一、包装细胞293T细胞的培养
一、293T细胞的冻存
1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代
1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏
1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),
5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and
5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)
2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)
3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)
4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)
用于包装的293T细胞的培养
用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。
慢病毒的包装
1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。
2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。
3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。
4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到18ml。另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。
8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。
9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。
12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13. 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化
方法一超速离心沉淀法
1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二PEG-8000浓缩法
PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃。
1. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
4. 4度放置过夜；
5. 4度，4000 g，离心20min；
6. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
8. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在
-80 ℃
病毒滴度的测定
稀释计数法
滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”
为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。
第三天追加培养液
在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法
病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio，终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，
离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl 洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA可以稳定保存
在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：
n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：
n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上。
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。
分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。
所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。
数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：
IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V
其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数
N = 感染时细胞的数目（约为1×105）
D = 病毒载体的稀释倍数
V = 加入的稀释病毒的体积数
慢病毒的储存与稀释
慢病毒的储存
1. 病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于一周
内用完）。
2. 若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但若超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。
3. 避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10%。
慢病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。
慢病毒在细胞水平的使用
什么是MOI？
“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。
MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。
目的细胞感染预实验及实验体系的放大
实验目的：确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。
实验材料：96孔板，1.5ml EP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的细胞培养基等。
第一天：细胞准备
将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×104~5×104个/ml，按90μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。
第二天：病毒感染
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞经过一天的生长数量约为1×104个/孔，对应的病毒数量为1×106TU、1×105TU和1×104TU）。每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1：2000，终浓度为5μg/ml。
第二天：换液
感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。
第五天：观察荧光表达情况
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene。
对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。
实验体系的放大
正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度较大，可进行对MOI 的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。
表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
《《影响溶解快慢的因素》实验报告》 实验名称：影响溶解快慢的因素。 实验目标： 1.知道可溶解的固体物质在水中溶解的快慢与物体的颗粒大小（面积的大 小）、水的温度、水是否被搅动等因素有关。 2.亲历控制单个变量进行对比实验的活动过程。 3.体验探究影响溶解快慢因素的乐趣，感悟科学就在身边，要做爱科学的有心人。 实验材料：2个透明玻璃杯①号和②号、1根筷子、1个水槽（内盛冷水）、热水1壶、食盐、方糖、溶解快与慢实验记录表。 实验内容： 1．溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 2．溶解的快慢可能跟水的温度有关。 3．溶解的快慢可能跟水是否被搅拌有关。 4．综合运用第三种方法的效果是否会更好。 提出问题：物体溶解的快慢与哪些因素有关呢？ 实验步骤： 实验一：溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 1.实验猜测 ①物体的颗粒大（面积的大小），溶解慢；物体的颗粒小，溶解快。 ②溶解的快慢跟物体的颗粒大小（面积的大小）无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同、水量相等的玻璃杯中放入两块大小不一的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解速度并将相关数据记录在记录表单中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两杯水的温度。 ④投放方糖时要同时同步同高度。 B：不同因素：两块方糖的大小不同（物质颗粒粗细不同）。 4.实验操作（边操作边记录，见附表1） 5.实验结论 物体颗粒越粗（面积大）溶解速度越慢，物体颗粒越细（面积小）溶解速度越快。 实验二：溶解的快慢可能跟水的温度有关。 1.实验猜测 ①玻璃杯中水的温度越高溶解速度越快。 ②溶解速度快慢跟水的温度高低无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同，水量相等但水温不同的玻璃杯中放入两块形状大小质量完全相同的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解状况并将相关数据记录在记录表中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两块方糖的大小。 ④投放方糖时要同时同步同高度。⑤实验室内的温度要一致。
. 慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 1.转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min ⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 2.收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 3.接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 4.检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.doczj.com/doc/c03126445.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/c03126445.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.doczj.com/doc/c03126445.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/c03126445.html,/
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
第二代和第三代慢病毒包装系统精编W O R D 版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
第二代和第三代慢病毒包装系统 将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白 GFP) 。 在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。4质粒系统。 第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
教科版四年级科学上册实验报告单 （1）实验名称：室内外温度的测量与比较 实验器材：温度计、线、笔 实验步骤： 1、取一支温度计，用线拴好。 2、将温度计悬挂，（离地面米左右，不能靠拢，在室外注意通风，阳光不能直射温度计）。 3、读数。 4、记录并比较。 实验结果：室内外温度存在差距，通过对大气温度的测量，可以了解当地的气温。 （2）实验名称：气温的测量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、选择两个地点：阳光下和背阴处来测量它们的温度； 2、测量一天中，清晨、商务、中午、下午、傍晚的气温。 实验结果：1、阳光下的温度高，背阴处的温度低，说明测量气温时应该选择背阴的地方。2、一天中，中午的时候气温最高，清晨的时候气温最低；还发现在一天中的气温时从低到高，在从高到低的规律变化的。 （3）实验名称：用简易雨量器测量降水量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、用喷水壶模拟降水，记录好时间。 2、把雨量器改在水平桌面，读出刻度 3、换算成24小时，核对雨量等级。 实验结果：根据24小时内测的降水量，对照等级表，确定了下雨的等级。 （4）实验名称：观察食盐、沙在水中的状态 实验器材：烧杯2个、搅拌棒2根、沙、食盐、水。 实验步骤： 1、取一小匙食盐，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 2、取一小匙淘洗干净的沙，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 3、比较食盐和沙在水中的状态。 实验结果：食盐在水中溶解了，沙在水中没有溶解。 （5）实验名称：观察面粉在水中溶解了吗 实验器材：烧杯1个、搅拌棒1根、面粉、水。 实验步骤： 1、取一小匙面粉，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。 2、你发现了什么
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA
慢病毒包装操作流程 一、材料 1 细胞培养试剂 试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen 胎牛血清10%Invitrogen/Gibco 丙酮酸钠1mM Invitrogen DMSO（冻存用）10% 2 慢病毒包装试剂 试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000Invitrogen Opti-MEM基础培养基Invitrogen PEG6000溶液50%Wako NaCl溶液40 mM HBSS溶液Invitrogen 3 耗材 50 mL离心管 15 mL离心管 10 cm细胞培养皿 μm过滤器 2 mL EP管 二、操作流程
1细胞培养 1.1293T/293FT细胞的复苏 1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取6~7mL 完全培养液至15 mL离心管中； 2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不 要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化； 3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的 完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO 对细胞造成的毒性作用）。 4)在室温条件下，250 g离心4分钟。 5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液， 再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和 湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的 培养容器。） 6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。 7) 1.2293T/293FT细胞传代 1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细 胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰 酶的抑制因子）； 2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察，可看 到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞 仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间； 3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管
教科版四年级上册科学实验报告单含实验目的及实验现象
教科版四年级科学上册实验报告单 （1）实验名称：室内外温度的测量与比较 实验器材：温度计、线、笔 实验步骤： 1、取一支温度计，用线拴好。 2、将温度计悬挂，（离地面1.5米左右，不能靠拢，在室外注意通风，阳光不能直射温度计）。 3、读数。 4、记录并比较。 实验结果：室内外温度存在差距，通过对大气温度的测量，可以了解当地的气温。 （2）实验名称：气温的测量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、选择两个地点：阳光下和背阴处来测量它们的温度； 2、测量一天中，清晨、商务、中午、下午、傍晚的气温。 实验结果：1、阳光下的温度高，背阴处的温度低，说明测量气温时应该选择背阴的地方。2、一天中，中午的时候气温最高，清晨的时候气温最低；还发现在一天中的气温时从低到高，在从高到低的规律变化的。 （3）实验名称：用简易雨量器测量降水量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、用喷水壶模拟降水，记录好时间。 2、把雨量器改在水平桌面，读出刻度 3、换算成24小时，核对雨量等级。 实验结果：根据24小时内测的降水量，对照等级表，确定了下雨的等级。 （4）实验名称：观察食盐、沙在水中的状态 实验器材：烧杯2个、搅拌棒2根、沙、食盐、水。 实验步骤： 1、取一小匙食盐，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现？ 2、取一小匙淘洗干净的沙，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现？ 3、比较食盐和沙在水中的状态。 实验结果：食盐在水中溶解了，沙在水中没有溶解。 （5）实验名称：观察面粉在水中溶解了吗 实验器材：烧杯1个、搅拌棒1根、面粉、水。 实验步骤： 1、取一小匙面粉，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。 2、你发现了什么？
Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明 A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。 所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。 用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。 所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。 包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。 6 1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。 在37℃，5%CO2℃条件下过夜。 在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。 2.充分混均Xfect Polymer。 3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μlXfectReaction Buffer 592.5μl Xfect ReactionBuffer36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意： Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
四年级科学《溶解的快与慢》教学设计 教学目标 （一）科学知识： 会溶解的固体物质在水中溶解的快慢与物体颗粒大小（即物体表面积的大小）、水的温度以及混合液体是否被搅动等因素有关。 （二）过程与方法： 引导学生经历“问题—假设—验证—证实”科学探究过程和控制单个变量进行对比实验的过程。 （三）情感态度与价值观： 培养学生与同学合作进行研究活动，敢于发表自己的意见，并能注意倾听他人的意见。 教学重难点 重点：通过对比实验，使学生理解加快溶解的方法。 难点：对比实验过程中，各种变量与不变量的控制。 一、创设情境、引出问题： 引导语：有一天，老师的喉咙特别难受，老师的朋友就告诉我说可以泡一杯盐水喝喝，老师把盐倒进水中时，发现溶解的特别慢。同学们有什么方法可以让老师马上可以喝到盐水？ 二、设计探究方案： 1、班上交流：怎样让一杯盐溶解得快？ 2、交流后教师板书：（搅拌，加热……） 3、这只是你们的猜测，我们还要想办法来验证你们的猜测，你觉得我们应该怎么来研究呢？先来研究“搅拌”可以加快溶解的实验。质疑：你们怎么证明搅拌的比不搅拌的快呢？（引
出对比实验ppt课件）。 4、小组讨论并汇报“搅拌”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 （一个搅拌，一个不搅拌；放入的糖应该一样多；烧杯里的水一样多；放入糖的时间应该一样，水的温度也应该一样） 5、小组讨论并汇报“加热”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 让学生自由举手发言，来完整描述“加热”可以加快溶解实验的步骤及应注意的事项。 三、学生分组探究搅拌、加热加快溶解的实验： 1、学生选择实验分组探究。 2、温馨提示： （1）、我们的实验器材是玻璃制品，在做实验中有的小组要用到热水，请同学们一定要注意安全； （2）、小组内部要明确分工，实验中一定要仔细观察、认真思考并填好实验报告单，需要热水的小组请耐心等待，老师马上给你们送来。 3、教师巡回指导。 4、汇报实验结果 我们小组选择的实验是：（）能否加快白糖的溶解。 我们通过实验发现了（）现象，证明了（）能加快白糖的溶解。 5、教师小结：同学们通过实验发现了搅拌比不搅拌、热水比冷水能加快白糖的溶解。 四、加快水果糖溶解的研究 1、这里有一颗水果糖，怎样使这颗水果糖快速地溶解在这100ml的水中呢？ 2、分组讨论并汇报：（搅拌加热切碎碾碎并搅拌再加热） 3、“搅拌”与“加热”都可以加快溶解，由于时间关系我们就不再做了，我们来研究第三种方法能不能加快溶解。 4、小组讨论并汇报“切碎”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 5、学生实验并汇报实验结果（在实验中我们发现，切碎并搅拌再加热可以溶解得更快。） 五、小结 1、通过这堂课的学习，我们学到了什么？ 2、你知道了哪些方法可以加快溶解？溶解的快与慢与哪些因素有关？
一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。