细菌纤维素的研究进展 摘要：细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，具有生物活性、生物适应性，具有独特的物理、化学和机械性能，例如高的结晶度、高的持水性、超精细纳米纤维网络、高抗张强度和弹性模量等，因而成为近年来国际上新型生物医学材料的研究热点。概括细菌纤维素的性质，发酵过程，改性方法以及在生物医学材料上的应用。 关键词：细菌纤维素；改性；生物医学材料；应用 0 前言 细菌合成纤维素是在1886年由Brown首次报道的，是胶膜醋酸菌A.xylium 在静置培养时于培养基表面形成的一层白色纤维状物质。后来在许多革兰氏阴性细菌，如土壤杆菌、致瘤农杆菌和革兰氏阳性菌如八叠球菌中也发现了细菌纤维素的产生。细菌纤维素与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以β一1，4一糖苷键连接而成的高分子化合物，此外，细菌纤维素相对于传统的纤维素资源又有其优势，如加工时不用去木质素，可合成高质量的纸张或者加工成任何形状的无纺织物，还可通过发酵条件的改变控制合成不同结晶度的纤维素，从而可根据需要合成不同结晶度的纤维素。 从纤维素的发现至今已有一百多年的历史，但由于无合适的实验手段以及纤维素的产量较低，因此多年来一直未受到足够重视。近十几年来随着分子生物学的发展和体外无细胞体系的应用，细菌纤维素的生物合成机制已有了很深人的研究，同时在细菌纤维素的应用方面也有了很大进展。 1.细菌纤维素的结构特点和理化特性 1.1化学特性 经过长期的研究发现，BC和植物纤维素在化学组成和结构上没有明显的区别，均可以视为是由很多D-吡喃葡萄糖苷彼此以(1-4)糖苷键连接而成的线型高分子，相邻的吡喃葡萄糖的6个碳原子不在一个平面上，而是呈稳定的椅式立体结构。
油水分离器使用方法 油水分离器就是串联在机组进油管路中，将油和水分离开来的仪器，原理主要是根据水和燃油的密度差，利用重力沉降原理去除杂质和水份的分离器，内部还有扩散锥，滤网等分离元件。 Lees power 可针对不同地区油品以及客户要求在发电机组加装此装置，且确保机组出厂前每一个此装置都经过严格测试。下面为大家讲诉如何使用油水分离器。分两部分： 一、初次使用 二、排放完积水杯内的水或者杂质后的使用方法 首先，我们先来了解下油水分离器是如何串联在机组进油管路中的：（进油油路） 图一图二图三 使用方法： 一、初次使用（工具13#开口扳手，抹布适量） 用户在初次使用发电机组时，首先将底部油箱加满柴油后。 然后使用13#的开口扳手（图1），将（图2）红色圈内的柴油滤清器总成上的螺栓逆时针方向松开后（图4），在将（图5）中红色圈内手压油泵，向下压10-15下，将柴油滤清器内部的空气排出（伴随有少量柴油）。同时会发现（图6）油水分离器的积水杯中已经吸有油箱中的柴油。 图1图2 图3 图4 图5图6 图7 图8 持续按压图五圈内手压油泵，直至油水分离器积水杯中注满油，如图7；然后将图8柴油滤清器总成上的螺栓顺时针拧紧。图七图八此时方可开启机组 二、排放完积水杯内的水或去除杂质后的使用方法 （工具13#开口扳手，抹布适量） 机组长时间使用或者油品不纯净的情况下，油水分离器积水杯内积存大量水或者杂质。此时需要对油水分离器进行清理工作。操作如下： 先用13#的开可扳手将图9红色圈内的积水杯底的白色放水栓顺时针方向松开如图11，将水
排出后（如是杂质直接卸下放水栓）再逆时针将白色放水栓拧上（放水栓为塑料易损件，故而确保不漏油即可），至图12状。然后重复图1-图8动作将油水分离器积水杯内吸满油。方可再开启机组。注：无论在何时开启机组都请确认油水分离器积水杯内柴油是满的，方可开启机组。否则机组开启后会立刻报警。 图9图10图11图12
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
油水分离器操作说明书 Operation Instruction to Oil-Water Separator 一、概述Summarize YSF型油水分离组合装置是由中国船舶工业总公司第九设计研究院针对陆域含油废水特性设计的一种新颖油水分离装置，采用了多项油水分离的最新成果，可以适用于不含表面活性剂的各类机油、柴油、润滑油、动植物油等油品的含油废水处理，具有结构紧凑，操作管理维修简便，能耗低，分离效率高等特点。处理后出水的含油量能有效地控制在5mg/L以下，可直接排放或适当回用，分离出的废油也可回收利用，因此在节能、节水、保护环境等方面均显示出良好的技术经济效益。YSF type oil-water separator combiner, one of latest oil-water separating device, which has been designed in the light of oiled wastewater’s characteristic by No. 9Design and Research Institute of Ship Industry Parent Company of China and has adopted many latest oil-water separating research results, is suit for many kinds of oiled wastewater treatment such as machine oil, diesel oil, lubricating oil and tallow, vegetable tallow. And it has the advantage of compact structure, easy operation and maintenance, low consumption, high separating effect etc. So, the oil percentage of effluent by treatment can be up to down 5mg/L effectively and may directly discharge or reuse properly, also, the removal oil can reuse. Thereby above, it is indicative that it has upstanding technical economical benefits at aspects of energy and water saving, environment protection. 本装置采用简便、低运行耗费的全物理法处理工艺。It had adopted true physical treatment process, which is easy, and low energy consumption.
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
油水分离器使用说明书 1 ．概述 舱底水分离器是在积累多年研制经验及吸取国外先进技术的基础上采用真空及微滤原理研制成功的新产品。可用于处理船舶舱底油污水，也适用于工矿企业、油库等含油污水处理，并能处理含乳化油浓度较高的油污水，性能符合国际海事组织规定的船舶含油污水排放标准及我国政府规定的船舶、工矿企业油污水排放标准，并符合国际海上环境保护委员会 IMO-MEPC107 ( 49 ）决议规范要求。本产品己获得中国船级社颁发的国际通用的型式认可证书。 本装置有下列特点： ( l ) 配套泵不直接吸入含油污水，因此避免了原含油污水的乳化，保证分离装置有较高的分离效果。 ( 2 )分离器中的第一级聚结分离元件能自动反冲洗，不会堵塞，长期使用不需要更换。 ( 3 ) 有良好的排油自动控制及配套泵的安全保护措施，根据油污水性质能自动控制一级处理排放或转入二级处理排放，以及处理不合格时自动关闭排出口不合格处理水返回机舱功能。操作简便，可靠性高，符合无人值班机舱要求。 ( 4）装置由一级分离器、二级分离器、螺杆泵（柱塞泵）、电气控制箱、油份浓度报警记录仪、粗／精滤器、三通转换阀（电磁转换阀）等组装在公共基座上，必要时也可以根据机舱位置将一级油水分离器和电气控制箱及二级乳化油分离器和油份浓度报警记录仪分开独立安装。 3 ．基本工作原理（型舱底水分离器系统原理图） 配套螺杆泵（柱塞泵）在一级分离装置排出口处抽吸处理后的排水过程中，使一级分离装置内产生真空，舱底水经粗过滤器和上部吸水／排油阀进入分离器内部扩散喷口，进行初步油水分离，大油滴浮至顶部，含有小颗粒油滴的污水向下进入特制的聚结器，在内部进行聚结分离，形成较大油滴，上浮至顶部集油室。一级处理后的污水则向下经分离器底部排出，流向底部进水三通阀（电磁阀），进入单螺杆泵（柱塞泵）吸入口，从泵的排出口流出再经过排水三通阀，一、二级转换三通阀（常开、常闭电磁阀）和一级排水截止止回阀排向舷外。 当一级分离器排出的水不合格时，油份报警记录仪发出信号，转换三通阀（常开、常闭电磁阀）动作，一级排放水进入二级乳化油分离器继续进行微滤分离处理。合格的排放水经二级排水三通阀（二级排水截止止回阀）排向舷外，每隔三十分钟再回复至一级分离器处理，恢复上述处理工况。当二级乳化油分离器处理性能失效，二级排放不合格时，油份报警记录仪再次发出信号，回舱气动阀（回舱电磁阀）打开，处理水经此阀回舱底。 当处理工况为二级微滤分离时，二级分离器中上部的排污调节阀为常开式，一部分带有细小固体悬浮物的油污水通过此阀回舱底以减少微滤器堵塞阻力，排污调节阀的开启量，通过观察流量计调节至额定的l / 2排出水量。 分离后的污油在一级分离器的顶部集聚到一定程度时，油位检测器触发信号，气控型分离装置使一级处理电磁阀开启，压缩空气同时进入三只三通阀的顶部气缸，推动活塞向下，关闭常通口，打开常闭口，舱底水暂停进入分离器，分离后的水暂停排出。海水（清水）由进水三通阀的常闭口进入泵吸入口，从泵的出口再通过排水三通阀的常闭口进入分离器底部，逆向经过聚结器进行反冲洗，并使分离器内部由真空变成压力状态。集聚在顶部的污油通过上部吸水／排油三通阀的常闭口排向污油柜。 4 ．装置的主要配套件 4 .1 .电气控制箱 4 .1 .1 专用泵的启动，停止及一、二级自动转换原理（见图2电气原理接线图） 舱底水分离器专用泵组由三相交流电动机带动单螺杆泵（柱塞泵）将含油污水吸入舱底水分离器。 当舱底油污水被处理完或吸入过滤器被堵塞时，均能使专用泵停止工作，其电器工作原理为： 当污水舱内液位过低出现吸空现象时，真空度下降至大气压力，或当吸入滤器被堵塞时，分离器上部的真空度将急剧上升，在出现这二种情况时，真空度有明显变化，通过电接点真空表转换成电信号，当真空度过高时，实际真空度指针（黑色针）与高真空度接触指针（绿色指针调整至一0 . 05MPa ）接通，当真空度过低时，真空度指针与低真空度接触指针（红色指针调整至一0 . 01MPa ）接通，切断安装在电器控制箱内的交流接触器电源，使电动机停止工作。 4 .1 .2 污油温度自控原理 为使集油室中高粘度的油通畅地排出，并防止污油粘结在油位检测器上造成控制失灵，在油位检测器附近设置了电加热自控系统。 其工作原理为：利用装在集油室中的温度检测元件接收信号，通过电接点温度表的一根实际温度指针和另二根高、低温度调节指针转换成电信号，对电加热器加热温度实行自控。一般调整至35℃～45℃。 4 .1 .3 自动排油原理 油位是通过电阻式油位检测器检测，其工作原理如下： 在一级油水分离器顶部的集油室中装有高位、低位两根油位检测器，利用油位检测器在水和油中的导电率不同，从而在油位检测器与油水分离器壳体之间产生不同的电信号去控制一级处理电磁阀（排油电磁阀）通过压缩空气打开吸水／排油三通阀排油通道，达到自动排油的目的。 本控制箱还备有手动排油控制。（此时应将排油转换开关拨置手动位置，手动排油动作则自动排油不起作用）。 4 .1 .4 控制箱其它功能说明 (1)本控制箱设有至机舱集中控制台的控制触头，以提供集控台上的灯光，显示 舱底水分离器在工作状态。 (2)控制箱通过两个安装在精滤器和乳化油分离器上的电接点压力表提供超压报警灯以提醒操作员更换失效的滤芯或乳化油
Primary human/mouse lung fibroblast isolation 人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法 参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente) Materials: 材料： 1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution, 2.5mg/ml (HBSS); b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS) 消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml） b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml） 2. Nylon filters 40/70 μm 3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B) 4. Knife (disposable) 5. Syringe 6. PBS Digestion solution: Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13) 步骤： 1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl = 1:4:5, 100ul/10g weight; 称重小鼠后麻醉 2. Inject and wait 10min till the mouse sleep 腹腔注射后等待10分钟
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离 其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内 残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙 台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入 新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。 另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
【摘要】目的：建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法。方法：采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophage,AM）, 并进行原代培养。用波形蛋白(Vimentin)、CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果：所得细胞产量大、纯度高。细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性；AM细胞则相反。扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛，细胞间连接成网状，蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达。结论：该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）的发病机制及治疗方法的体外研究。 【关键词】大鼠; 肺成纤维细胞; 巨噬细胞; 原代细胞培养 ［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划项目（03KJD320076）;镇江市社会发展科技计划项目（SH2004043） Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats Y AN Yu-lan, LIU Yang, BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian, ZHENG Jin-xu (Department of Respiratory Medicine, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medicine，Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China) ［Abstract］Objective: To develope a reliable method for isolation, purification and primary culture of lung fibroblast(LF) and pulmonary alveolar macrophage(AM) from rat for studies on pathogenesis and treatment of interstitial lung disease in vitro. Methods：The lung tissue of 2 days old immature rats was digested with trypsin.LFs and AMs were isolated and purified, then cultured. The nature of the cultures was identified by CD14 staining, vimentin staining, electron micrography and Western blot. Results：Excellent yields of highly purified, culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively. The expression of CD14 in AMs was positive and that of vimentin negative by immunofluorescence chemistry. Those, however, in LFs were just opposite. Ramified stracture between purified LFs were observed by ultrastructural examination under electron micrography.Vimentin in purified LFs was revealed by Western blot. Conclusion：This technique might be a reliable method for isolation and purification and primary culture of pulmonary alveolar macrophages and lung fibroblasts from rat lung and could be used for the study of interstitial lung disease ［Key words］lung fibroblasts; immature rat; pulmonary alveolar macrophage; primary cell culture 原代培养又称初代培养, 是自供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞来源于刚刚离体的组织和细胞, 其生物学特性未发生很大变化, 仍具有二倍体遗传特征, 最接近和反映体内生长特性, 对研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化的机制具
细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的
10t/h 油水分离器 使 用 说 明 书
目录 一：油水分离系统简介--------------------------------3 1：油水分离系统组成----------------------------3 2：油水分离系统工作原理------------------------3 ①固液分离器工作原理----------------------3 ②油水分离器工作原理----------------------4二：油水分离系统工作参数----------------------------5 1：固液分离器工作参数-------------------------5 2: 油水分离器工作参数--------------------------5 3:地坑排水泵工作参数---------------------------5三; 外配套设备清单--------------------------5四：油水分离系统竣工图及设备合格证-------------------6 一：油水分离系统简介
1：油水分离系统组成 该油水分离系统由油水分离器固液分离器排水泵1电控系统组成。 2：油水分离系统工作原理 来自厨房的含油废水经排水地沟及排水管进入固液分离器，固体废物留于分离器内，废液排出固液分离器（每星期清掏一次固液分离器）。废水进入油水分离器，保证废水上升速度部大于0.005m/s( 实际上升速度为0。0037m/s)。此时油水分离（即油水分层,油浮于上面），经刮油机将浮油刮入储油池，分离后的水经水位调节器进入清水池，经污水泵提升外排。刮油的液面根据液位调节器来调节。刮油机构工作10分钟，停110分钟。清水池污水泵于高液位时泵工作，低位时停泵。油水分离器安装于地坑内，当地坑内集水水时，经地坑内排水泵排入油水分离器，水位高时地坑内安装排水泵开启，水位低时停泵。 ①固液分离器工作原理 固液分离器由进水阀门分离器壳体（PVC）及过滤筒组成。 开启阀门，厨房的含油废水进入固液分离器，固体废物留于过滤筒内，液体经过滤筒排出。每星期关闭一次阀门，开启固液分离器上盖，取出过滤筒，将过滤筒中的固体废物倒掉，清洗过滤筒，而后将过滤筒安装于过滤器中，封好过滤器上盖，再开启阀门。 固液分离器示意图
原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术
一、细胞室灭菌 1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置 于超净台内，紫外照射20-30min。 2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射 紫外。） 3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。 4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。 5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。） 二、胶原酶1的配置 分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。 具体方法为：（以下过程均在超净台内操作） 1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。 2.加入12ml PBS溶液。 3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。 4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉 素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。 三、取材并分离心肌细胞 1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。 2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。 3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超 净台内。 先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min. 4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠 左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。 5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。 6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。 7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形， 在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。 8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取 出余血。 9.继续冲洗2-3遍， 10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净 处），加入2ml PBS溶液。 11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。 12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。 13.取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。 14.在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。 15.从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C 热水），37°C消化5min。 16.取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血
安装油水分离器时，污水进水口一定要比设备进水口高，因为不同型号的进水口高度不同，所以在安装的时候也要把握好设备安装的位置，不过不管怎么安装，要保证设备要在一条水平线上，还要在出水口处接通排污管，排油口也要用盆或者桶接着。那安装好之后，它在使用的时候需要注意哪些事项呢？ 1、设备可直接安装在含油污水流经的通道上，把污水出口对准油水分离机带格栅的进口即可，与其它设备可用管道连接。底部的排污管线可与污泥脱水装置连通，如未配污泥脱水装置可直接接入排污管。 2、油水分离时必须调正其水平位置，不得有误差。 3、第一次使用前，应先在装置内注满自来水，而后调节设备上调节板的位置，直到出油口只出油不出水为止。 4、调节板调正后，请不要随意乱动，否则将影响出水的水质。 5、应注意将进水口过滤网上的杂物倒掉，并清理干净。 6、应注意清理集油箱内的废油：先打开油箱下部排水阀，排掉一部分水，
而后把废油收集。请保持设备的外部整洁。 7、使用后，应将杂物筐每天提出挂油倒垃圾，并将水上浮油清除掉，箱体每2周清扫一次，将粘在隔板金属表面的油污用刀刮掉，底部垃圾要求清除干净。清理完毕恢复原状。 8、当油水分离机的出水、排水管堵塞时，将箱盖罩拿掉，因有臭气溢出，应快速清通，清通后将排水口迅速盖上。 9、在使用过程中应定期冲洗设备内部，一般每半月冲洗一次，或视情况而定。 10、每月至少彻底清理油水分离机的隔渣箱和隔油箱一次，清理箱里面的沉渣和油泥，并检查电控部分是否正常工作，清理完毕后必须将油水分离器注满清水。 11、污水进口处一定要安装隔渣网，一定要确保整个油水分离机在同一水
平线。 12、每天对隔渣箱和隔油箱清理若干次，以保证水流平缓畅通和提高隔油效果，在对油水分离机做清理之前请注意先关掉电源。 以上内容由河南上田泵业有限公司提供，如有不清楚的或者是购买需求，可致电咨询。