烟草叶片瞬时转化实验
试验方法
一、实验材料及药品
pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等
二、载体构建及农杆菌转化
烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备
1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株
2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）
3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）
4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：
0.5M MES 200ul 0.976g
1M MgCl2100ul 2.03g
100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）
四、操作步骤
1、农杆菌转化
2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）
3、确定不同农杆菌所加菌液的量：
计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600
OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min
5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h
6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片）
7、暗培养1d，转入光照培养1-2d
8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。
荧光素酶的配置：固体0.032g溶解于1ml 灭菌水中，用前吸取该溶液100ul 稀释到10ml水中，并加入10ul Triton-X-100（全程避光）。
名词解释生物产量：烟草在整个生长季节中所积累的干物质重量。 经济产量：单位土地面积上所收获可用干物质的重量，对烟草来说就是烟叶的产量。 烟叶品质：消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。 成熟度：烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映。 身分：烟叶的组织构造密度，即叶肉细胞的大小及其排列的疏密程度。 物理特性：叶片的厚度、叶面密度、单叶重、平衡水含量、填充值、含梗率等。评吸：通过烟叶燃吸后的烟气在经过人的口腔、鼻腔和喉部等感官时所产生的感觉评定烟叶质量的方法。 劲头：烟气中的烟碱对人体器官作用时，能够引起兴奋反应的程度。 刺激性：口腔、鼻腔和喉部对烟气产生的刺激感强烈冲击的接受程度。 香气：烟叶燃烧后进入烟气中所表现出来的一种令人愉快的特殊芳香。 吃味：烟气反映在口腔内包括酸、甜、苦等味道感觉的总称，是烟气被口腔反映的味感。 种植制度：一个地区或生产单位的作物组成、配置、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。 轮作：在同一块土地上于一定年限内有计划、有顺序地轮换种植不同类型作物的种植方式。 套种：在前一季作物生长后期，在其预留的行间或带间套种其他作物的种植方式。壮苗：生长发育良好，新陈代谢正常，有机物质合成积累较多，内含物丰富，碳氮比协调，抗逆性强，移栽成活率高的烟苗。 格盘育苗：使用由若干苗穴组成的育苗盘培育作物秧苗的方法。 漂浮育苗：在温室或塑料薄膜覆盖条件下，利用成型的膨化聚苯乙烯格盘为载体，装填上人工配置的培养基质，将格盘漂浮于含有完全矿质营养的苗池中，完成烟草种子的萌发、生长和成苗过程。 烟草需水量：每生产单位重量干物质由烟株蒸腾所消耗水分的数量。水分利用效率：烟株消耗单位重量水分所生产的同化物的量。 圆顶：烟株打顶10-15d后，上部叶完全展开，与中部叶大小接近，烟株呈筒形的时
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
单项选择题 1、作物产量中常说的经济系数是指 1.生物产量与经济产量之比 2.经济产量与生物产量之比 3.生物产量与经济产量的百分比 4.经济产量与生物产量的百分比 2、作物品质的评价指标中，下述属于形态指标的是 1.蛋白质 2.氨基酸 3.脂肪 4.颜色 3、作物生长的“营养三要素”是指 1. C、H、O 2. N、P、K 3. S、N、P 4. N、P、S 4、下列哪种根属于产品器官 1.气生根 2.须根 3.块根
4.不定根 5、下列属于喜钾作物的是 1.水稻 2.玉米 3.马铃薯 4.小麦 多项选择题 6、影响复种的条件包括 1.热量 2.水分 3.地力与肥料 4.劳畜力与机械化等 7、下列哪些作物需经过一定时期的低温诱导才能正常开花结实。 1.大麦 2.小麦 3.黑麦 4.油菜 8、作物的播种方式包括 1.插播
2.条播 3.点播 4.重播 9、下面哪些材料可用于繁殖下一代 1.颖果 2.块茎 3.块根 4.鳞茎 10、按照土壤质地进行分类，一般可以把土壤区分为下列几大类 1.砂土类 2.黑土类 3.壤土类 4.黏土类 11、根据作物对二氧化碳同化途径的特点，下列哪些作物属于C3作物 1.小麦 2.大豆 3.玉米 4.棉花 12、间作与套作不相同点在于 1.共生期长短不一样 2.熟制不一样 3.复种指数不一样
4.前者是成行种植，后者是成带种植 13、关于土壤质地下列表述正确的是 1.沙质土壤结构良好，保水保肥。 2.壤质土耐旱耐涝，适耕期长。 3.黏质土吸附作用强，保肥性好。 4.沙质土壤保水不保肥。 14、下列属于长日照作物的是 1.小麦 2.烟草 3.大麦 4.油菜 15、种子萌发必不可少的因素包括 1.光照 2.温度 3.水分 4.氧气 16、从引种角度看，短日照作物由北方向南方引种，下列表述正确的是 1.生育期缩短 2.生育期延长 3.生育期不变 4.营养生长期缩短 17、按照作物“S”生长进程，下列说法正确的是
第二章烟草生物学特性 我国的烤烟、晒烟和晾烟，绝大多数属于普通烟草，只有花色呈黄色的烟草属于黄花种。还有少数种如异香烟草（N. alatalioketotto）、美花烟草（N. sylverstris spegetcomes）和香花烟草（N. suaveolens Lehn）等，因其花色美丽作为观赏植物栽培。对红花烟草较全面的分类方法是Wilson和Loomis提出的以下分类，界：植物界；亚界：有胚植物亚界；门：维管植物门；亚门：羽叶亚门；纲：被子植物纲；亚纲：双子叶亚纲；目：茄目；科：茄科；属：烟草属；种：红花烟草种。 第一节烟草的植物学特征特性 烟草是多年生植物，在120~130天的大田生育期中，生长成为比种子大3000万倍的庞大植株，平均每小时增长约为种子的万倍。烟草株高叶大，需水肥很多。因此，根系在烟草一生中就显得更重要。 一．根 （一）根的形态 1．根的分布烟草的根属圆锥根系，由主根、侧根和不定根三部分组成(见图)。 烟草种子萌发时，胚根突破种皮后直接生长而成主根，主根产生的各级大小分支都叫侧根，由茎上发生的根都叫不定根。根系的密集范围比分布范围小得多，根系密集深度约在地表以下40cm，密集宽度在距茎周40cm范围，打顶以后有根系伸长到40cm以下或40cm以外。烟草的发根能力很强，采用培土的方法可使茎秆上长出很多不定根，起到充分吸收表土营养的作用。 2．烟根的初生构造 根尖由根冠、生长点、伸长区和根毛区组成， 从横切面看，烤烟根的初生结构由表皮、皮层和中柱三部分组成。 3．烟根的次生构造 主根和侧根在完成了初生生长后，还会进一步进行次生生长，使根的直径增粗，并形成次生维管组织和周皮等次生结构。次生构造是由维管形成层和木栓形成层分化而成，在根毛区上方开始出现。维管形成层向内产生次生木质部，向外产生次生韧皮部，形成根的次生维管组织；木栓形成层向外产生木栓层，向内产生栓内层，形成根的周皮。 （二）根的发生 烟草种子由种皮、胚和胚乳三部分组成。胚根正对着种孔。在适宜的温、湿度和气体交换条件下，种子吸收水分开始萌动，胚根突破种皮伸长出来，胚根突出种皮后即向地弯曲并垂直向下生长，就形成了主根。主根入土之后可以不断地形成侧根，侧根起源于中柱鞘，在根毛区的上部开始出现。 不定根是由移栽时埋于土层下方的茎上产生的，数量充足但分布较浅。 在幼苗生长的中后期，根系水平生长速度大于垂直生长，7叶期比5叶期根深增长了1.5倍，水平生长增长了1.8倍，9叶期比5叶期根深增长了1.6倍，而水平生长增长了2.6倍。 烟苗移栽到大田后，由于主根被切断，主根停止伸长，侧根大量发生，活力很强。在适
Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y
农杆菌介导的瞬时表达系统 一．溶液配制 乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存； MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌； MgCl2 1M 过滤后灭菌； Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。 (AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司) YEB过夜培养液(30ml) MES AS Kan 10mM 20μM 50μg/ mL 300μl 6μl 15μl 悬浮培养液(50ml) MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2) 酵母膏 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 MgSO4·7H2O 1g/L 5g/L 5g/L 5g/L 493mg/L 二．操作步骤 1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次； 2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h； 3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体； 4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡； 5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定； 6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。一般沉默发生在2-5天内； 7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。
名词解释 1、烟叶品质 2、外观质量 3、成熟度 4、种植制度： 5、轮作制度 6、壮苗： 7．烟草漂浮育苗8．早花9、烤烟产量10、外观质量： 11、身份12、油分13、弹性：14、物理特性： 15、评吸： 16、劲头： 1 7、刺激性： 1 8、苦味和辣味： 1 9、香气： 20、杂气21、吃味： 22、燃烧性： 23、阴燃性： 24、连作： 25、轮作： 26、间作： 27、套种： 28、格盘育苗： 29、托盘育苗30、需水量： 31、耗水量： 32、水分利用效率： 33、团棵： 34、旺长： 35、圆顶： 36、底烘：37．烟叶的吸湿性38．烟草的弹性39．烟草湿润育苗40．烟叶的外观质量41．晒烟42．包衣种子43．烟草优质适产44．烟草的内在质量45．烟草漂浮育苗46．早花 简答题 1.简述烟草根的初生构造和次生构造。 2.简述烟草根的生理机能。 3.简述烟草叶的构造及其生理机能。 4.简述烟草种子的萌发过程及其需要的条件。 5.简述环境条件对烟草生长发育的影响。 6.如何进行烟叶质量评价? 7.如何统一烟叶产量与质量的矛盾? 8.简述烟草产量与质量的关系。 9.烟草轮作、倒茬的意义。 10.烟草连作的危害有哪些？轮作有哪些优点？ 11.简述确定烟草移栽期的依据？ 12.简述育苗的要求及壮苗的标准。 13.如何正确决定大田期施肥量和氮、磷、钾搭配比例？ 14.简述烤烟测土配方施肥方法？ 15.简述烤烟大田需水规律和需肥规律？ 16.试述烟草大田期生长特点与管理要点。 17.烟草为什么要中耕培土，中耕培土的主要技术有哪些？ 18.试述烟田深耕的作用和技术。 19.烤烟生产时中如何划分生育期？ 20.如何确定烟草的移栽期。 21.试述打顶抹杈作用？ 22.如何决定烤烟打顶高度和留叶数？ 23.早花发生的原因及弥补措施，生产上如何避免早花的发生？ 24.如何预防烟叶底烘。 25.简述烟草地膜覆盖栽培技术。 26.分析烟田地膜覆盖栽培的优点和缺点。 27、请你根据田间烟株长势和土壤肥力情况，说明如何进行封顶打杈？（7分） 28、试论影响烟叶烟碱含量的主要因素。（5分） 29、试述烤烟进行中耕有什么作用？中耕的技术及要求有哪些？（6分） 30、请你说出硝态氮和氨态氮对烤烟生长发育的影响。（5分） 31.简述烟草的类型及其特点。 32简述烟草的生产特点。 33.简述烤烟烟区划分的依据。 34.全国烤烟种植最适宜和不适宜类型的条件？ 35.我国主栽的烤烟品种有哪些？ 36.简述烟草花的构造及其开花习性。 37.简述根、茎、叶生长的相关性。 38.简述烟草群体与个体的关系。 39.在轮作周期中确定烟草前作的原则。 40.烟稻轮作制和烟草三年五熟轮作制的优点。 41.简述烟草必需营养元素的营养作用。 42.为什么说氮素是烟草最重要的营养元素？ 43.根据烟草的需肥规律如何进行烟田施肥？ 44.如何确定烟草的施肥量？ 45.影响烟草养分吸收的因素有那些？ 46.比较烟草硝态氮和铵态氮营养的异同。 47.根据有机肥的特点，烟田应如何施用？ 48.简述烟田施用饼肥的优点及其使用方法。 49.简述优质烤烟生产的土壤条件有哪些？ 50.试述烟草对干旱胁迫的反应。 51.根据烟草的需水规律如何进行合理灌溉？ 52.简述烟田整地的方法和作用。 53.简述影响烤烟种植密度的因素。 54、试论影响烟叶烟碱含量的主要因素。（5分） 55、请你根据烤烟品种红花大金元的的品种特性谈谈其栽培和烘烤技术要点。 56、简述优质烤烟生产的土壤条件有哪些? （5分） 57、.简述烤烟大田需水规律和需肥规律。（5分） 58、优质烤烟生产所需的光照条件及云南烟区在这方面的自然优势有哪些? 59、试述优质香料烟生产的生态环境条件以及主要栽培措施（7分）。 60、概述烟叶品质评定的内容。（5分） 61、试述烟草漂浮育苗技术体系构成。（7分） 1、烟叶品质：是消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。通常包括外观质量和内在质量两个方面， 2、外观质量：指烟叶的商品等级质量，如烟叶的成熟度、身份、结构、部位、颜色等表现出的优劣程度。 3、成熟度：是烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映，成熟度好的烟叶颜色均匀一致，叶片正反面颜色差异小，油份足，色度浓，香气质好量足，吃味醇和，杂气和刺激性小。 4、种植制度：是指一个地区或生产单位的作物组成、配臵、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。 5、轮作制度：是指在一个轮作周期中，各种作物合理的安排顺序和田块布局。 6、壮苗：是指生长发育良好，新陈代谢正常，有机物质合成、积累较多，内含物丰富，碳氮比协调，抗逆性强，栽后成活率高的烟苗。 7．烟草漂浮育苗——所谓漂浮育苗，即采用质地很轻的泡沫塑料制成育苗盘，育苗盘的空穴中装上基质(人造土壤)，种子播种在基质内，然后将育苗盘移到育苗池中漂浮在营养液表面完成整个育苗过程。 8．早花——烟株未达到正常栽培条件下应有的叶数和高度，就提前现蕾开花，称为早花。它是营养生长受阻，生殖生长加速的结果。早花烟株矮小，叶数锐减，叶窄而薄，对产质影响很大。 2、烟制品的主要类型有卷烟，斗烟，水烟，雪茄，嚼烟，鼻烟。 3、确定烤烟移栽期的依据有气候条件、种植制度、品种特性、育苗技术、成苗因素。 4、烟草幼苗生长的最适温度是25-28℃，育苗期间低于2℃的低温和高于35℃的高温会引起冻害和灼伤幼苗。 5、优质烤烟生产所需的光照条件是和熙的光照。日照时数是500-700小时，日照百分率是40%；其中成熟期日照时数是280-300小时，日照百分率是30 %。 6、随着烟草种植密度的增加，烟田小气候中风速变小、地温降低、相对湿度增大。 7、全国烤烟适宜生态类型划分中，最适宜区的条件是1、无霜期≥120天；2、≥10°C积温＞2600°C；3、日均温≥20°C持续日数≥70天；4、0-60厘米土壤含CL量＜30mg/kg; 5、土壤PH5.5-6.5；6、地貌类型：中低山、低山、丘陵、高原；7、烟叶内在质量：香气质好，香气量足，吃味纯净。 10、影响烟草种子出苗的外界环境因素主要温度、水分和氧气（空气）。 11、烟草生产有产量与品质并重、生产工序复杂、对环境条件敏感、技术性强、烟叶的经济价值高的特点。 13、烟叶的产量是由单位面积上的株数，单株留叶数，单片叶的重量三部分所构成的。 14、烤烟的优质适产是指产量最高点与品质最高点既经济又合理地统一在一个水平上。 15、烟草适宜的前作有水稻，小麦，油菜等。 17、按调制方法分类，白肋烟属于晾烟，香料烟属于晒烟，黄花烟属于晒烟。 18、按调制方法和主要用途，烟草类型有烤烟、晾烟、晒烟、熏烟。 21、烟叶腺毛分泌物的主要成分是芳香油，树脂，蜡质。 25、烟田管理的“三一致”是指烟苗大小一致，烟株高矮一致，同部位烟叶成熟一致。 29、烟草种子萌发的三个过程是物理吸水阶段，营养物质转化的生化阶段，生理活动的生长阶段。 30、烟草根系生长的最低温度是7oC，最适温度是31oC，最高温度是43oC。 44、理想型烟株的特征为下部叶阳光充足，上部叶叶片开展，整株叶厚薄适中。 47、红花烟草属于植物界维管植物门被子植物纲双子叶亚纲茄科，烟草属。人工栽培的是红花烟草和黄花烟草。 48、烟草的根由主根、侧根、不定根三部分组成。 52、烟草的苗床期指从出苗到成苗。可分为小十字期、大十字期、猫耳期、成苗期四个生育时期。 53、烟草育苗中锻苗的方式主要有断水炼苗、揭膜锻苗和剪叶锻苗。 54、烟叶育苗的要求是苗壮、适时、量足、整齐和大小适宜。 55、生产中主要采用的育苗方式有漂浮育苗、水旱两段育苗和常规育苗等。 56、烟草漂浮育苗的壮苗的标准是根系发达、茎粗壮而柔韧、有一定的叶片数，叶色正常、抗逆性强。 57、烟草大田施氮量的确定是根据理论产量、土壤速效养分和土壤养分利用率和所用肥料利用率来确定的。 58、应变施肥主要是指看天施肥、看地施肥和看烟施肥。 59、按照烤烟大田施肥的时期分为基肥、前期追肥和叶面追肥等。施肥方法分为撒施、条施、穴施、肥料溶液灌根和肥料溶液喷施等。 61、移栽期的确定要依据气候条件、种植制度、品种特性和播种期综合考虑。 62、烟草对水分的消耗包括地表蒸发和叶面蒸腾两个方面，前者指土壤水分通过地表面蒸发散失，称为生态耗水；后者指水分通过烟株表面（主要是叶片）而散失，称为生理耗水。 64、烟田灌溉方法有穴灌、沟灌、滴灌和喷灌等。 65、烟草的早花是指烟株未达到正常栽培条件下本品种应有的高度和叶数就提前现蕾、开花的异常现象。 66、早花产生的原因是生理特性、品种特性、气候条件、栽培条件等四方面的原因。 67、烟草的底烘的指烟株下部叶为达到正常成熟时期就提前发黄或枯萎的现象。 68、底烘发生的原因有光照不足、土壤水分不足和水分过多等。 69、打顶技术包括打顶的时期、打顶的高度和留叶多少等。 73、香料烟具有特殊的浓香的特点，植株上部部位烟叶品质最好。 1、评定烟叶品质包括外观质量、内在质量、烟叶的化学成分、 烟叶的物理特性、烟叶的安全性五个方面内容。 2、“两烟”是指烤烟和卷烟。
◆名词解释 生物产量：烟草在整个生长季节中所积累的干物质重量。 经济产量：单位土地面积上所收获可用干物质的重量，对烟草来说就是烟叶的产量。 烟叶品质：消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。 成熟度：烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映。身分：烟叶的组织构造密度，即叶肉细胞的大小及其排列的疏密程度。 物理特性：叶片的厚度、叶面密度、单叶重、平衡水含量、填充值、含梗率等。评吸：通过烟叶燃吸后的烟气在经过人的口腔、鼻腔和喉部等感官时所产生的感觉评定烟叶质量的方法。劲头：烟气中的烟碱对人体器官作用时，能够引起兴奋反应的程度。 刺激性：口腔、鼻腔和喉部对烟气产生的刺激感强烈冲击的接受程度。 香气：烟叶燃烧后进入烟气中所表现出来的一种令人愉快的特殊芳香。 吃味：烟气反映在口腔内包括酸、甜、苦等味道感觉的总称，是烟气被口腔反映的味感。 种植制度：一个地区或生产单位的作物组成、配置、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。轮作：在同一块土地上于一定年限内有计划、有顺序地 轮换种植不同类型作物的 种植方式。 套种：在前一季作物生长后 期，在其预留的行间或带间 套种其他作物的种植方式。 壮苗：生长发育良好，新陈 代谢正常，有机物质合成积 累较多，内含物丰富，碳氮 比协调，抗逆性强，移栽成 活率高的烟苗。 格盘育苗：使用由若干苗穴 组成的育苗盘培育作物秧 苗的方法。 漂浮育苗：在温室或塑料薄 膜覆盖条件下，利用成型的 膨化聚苯乙烯格盘为载体， 装填上人工配置的培养基 质，将格盘漂浮于含有完全 矿质营养的苗池中，完成烟 草种子的萌发、生长和成苗 过程。 烟草需水量：每生产单位重 量干物质由烟株蒸腾所消 耗水分的数量。 水分利用效率：烟株消耗单 位重量水分所生产的同化 物的量。 圆顶：烟株打顶10-15d后， 上部叶完全展开，与中部叶 大小接近，烟株呈筒形的时 期。 底烘：烟株下部叶未达到正 常成熟时期就提前发黄或 枯萎的现象。 早花：烟株未达到正常栽培 条件下本品种应有的高度 和叶数就提前现蕾、开花的 异常现象。 有效积温：作物某个发育时 期或全部生育期内有效温 度的总和。 ◆简答题 1.简述苗床期烟草的生长 发育特点和管理要点。 烟草苗床期可划分为4个阶 段，根据各阶段烟苗的生长 特点进行管理。 出苗期：主要是种子萌发和 幼苗出土过程，烟苗由异养 向自养过渡。应密封薄膜保 温保湿。 十字期：烟苗生长缓慢，要 求较高的温度和湿度条件， 应密封薄膜保温保湿，当膜 内温度超过30℃时应及时 通风降温，防止烧苗。 生根期：烟苗根系生长活 跃，茎叶生长速度较慢，应 控水促根，及时间苗、定苗， 加强通风，揭膜晒苗。 成苗期：烟苗地上部分生长 速度较快，应加强练苗，及 时修剪，锻苗健壮。 2.简述以烟为主耕作制度 建立的原则。 （1）为烟草选择一个好前 作：前作氮素的残留量不能 过多；前作与烟草不能有同 源病虫害。 （2）烟田生态条件要良性 循环：秸秆还田改良土壤； 种植豆科等调节矿质营养 的作物；陪伴绿肥种植改良 土壤。 （3）优化布局，相对集中： 以村民组为单位安排轮作 布局；交通、水利建设配套； 烤房群落布局合理。 （4）轮作周期时间3年以 上：缓解消除病害的需要； 作物间营养调节的需要。 3.简述烟草中耕培土的作 用和方法。 （1）破除土壤板结，疏松 土壤，增大土壤通透性。 （2）提高地温，促进土壤 养分释放。
Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理 电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等 影响电穿孔效率的因素 电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip), the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。 2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的 culture medium，DPBS等。 3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。 4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。 5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a 1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。 6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。 7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个