<医学生物学实验>整理
1. 常用的吸量管有：
奥氏吸量管、移液管、刻度吸量管
4. 如何正确使用吸量管？
答：(1) 选用原则：就近原则
(2) 吸量管的使用：吸-擦-调-放
5. 如何正确使用微量加样器？
答：转-按-吸-擦-按
6. 如何正确使用离心机？
放置-装管-平衡-启动-取出
二、主要实验方法原理
1.分光光度法基本原理是什么？
答：不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度, 对不同物质进行定性和定量的分析。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。
2. 利用分光光度法对物质进行定量测定的方法主要有哪两种？
答：直接比较法（公式法）、标准曲线法
3. 层析法基本原理是什么？
答：层析法就是利用混合物在经过固定相和流动相两相的过程中，其中的待分离物质在不同的两相中不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于混合物中各组分间在理化性质如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等方面存在着差异，因此当它们经过上述相同重复过程时，各自的情况就会有所不同从而使各物质得以分离。
4. 常用的层析法有哪几种？
答：薄层层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。
5. 离子交换剂的作用原理是什么？
答：①阳离子交换剂吸附阳离子；②阴离子交换剂吸附阴离子；
当离子结合到固定相交换基团上以后，用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。
6. 凝胶层析的作用原理是什么？
答：分子筛
7．亲和层析的作用原理是什么？
答：亲和层析是以能与生物分子进行特异结合的配基作为固定相，对混合物中某一生物分子进行高效分离纯化的层析技术。
9. 影响电泳的主要因素是什么？
答：
(1) 电泳溶液的pH值|: 当溶液的pH值等于某种两性电解质的等电点时，不带电荷。当溶液pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，溶液pH值大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。
(2) 缓冲液的离子强度: 离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。常用离子强度为0.02~0.2。
(3) 电场强度: 电泳速度和电场强度成正比关系。电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快，但电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应, 可使介质中溶液蒸发及生物样品
变性。
(4) 电渗作用: 如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。
10. 区带电泳分几类？
2．按支持物的装置形式不同，可分为：①平板式电泳；②垂直板式电泳；③垂直管状电泳。3．按pH值的连续性不同，可分为：①连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH值保持不变；②不连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH值，能使分离物质的区带更加清晰。不连续与连续电泳的主要区别在于前者有两层不同孔径的凝胶系统；电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同；电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。
11. 离心技术基本原理是什么？
低速 6000r/min 高速 25000r/min 超速
答：离心基本原理是根据物质沉降系数、质量、浮力因子等不同，利用离心机产生强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到到达极限速度所需要的时间。其单位用S表示，1S = 1×10 -13秒。它反映的是单位离心力做用下颗粒沉降的速度。
12．常用的离心分离方法有哪些？原理是什么？
答：1．差速离心法：不同的离心速度，由低速到高速分阶段离心，将不同颗粒大小的微粒分批沉降析出，留取所需成分。
2．密度梯度离心法：样品溶液在密度梯度介质中进行离心沉降，在一定的离心力作用下把各组分的颗粒分配到梯度液中相应位置上，形成不同区带的分离方法。
3．超速离心法：超速离心法多用于亚细胞结构的分离制备和生物大分子的制备。目前转速已达85000r／min以上。生物大分子在超离心力场作用下，离心力大于分子扩散力，生物大分子便逐渐沉降。分子量和分子形状不同，其沉降的速度就不同，因此而被分离。离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法，是实验室分离提取生物分子常规采用的技术之一。
17. 细胞培养必需设备有哪些？
答：细胞培养必需设备有超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、液氮生物容器、压力蒸汽消毒器、无菌过滤器、电热干燥箱、离心机、细胞计数板和冰箱等。
18. 无菌操作技术包括哪些内容?
答：1. 保持安静、整洁的无菌工作区域; 2. 保持干净整洁的工作面; 3. 注意个人卫生；
4. 在洁净工作台内无菌操作
实验一贴壁细胞的传代培养
1.何谓贴壁细胞？
答：贴壁细胞又称锚着依赖性细胞，是指赖于贴附在培养器皿表面生长的细胞，大多数培养细胞属于此类。细胞附着或贴附于底物表面上，呈现出极性细胞的典型形态过程，称为贴壁。贴壁是贴附类细胞生长增殖的条件之一。
2. 贴壁细胞的传代培养的实验原理是什么？
答：细胞的贴壁是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合而实现的，细胞在铺展之前，细胞已分泌了细胞外基质和蛋白聚糖。细胞外基质先粘着在带电荷的培养基质上，然后，细胞再通过特异的受体附着到基质上。蛋白酶可消化细胞外基质，甚至通过降解跨膜蛋白的胞外区使单层培养的贴壁细胞彼此分离。上皮细胞一般不易解离，因为它们通过紧密连接复合体使细胞结合在一起；间充质间结合则更多地依赖基质的作用，因此容易分离。
3．细胞的计数方法是什么？
n/4*104 *稀释倍数
4．怎样鉴别死、活细胞？
台盼蓝染色法”。
5. 怎样进行细胞计数？
答：低倍镜下按一定方向逐格计数板内四个角的每格大格中的呈透亮的细胞数。若细胞正好压在格线上，则按数上不数下、数左不数右的原则计数。
实验二细胞标本的制备与形态观察
蟾蜍软骨细胞、中性红染料、高尔基体粉红色
实验三细胞无丝分裂和有丝分裂
1．马蛔虫子宫切片有何特征？
子宫腔内充满处于有丝分裂不同时期受精卵细胞。每个受精卵细胞由厚膜包围，呈灰色。受精卵细胞在膜内进行分裂，此膜只在发育早期紧贴细胞质，在较晚期膜与分裂球之间有清亮的间隙，这是由于分裂球收缩而形成的。
实验四亚细胞组分的分离及观察鉴定
1. 亚细胞组分的分离及观察鉴定的实验原理是什么？
答：将悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，悬浮的颗粒就要逐渐地沉降下来，颗粒越重，下沉越快，反之则上浮。但是颗粒在重力场中的沉降速度并不只是与它的质量有关，还与它的密度、大小和形状有关，此外还与介质溶液的粘度等因素有关。但是当颗粒的大小小于几个微米时，它沉降的速度很慢，而扩散现象非常严重，所以不能仅依靠重力场来观察它们的沉降速度，必须利用高速离心的方法，产生出强大的离心力场，于是就产生了超速离心、分级分离的技术。细胞内不同结构的比重、大小和形态都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种亚细胞组分分级分离出来。沉降速度：细胞核>线粒体>微粒体
2. 为什么本实验要在低温下操作？
答：防止亚细胞在分离的过程中被破坏。
3. 用冷玻片滴片有何意义？
答：利于细胞、亚细胞较牢固地贴于片上。
4、线粒体染色：詹纳斯绿
细胞核染色：甲基绿-派洛宁
5、永久制片观察：
苏木精染色，深蓝色线状物或颗粒物为线粒体
镀银染色：深棕色网状结构为高尔基体
第三版块生物大分子的分析方法实验一
生物分子在细胞内分布的分析
1.Feulgen反应的原理是什么？
答：DNA 是遗传的物质基础，主要存在于细胞核中，在60℃ HCl水解作用下，DNA分子中脱氧核糖的C-1’与膘吟碱基形成的糖苷键断裂，在脱氧核糖的C-1’上暴露出游离醛基，醛基与Schiff 氏试剂（无色亚硫酸品红液）反应形成紫红色化合物。这是DNA特有的显色反应；称为福尔根（Feulgen）反应。
亮绿染细胞质，呈绿色。
3.实验中应注意的问题是什么？
答：1. 水解的时间不宜太长或太短水浴温度要保持60℃以上，以保证充分水解以及染液能够正常着色。
2. 亮绿复染的时间不能太久，宜保持在lmin以内，以避免细胞核也被染成绿色。
4. 乳酸脱氢酶在细胞内定位的分析实验原理是什么？
答：乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase存在于细胞胞质中，在NAD+存在的情况下，可催化乳酸氧化脱氢为丙酮酸，反应中底物分子脱下的氢由乳酸脱氢酶的辅酶NAD+接受，还原为NADH+H+，NADH+H+ 可将氢通过受氢体吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS) 供给四唑盐，将其还原为蓝紫色的双甲臜沉淀，因此在细胞内存在酶活性的部位将呈现蓝紫色的沉淀。
5. PAS反应定性分析糖原在细胞中定位的原理是什么？
答：糖原是动物细胞内贮存能量的多糖物质，在动物的肝脏中尤为丰富。检测糖原的一般方法为过碘酸希夫反应。其原理是利用过碘酸将糖原氧化，把葡萄糖分子中2、3 位碳原子间的键打断，将其上的乙二醇变为二醛基，后者与Schiff试剂反应形成深玫瑰红色化合物，从而显示糖原。
6. 苏丹黑法分析脂类在细胞中定位的原理是什么？
答：苏丹黑染色法属于脂溶性染料显示法。苏丹黑是一种脂溶性染料，可溶于脂类从而使细胞中的脂类显示黑色。
7、甲基绿-派洛宁染DNA\RNA原理
甲基绿带两个正电荷染DNA 呈蓝绿色
派洛宁带一个正电荷染RNA 呈红色
实验二蛋白质含量的Folin-酚法测定
1．Folin-酚法测定蛋白质含量的原理是什么？
答：蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸(tyrosine)，在碱性条件下其肽链与Cu2+ 螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线或用公式，求得样品中蛋白质含量。
2．Lambert和Beer定律阐述了什么？
答：该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。
4．Folin-酚法测定蛋白质实验中应注意的是什么？
答：各管加酚试剂后迅速摇匀，不应出现混浊。
实验三血清γ-球蛋白的精细分离与纯度鉴定
1．离子交换层析法分离纯化蛋白质的原理是什么？
答：血清中含有清蛋白（albumin）和各种球蛋白(α-、β-、γ-球蛋白)，经初步分离提取可得含球蛋白的粗制品。球蛋白粗制品再用DEAE-纤维素柱层析法进一步分离可纯化出γ-球蛋白。DEAE-纤维素为阴离子交换剂（anion exchanger），在pH6.5条件下，带有正电荷，能够吸附带负电荷的清蛋白、α-球蛋白和β-球蛋白(它们的pI分别为4.6、5.06和5.12)，而γ-球蛋白(pI为7.3)不与DEAE-纤维素结合，因而留在溶液中，此时收集所得即为进一步纯化的γ-球蛋白，纯化的产物可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度。
2．离子交换层析法分离纯化蛋白质的实验步骤是什么？
答：1. DEAE-纤维素处理；2. 装柱; 3．平衡；4. 样品上样与洗脱收集；5. DEAE-纤维素的再生与保存。
3. 如要测定某种蛋白质的分子量，采用何种层析法最好？
答：如要测定某种蛋白质的分子量，采用凝胶层析法最好
4. 离子交换层析法分离纯化蛋白质实验中应注意的是什么？
答：1. 由于乙酸铵是挥发性盐类，故溶液配制时不得加热，配好后必须密封保存，以防pH及浓度发生改变，否则会影响所分离的蛋白质纯度。
2. 可用20％三氯乙酸溶液代替磺基水杨酸溶液来检验洗脱液中有无蛋白质。
3. 用HCl处理DEAE-纤维素时，时间不宜过长，否则DEAE-纤维素会发生变质。
5. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白质分离纯度的原理是什么？
答：以聚丙烯酰胺凝胶作为载体
由丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺聚合交联而成。
引发剂是过硫酸铵，催化剂为四甲基乙二胺。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
还原剂β?巯基乙醇，它能破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质的构象和形状改变，几乎全部呈长椭圆棒状，
6. 不连续凝胶电泳的支持体由什么组成？
答：由分离胶和浓缩胶组成。上层为浓缩胶，一般Acr为2％ ~ 3％，缓冲液为不同浓度的Tris-HCl、pH值为6.8左右；下层为分离胶，Acr为5％ ~ 10％，缓冲液常用Tris-HCl，pH值为8.8。上、下电泳槽盛有pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，上电泳槽接电源的负极，下电泳槽接正极。
7．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中应注意的是什么？
答：1）丙烯酰胺(Acr) 和双丙烯酰胺(Bis) 有很强的神经毒性，最好戴手套、口罩。
2）不要用洗衣粉和刷子擦洗电泳平板玻璃板。
3）微量进样器针头极易堵塞，吸样后应及时清洗；玻管中的金属芯子不宜拔出，防止弯曲和弄脏。
4）吸取溶胶的滴管、吸管等，要立即排空和冲洗，以防凝固堵塞。
5）实验过程中，注意勿弄破平板玻璃。
8、指示剂：溴酚蓝；染色剂：考马斯亮蓝；步骤：取样、制胶、电泳、剥胶、染色
9、浓缩胶中迁移率：cl->蛋白质->甘氨酸-
实验四碱性磷酸酶的Km值测定
1. 碱性磷酸酶的Km值测定实验原理是什么？
以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4—氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
2. 请写出Michaelis-Menten方程
答：上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，而其中的V则表示反应的起始速度。
2. 何谓Km？
米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。大多数酶的Km值在0.01~100 mmol／L间。
5．实验中应注意的是什么？
答：1．血清取量要准确。2．酚标准曲线必须是过原点的一条直线。
第五版块生物学实验技术在医学研究中的应用
实验一血清谷-丙转氨酶活性测定
1. 血清谷-丙转氨酶活性测定的原理是什么？
以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在谷-丙转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用显色剂2，4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成丙酮酸二硝基苯腙。此化合物在碱性溶液中呈棕色 2. 实验中应注意的是什么？
答：酶的作用时间、温度、试剂的pH值以及试剂的加入量均应准确。
实验二葡萄糖氧化酶法定量测定血糖浓度
1．葡萄糖氧化酶法定量血糖的原理是什么？
答：葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下氧化成葡萄糖酸、并产生1分子过氧化氢，后者在过氧化物酶催化下放出氧，氧将4一氨基安替比林偶联酚（色原性氧受体）的酚氧化，生成红色的醌类化合物。
实验三血清尿素氮含量的测定
1. 二乙酰一肟法测定血清尿素氮含量方法原理是什么？答：尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经Fe3+的催化缩合，并在氨基硫脲存在下，生成3－羟－5,6－二甲基1,2,4一三嗪的红色化合物。氨基硫脲能提高反应的灵敏度，又能增加显色的稳定性。
实验中应注意的是什么？
1. 水浴保温的时间要准确，水浴后一定要冲凉再进行比色，且要及时比色，避免随时间的延长而使颜色发生变化。
2. 配制A液时，一定是酸向蒸馏水中倾倒，且边倒H2SO4 、H3PO4边搅拌。
实验习题
细胞形态与细胞分裂观察
1、在细胞周期中，哪一时期最适合研究染色体的形态结构
A、间期
B、前期
C、中期
D、后期
2、有丝分裂与无丝分裂的主要区别在于后者
A、不经过染色体的变化，无纺锤丝出现
B、经过染色体的变化，有纺锤丝出现
C、遗传物质不能平均分配
D、细胞核先分裂，核仁后分裂
3、关于光学显微镜，下列哪项有误
A、细菌是光镜能清晰可见的最小物体
B、由机械系统和光学系统两大部分构成
C、可用于观察细胞的显微结构
D、其分辨力由目镜决定
4、光学显微镜的分辨力（最小分辨距离）可达
A、0、1um
B、0、2um
C、0、3um
D、0、4um
5、适于观察无色透明活细胞微细结构的光学显微镜是
A、普通显微镜
B、电子显微镜
C、荧光显微镜
D、倒置显微镜
6、生物制图原则包括
A、典型、真实
B、点、线构图
C、在右侧标住结构名称
D、以上都正确
7、马蛔虫卵与大蒜根尖细胞有丝分裂图像相同之处在于
A、染色体数量一致
B、均有细胞壁结构
C、均可见中心体
D、均可见纺锤丝
8、光镜观察高尔基体所用的染色方法为
A、HE染色
B、Giemsa染色
C、镀银染色
D、考马斯亮蓝染色(微丝束)
9、高速离心机的转速一般为
A、<6000r/min
B、6000r/min<转速<25000r/min
C、>25000r/min
D、>50000r/min
亚细胞组分分离
1、下面关于离心分离方法叙述不正确的是
A、离心分离是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降借以分离比重不同的各种物质成分的方法
B、生物大分子的分子量、分子大小、分子形状都会影响其沉降速度
C、生物大分子在超离心场作用下分子扩散力大于离心力便逐渐沉降（应为离心力大于分子扩散力）
D、可以应用密度梯度介质进行密度梯度离心以获得更好的分离效果
2、利用逐渐增加离心速度使样品中沉降速度不同的颗粒逐步分离的方法是
A、差速离心法
B、密度梯度离心法
C、速度区带离心法
D、等密度离心法
3、细胞生物实验课没有涉及的制片方法是
A、压片
B、滴片
C、涂片
D、切片
4、可以用于线粒体染色的染料是
A、 Schiff试剂
B、詹那斯绿B
C、龙胆紫
D、苏丹黑
5、亚细胞组分分离的实验中用到的离心方法有
A、差速离心和速度区带离心
B、差速离心和等密度离心
C、速度区带离心和等密度离心
D、超速离心和速度区带离心
6、超速离心机的转速范围是
A、少于6000转/分
B、高于6000转/分低于25000转/分
C、大于25000转/分
D、以上都不对
7、亚细胞组分分离的实验中所用的密度梯度介质是
A、葡萄糖
B、果糖
C、蔗糖
D、葡聚糖
8、以下关于滴片操作中不正确的是
A、载玻片与桌面有一定的角度(约30度)
B、滴管要垂直，距离玻片有一定的高度(至少50厘米)
C、细胞器悬液的浓度尽量高
D、使用室温的载玻片
9、亚细胞组分分离的实验中细胞器的沉降速度排列正确的是
A、细胞核<线粒体<微粒体
B、线粒体<微粒体<细胞核
C、微粒体<细胞核<线粒体
D、微粒体<线粒体<细胞核
10、在猫脊神经节横切片镀银染色中显示的高尔基体呈
A、圆形，浅黄色
B、圆形，深棕色