法ELISA
C.间接法ELISA
D.捕获法ELISA
E.双抗原夹心法ELISA
16.免疫渗滤试验衍生于
A.RIA
B. dot-ELISA
C.免疫层析试验
D.免疫印迹试验
E.免疫扩散试验
17.双位点ELISA中，造成抗原测定值低于实际含量的常见原因是
A.固相抗体过多
B.反应时间不够
C.标记抗体过多
D.待测物过浓
E.洗涤不彻底
18.间接法ELISA中，形成的免疫复合物是
A.固相抗原-抗体-酶标二抗
B. 固相抗体-抗原-酶标抗体
C.固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体
D. 固相抗体-酶标抗原
E.固相抗原-抗体-酶标抗原
19.下述酶免疫组织化学技术中，敏感性最高的方法是
A.直接染色法
B.间接染色法
C.酶桥法
D.过氧化物酶-抗过氧化物酶法
E.亲合素-生物素-过氧化物酶技术
20.酶桥染色法中的桥抗体是指
A.免疫反应系统中的特异性抗体
B.显色系统中的抗酶抗体
C.第二抗体（抗抗体）
D.第一抗体
E.第三抗体（抗酶抗体）
21.酶免疫组织化学技术中，常用的酶是
A.胰蛋白酶，葡萄糖氧化酶
B.辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶
C.胃蛋白酶，蛋白酶K
D.碱性磷酸酶，胃蛋白酶
E.葡萄糖氧化酶，蛋白酶K
（二）多项选择题（X型题）
1.用于标记的酶的特点包括
A.酶活性高
B.酶活性不受样品中其他成分的影响
C.理化性质稳定
D.价廉易得
E.易失活
2.与RZ值有关的是
A.酶含量
B.酶活性
C.酶的组成
D.酶的理化性质
E.酶的底物
3.HRP的底物有
A.OPD
B.TMB
C.5-ASA
D.ABTS
E.4MUG
4.ELISA试剂的要求包括
A.选择酶制剂时，酶的RZ值比酶活力指标更重要
B.选择抗体要求具有高的比活性
C.底物应颜色变化明显，反应终止后颜色稳定
D.载体要求吸附性好，空白值低，透明度好
E.抗原要求纯度高，抗原性完整
5.符合RZ特点的有
A.常以RZ值表示HRP制品的纯度
B.RZ值越高，说明HRP越纯
C.RZ=OD(403nm)/OD(275nm)
D.RZ值应大于3
E.RZ值与酶活性无关
6.关于ELISA试验中的封闭，正确的论述是
A.用1%-5%牛血清白蛋白再包被
B.有助于酶与底物的结合
C.防止酶标抗体吸附载体
D.可消除非特异显色而导致的本底偏高
E.用5-20%小牛血清再包被
7. ELISA试验中，抗原抗体的要求有
A.制备酶标结合物用的抗体要求有高的比活性
B.测定抗体时需用相当纯的抗原
C.用硫酸铵盐析的抗体可满足交联酶的需要
D.酶消化IgG的Fab片段进行酶标记效果更好
E.制备酶标记物的抗原要求纯度高，抗原性完整
8. ELISA试验中，固相载体的要求有
A.与抗原或抗体有较高的结合容量且结合稳定
B.抗原或抗体与其结合后，应保持活性
C.固相化方法应简便易行，快速经济
D.能结合亲和素或链酶亲和素等大分子蛋白质
E.抗原或抗体与其结合后丧失免疫活性
9.均相酶免疫测定的特点是
A.属于竞争结合分析方法
B.AgE与Ab结合形成AbAgE后，其中的酶活性将减弱或增强
C.不需将AbAgE与AgE分离，可直接测定酶活性的变化推算出待测抗原量
D.主要用于小分子抗原和半抗原的测定
E.灵敏度大于异相酶免疫测定
10.关于双抗体夹心法ELISA，正确的表述是
A.使用分别针对抗原不同决定基的两种单克隆抗体作酶标记
B.一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗体
C.可使标本和酶标抗体同时加入
D.采用高亲和力的单克隆抗体可提高测定的敏感性和特异性
E.用于检测二价或二价以上的抗原
11.下列叙述中，正确的是
A.Western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和ELISA的高特异性
B.亲和素-生物素ELISA法可大大提高敏感度
C.斑点-ELISA法的特异性高于ELISA法
D.酶免疫电泳法可起到微量抗原定位作用及提高敏感性
E.IRMA的灵敏度较RIA高，所有待测物参与反应
12.选择ELISA的标记酶，必须具备的特性是
A.具有可与抗原、抗体结合的基团
B.标记抗原后，酶活性保持稳定
C.当酶标记抗原与抗体结合后，酶活性可出现激活或抑制
D.酶催化底物反应后生成的信号易于测定、重复性好
E.标记抗原后，不影响抗原的免疫活性
13.酶免疫分析技术中常用于标记的酶有
A.辣根过氧化物酶
B.碱性磷酸酶
C.β-半乳糖苷酶
D.过氧化氢酶
E.酸性磷酸酶
14.酶免疫技术的优点有
A.灵敏度高、特异性强、准确性好
B.实验简便，易操作
C.易于自动化分析
D.易与其他标记免疫技术偶联
E.标记试剂的有效期较长
15.下列关于酶免疫组织化学技术的描述，正确的是
A.敏感性比免疫荧光技术高
B.可用普通显微镜观察结果
C.不能用电子显微镜观察结果
D.便于对组织细胞微结构作分析
E.染色标本不能长期保存
16．ELISA临床上主要用于
A.病原体及抗体测定
B.蛋白质测定
C.非肽类激素测定
D.药品测定
E.毒品测定
二、填空题
1.膜载体酶免疫测定技术的类型主要有__________、__________、和。
2.免疫印迹法是由_____ _ __，__ ___ 和__________三项技术结合而成。
3.酶免疫组织化学技术常用的酶有、和。
4.ELISA方法类型主要有、、和。
5.ELISA中三种必要试剂是、和。
6.制备酶结合物常用的方法有和。
7.在稀释液和洗涤液中加入__________，可以去除非特异性吸附。
8.均相酶免疫测定技术的类型主要有和。
9.非标记抗体酶免疫组织化学技术的类型主要有__________、、__________和__________。
三、名词解释
1.酶免疫技术(enzyme immunoassay，EIA)
2.封闭（blocking）
3.异相酶免疫测定( heterogenous enzyme immunoassay，异相EIA)
4.包被(coating)
5.均相酶免疫测定(homogenous enzyme immunoassay)
四、问答题
1.用于标记的酶应符合哪些要求？
2.简述酶免疫技术的分类。
3.简述均相酶免疫测定的原理。
4.简述双抗体夹心法的原理。
5.斑点-ELISA有哪些优点？
6.简述ELISA的基本原理、方法类型及应用。
7.简述酶增强免疫测定技术的原理。
8.简述克隆酶供体免疫分析技术的原理。
9.简述免疫印迹方法。
第三部分参考答案与题解
一、选择题
（一）单项选择题（ A型题）
1.B
2.A
3.A
4.E
5.C
6.B
7.C
8.C
9.B 10.B 11.C 12.D 13.A 14.D 15.B 16.B 17.D 18.A 19.E 20.C 21.B
(二)多项选择题（X型题）
1.ABCD
2.ACDE
3.ABCD
4.BCDE
5.ABCE
6.ACDE
7.ABDE
8.ABCD
9.ABCD 10.BCDE 11.ABDE 12.ABDE 13.ABC 14.ABCDE 15.ABD 16.ABCDE
二、填空题
1.斑点-ELISA 免疫渗滤试验免疫层析试验免疫印迹法
2.SDS-PAGE 蛋白质转印酶免疫测定
3.HRP AP GOD
4.双抗体夹心法间接法竞争法捕获法
5.固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶的反应底物
6.戊二醛交联法过碘酸盐氧化法
7.吐温-20
8.酶增强免疫测定技术克隆酶供体免疫分析技术
9.酶桥法 PAP法双桥PAP法 APAAP法
三、名词解释
1.酶免疫技术：是指利用酶的高效催化和放大作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标记免疫技术。
2.封闭：是指在抗原或抗体包被ELISA板后，用1%-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等再包被，以防止非特异性吸附。
3.异相EIA：是指在酶免疫测定中，抗原抗体反应后，需分离游离的和与抗原(或抗体)结合形成复合物的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算出样品中待测抗原(或抗体)的含量。
4.包被：是指将抗原或抗体固相化的过程。
5.均相酶免疫测定：是指抗原抗体反应平衡后，无需分离F和B，直接根据反应前后酶活性的改变进行待检物质的测定。
四、问答题
1.（1）酶活性高，能对低浓度底物产生较高的催化反应率。（2）具有可与抗原、抗体共价结合的基团，标记后酶活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。（3）酶催化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、敏感和重复性好。（4）酶活性不受样品中其他成分（内源性酶、抑制物）的影响；用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。（5）酶、辅助因子及其底物均对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。
2.（1）酶免疫技术按实际用途，分为酶免疫组化和酶免疫测定两大类。（2）按抗原抗体反应后是否需将结合的和游离的酶标记物分离，分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定，异相酶免疫测定又可分为固相酶免疫测定和液相酶免疫测定。
3.酶标抗原（AgE）与Ab结合形成AbAgE后，其中的酶（E）活性将减弱或增强。因此，不需对反应液中的AbAgE和AgE进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化，即可推算出被测样品中Ag的含量。
4.连接于固相载体上的抗体和酶标抗体，与待检抗原上两个不同的抗原决定基结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原是过量的，因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物质量，即可确定待检抗原含量。
5.（1）NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通的ELISA高6-8倍；（2）试剂用量较ELISA省10倍；（3）操作简便，试验及结果判断不需特殊设备条件；（4）吸附抗原(抗体)或已有结果的NC膜可长期保存（-20℃可达半年）。
6.（1）基本原理：抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加入底物进行显色，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。
（2）方法类型及应用：①双抗体夹心法：用于检测抗原，适用于检测两个或两个以上抗原决定基的多价抗原；②间接法：用于检测抗体；③竞争法：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定；④捕获法：用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。
7.具抗原及酶活性的Ag-E与Ab结合形成AgAb-E后，所标的酶(E)因与Ab接触紧密，空间位阻影响了酶的活性中心，酶活性受到抑制。加入未标记抗原(标准或样品中的Ag)后，Ag即与Ab-E竞争结合反应系统中限量的Ab形成AbAg，从而使反应液中AgAb-E (酶活性被抑制)的比例减少，具酶活性的游离Ab-E增多。最终测得的酶活性随着反应体系中未标记抗原(Ag)浓度升高而增强。
8.DNA重组技术可分别合成某种功能性酶分子的两个片段，大片段为酶受体( EA)，小片段为酶供体(ED)。单独的EA和ED均无酶活性，但在一定条件下可结合形成具酶活性的四聚体。CEDIA即是用ED标记抗原(Ag-ED)，反应系统中再加入相应的EA、Ab及样品抗原Ag (未标记)，反应时由于抗原抗体间的亲和力大于ED与EA者，因此Ag-ED和Ag易与Ab结合形成复合物。而AbAg-ED中的Ag-ED由于空间位阻的干扰不能与EA 结合，游离的Ag-ED则可与EA结合成具活性的全酶。由于反应属竞争结合，故反应液中游离的Ag-ED随着未标记Ag量的增多而增加，使最终加入底物后测得的酶活性与样品Ag含量成正比。
9.免疫印迹方法亦称Western blot，由SDS-PAGE、蛋白质转印和酶免疫测定三项技术结合而成。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，SDS-PAGE时从阴极向阳极泳动，分子量小者，泳动速度快；将凝胶中已经分离的蛋白质条带在电场作用下转移至硝酸纤维素膜上；将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色；根据电泳时加入的分子量标准，可确定各组份的分子量。
(秦东春)
2019第九章酶免疫技术 一、A1 1、检测HIV感染的初筛试验常用 A、对流电泳法 B、酶免疫法 C、免疫荧光法 D、免疫印迹法 E、PCR法 2、检测HBsAg最常用的方法为 A、凝集试验 B、酶联免疫吸附试验 C、荧光免疫法 D、分子生物学法 E、火箭电泳 3、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 4、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 5、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 6、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相 E、固相异相 7、在ELISA技术中，将抗原或抗体固相化的过程称为 A、封闭
B、固定 C、包被 D、吸附 E、结合 8、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 9、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-R-D半乳糖苷 10、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 11、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 12、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是 A、人白蛋白 B、人球蛋白 C、牛血清白蛋白 D、牛血清球蛋白 E、鼠白蛋白 13、选择ELISA的标记用酶，下面哪一项特性是不需要的 A、具有可与抗原、抗体结合的基团 B、标记抗原后，酶活性保持稳定 C、当酶标抗原与抗体结合后酶活性可出现激活或抑制 D、酶催化底物反应后生成的信号易于测定、重复性好
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
第九章酶免疫技术 一、A1 1、在ELISA技术中，将抗原或抗体固相化的过程称为 A、封闭 B、固定 C、包被 D、吸附 E、结合 2、检测HIV感染的初筛试验常用 A、对流电泳法 B、酶免疫法 C、免疫荧光法 D、免疫印迹法 E、PCR法 3、检测HBsAg最常用的方法为 A、凝集试验 B、酶联免疫吸附试验 C、荧光免疫法 D、分子生物学法 E、火箭电泳 4、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 5、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 6、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm
7、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 8、酶免疫技术中酶的要求 A、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高 B、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定 C、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响 D、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好 E、以上都是 9、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相 E、固相异相 10、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 11、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-R-D半乳糖苷 12、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 13、下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定 A、间接法ELISA B、反向间接法ELISA
酶免疫技术题库2-1-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]酶标记抗体或抗原的方法一般应符合下列条件，但除外（） A.技术方法简单、产率高 B.重复性好 C.标记反应不影响酶的活性 D.酶标志物稳定 E.标记后抗原抗体的活性丧失 酶标记抗体或抗原的方法有多种，标记方法一般应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]以下哪一种复合物的形成属于间接法ELISA免疫反应结果（） A.固相抗原-抗体-酶标二抗 B.固相抗体-抗原-酶标抗体 C.固相二抗-IgM抗原-酶标抗体 D.固相抗体-酶标抗原 E.固相抗体-抗原-抗体-酶标抗体 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]检测HBV血清学标志物最常用的方法为（） A.免疫荧光法 B.ELISA C.中和试验 D.免疫印迹试验 E.放射免疫法 目前在国内的临床实验室中最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低。 (11选5 https://www.doczj.com/doc/cb1129561.html,)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]用于标记的酶应符合的要求中，哪一项可以除外（） A.酶活性高 B.具有可与抗原、抗体结合的基团 C.具有可与生物素、亲和素结合的基团 D.酶催化底物后的成色信号易判断 E.纯度及比活性高 标记酶应该具有酶活性高；可与抗原、抗体结合的基团；纯度及比活性高；酶催化底物后的成色信号易判断。
酶免疫技术 （一）单项选择题（A型题） 1、HRP的活性基团是 A．糖蛋白B．亚铁血红素C．白蛋白 D．球蛋白E．色氨酸 2、表示HRP纯度（RZ）的是 A．入403nm/入275nm B．入420nm/入275nm C．入403nm/入290nm D．入275nm/入403nm E．入290nm/入275nm 3、HRP（用于标记）的RZ值应大于 A．3.0 B．3.1 C．3.2 D．3.3 E．3.4 4、β-Gal的常用底物是 A．OPD B．TMB C．5-ASA D．ABTS E．4MUG 5、下列酶-底物-颜色反应组合中，正确的是 A．HRP—OPD—蓝色B．HRP—TMB—红 色C．AP—P—NPP—黄色 D．HRP—P—NPP—蓝 色 E．AP—TMB—蓝色 6、AMIT测定可以测定 A．大分子抗原B．小分子抗原或半抗 原 C．补体 D．PcAb E．McAb 7、应用最广泛的均相EIA是 A．CEDIA B．SPEIA C．AMIT D．ELISA E．IFA 8、关于酶免疫技术的特噗，正确的是 A．酶标记物催化抗原反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度 B．酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差 C．底物以酶催化后的成色，使酶标主免疫反应结果得以放大 D．选择高度质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提 E．酶免疫技术检测方法较为繁琐 9、关于固相化抗体的制备，正确是的 A．抗体包被固相载体后，再用小牛血清蛋白包被一次为了稳寄存载体对抗体的吸附
B．化学偶联包被抗体，可有效提高包被抗体的结合量．均一性和牢固程度 C．为提高抗体的包被量，包被液的浓度应较高 D．吸附法包被抗体时，选用偏酸性的缓冲液，可提高包被抗体的稳定性 E．包被抗体时，温度越高越有利于提高包被抗体的稳定性 10、关于载体的选择，正确的是 A．醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全 B．高分子微颗粒载体含有的基团易与抗体蛋白形成化学偶联，且结合容量大 C．塑料制品吸附蛋白分子的稳定性和均一性好 D．固相微颗粒因体积小，不易与磁性材料组合使用 E．膜载体吸附抗体蛋白一般是采用化学偶联法 11、酶免疫技术和于样品中抗原或抗体的定量测定是基于 A．酶标记物参与免疫反应 B．固相化技术的应用，使结合和游离的酶标记物能有效地分离 C．含酶标记的的免疫复合物中酶可催化底物成色，其颜色的深玫与待测物含量相关D．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈正比 E．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈反比 12、关于HRP，描述正确的是 A．HRP由具酶活性的蛋白主酶和亚铁血经素辅基构成 B．测定HRP的RZ值，可判断酶活性的高低 C．HRP对酶催化反尖中的受氢体专一性要求不高 D．酶变性后，其RZ值不变 E．邻苯二氨底物液被HRP催化显蓝色，其最大吸收波长为492nm 13、均相酶免疫测定的基本特征是 A．以应平衡后，抗原抗体复合物中酶活性人发生变化 B．酶标抗原与抗体在固相介质表面形成复合物后，作用于底物成分 C．不用分离B．F即可确定待测物质的含量，表明其反应不易受内源性酶的干扰D．反应属于非竞争结合，测定的灵敏度较高 E．测定方法较为复杂，且不易用于自动化检测 14、司于均相酶免疫测定的方法是 A．酶联免疫化学光测定B．dot-ELISA C．双抗体夹心法 ELISA D．酶增强免疫测定技 术 E．竞争法ELISA 15、反应结束时，阴性以照管的呈色最强，此情况常见于
《酶组织化学与免疫组织化学技术》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术 一、选择题 （一）A1型题(标准型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D 1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.免疫染色 D.设立对照试验 E.结果判断 2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物 D.固定剂 E.洗涤液 3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是 A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。 D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950 B.1960 C.1970 D.1980 E.1990 5.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶 B.碱性磷酸酶 C.葡萄糖氧化酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.第四抗体 9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961
B.1975 C.1981 D.1985 E.1990 10.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4℃ B.20℃ C.40℃ D.37℃ E.50℃ 23．PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原 一、填空 1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素________、___酶_________ 、____生物素和亲和素_______、___________。原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。 2、常用的粘附剂有__________、____________ 、__________等。 3、抗原决定簇是指_____________分子表面的、具有活性的___________。 4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_____________，使其发生反应，形成_____________，能在显微镜下观察。常用于检测__________、____________ 、__________等。 5、酶组织化学是利用酶对其____________的催化作用，生成__________，再与某种__________反应，形成____________沉淀，检测___________分布及活性的方法。常用的方法有___________ 、___________、____________、__________和____________。 6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应PAS。 7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用________和________法。 8、免疫组化中最常用的制片方法是________和________。 9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_________、_________ 和_______。
常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。 二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片
5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法
2016 第九章酶免疫技术 一、A1 1、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 2、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 3、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 4、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 5、酶免疫技术中酶的要求 A、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高 B、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定 C、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响 D、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好 E、以上都是 6、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相
E、固相异相 7、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 8、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物。 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP 低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-β-D半乳糖苷 9、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 10、酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是 A、邻苯二胺（OPD） B、四甲基联苯胺（TMB） C、ABTS D、对硝基苯磷酸酯（P-NPP） E、以上都不是 11、下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定? A、间接法ELISA B、反向间接法ELISA C、竞争法ELISA D、双抗体夹心法ELISA E、捕获法 12、下列哪项不是血药浓度免疫学测定的技术 A、化学发光免疫测定 B、免疫电泳法 C、放射免疫法 D、荧光免疫法 E、酶免疫法
第九章酶免疫技术 第一节酶免疫技术的特点 它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。 一、酶和酶作用底物 （一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合： 1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。 2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。 4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。 5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。 （二）常用的酶 1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。 RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。 酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。 2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。 3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。 （三）常用的底物 1.HRP的底物 （1）邻苯二胺（OPD）：是HRP最为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。OPD应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具有致癌性。 （2）四甲基联苯胺（TMB）：TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长450nm。TMB稳定性好，成色无需避光，无致突变作用，是目前ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。 （3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）。 2.AP的底物 常用对-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。 3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物 常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。 二、酶标记抗体或抗原 （一）酶标记抗体或抗原的制备 标记方法应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶
第十章酶免疫技术 本章考点 1.酶免疫技术的特点 2.酶免疫技术分类 3.酶联免疫吸附试验（ELISA） 4.膜载体的酶免疫测定 5.临床应用 第一节酶免疫技术的特点 酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。 一、酶和酶作用的底物 1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约l8%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H202方便。 许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。 2.碱性磷酸酶（AP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。 3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-半乳糖苷，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶。 二、酶标记抗体或抗原 酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。 1.戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。
酶免疫技术的特点方法原理 免疫酶技术是指在一定的生物反应器内,利用酶的催化作用,进行物质转化的技术.其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。下面是给大家的酶免疫技术的特点，希望能帮到大家! (1)酶和酶作用的底物： ①辣根过氧化酶(HRP)：是一种糖蛋白，含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。在反应中H2O2是受氢体底物，DH2无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色，此即HRP作为示踪物的原理。 ②碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。 ③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。 (2)酶标记的抗体或抗原： 称为结合物。制备方法通常有戊二醛交联法(包括有一步法和二步法)和过碘酸盐氧化法。标记抗体的最佳用量：通常采用棋盘滴定法进行滴定。 (3)固相载体： 主要试剂：固相的抗原或抗体、医学`教育网搜集酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体物质最常用
的是聚苯乙烯。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。聚苯乙烯作为ELISA固相载体，载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒。聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。 (4)免疫吸附剂： 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过 程称为包被。如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以 消除这种干扰。这一过程称为封闭。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。 ACA(抗心磷脂抗体)主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干 扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。 其主要程序为用纯心磷脂的无水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封 闭后分别于标本孔和对照孔中加入一定稀释度的被检血清及阳性与 阴性对照血清，之后加入酶标二抗和酶底物，终止反应后肉眼观察结果或测吸光度(A)值。 具体步骤如下： 预步骤：先用一定浓度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。 (1)用微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育30min。
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
2017 第九章酶免疫技术 一、A1 1、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 2、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 3、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 4、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 5、酶免疫技术中酶的要求 A、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高 B、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定 C、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响 D、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好 E、以上都是 6、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相 E、固相异相
7、酶增强免疫测定技术（EMIT）是一种（）。 A、非均相酶免疫测定技术 B、均相酶免疫测定技术 C、酶免疫组织化学技术 D、酶免疫测定与电泳相结合的技术 E、电泳技术 8、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。 A、常用于半抗原和小分子的检测 B、操作简便，易于自动化 C、不易受样品中的内源性酶的干扰 D、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性 E、灵敏度不及异相酶免测定 9、ELISA检测中“钩状效应”（hookeffect）是指（）。 A、钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗原过量叫做前带效应 B、双抗体夹心一步法检测抗原时抗原过量 C、双抗体夹心法检测抗原时RF的干扰 D、检测的假阳性反应 E、竞争法检测抗体时特异性问题 10、ELISA试验以HRP为标记酶时，常用的供氢底物为（）。 A、OPD B、OT C、YMB D、ABTS E、PNP 11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。 A、戊二醛交联法 B、糖原染色法 C、免疫印迹法 D、酶耦联测定法 E、捕获竞争法 12、斑点免疫层析试验最常用的载体材料是（）。 A、乙酸纤维素膜 B、尼龙膜 C、滤纸 D、硝酸纤维素膜 E、玻璃纤维膜 13、有关化学发光错误的说法是 A、化学发光是指伴随着化学反应过程所产生的光的发射现象 B、化学发光与荧光形成激发态分子的激发能相同
免疫组织化学技术（ABCxx） 大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液（pH 7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。 鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。 免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。 比例尺为20 am。 细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。 加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用 488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。