奶牛胚胎移植技术 上海交通大学农业与生物学院 朱淑文 一、概述 牛胚胎移植的商业化应用开始于七十年代初期。当时，必须通过手术方法才能采集胚胎，由于奶牛的乳房影响手术的顺利进行，手术后往往还会影响奶牛以后的繁殖性能，因此，胚胎移植主要在肉牛中应用。1976年，一些研究小组报道了应用导管高效采集胚胎的非手术方法。随后，胚胎移植在奶牛中的应用得到了飞速发展。1974年，第一头胚胎移植登记荷斯坦奶牛在美国出生。七十年代后期，胚胎移植（ET）登记荷斯坦奶牛的数量每年以100%以上的速度增长，1980年达到8298头年。进入80年代后，随着非手术采胚法和移植技术的改进以及胚胎冷冻保存技术的发展，每年（ET）登记奶牛的数量在稳步增长，至1990年达到18727头年。截止1991年，美国登记的胚胎移植荷斯坦奶牛总数量已达到142598头。目前，44%的荷斯坦优秀种公牛是由胚胎移植培育的。九十年代以来，胚胎移植在发达国家中的增长速度有所减缓，但是技术含量越来越高，例如体外受精胚胎生产技术、转基因技术以及克隆技术的应用和研究得到加强。近几年来，胚胎移植在亚洲和南美一些国家中增长速度很快。从整个世界范围来看，牛胚胎移植的增长速度仍然很快。 二、胚胎移植技术 （一）体内受精胚的移植 1 超数排卵 在常规胚胎移植技术中，获得大量可用胚胎的主要途径是超数排卵（简称超排），因此，高效率的超排技术是胚胎移植技术能否在生产中推广应用的关键。应用于奶牛的超排激素主要有PMSG（孕马血清促性腺激素）和FSH（促卵胞素）。PMSG尽管只需一次性注射，省时省力，但是半衰期过长，可以导致卵巢的过度刺激以及对排卵、受精和随后的胚胎发育产生不利的影响，因此现在一般已不采用PMSG对奶牛进行超排处理。目前广泛应用于母牛的超排激素是FSH。用于奶牛超排的商品FSH均是从屠宰家畜的脑垂体中提取的，脑垂体不但能够分泌
小鼠早期胚胎发育和胚胎移植 https://www.doczj.com/doc/bd11536495.html,/4544.htm、 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤。下面以小鼠为例，介 绍哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程。 实验技术 一、人工催情和超数排卵 1. 小鼠的性别鉴定： 成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。 2. 人工催情： 成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。每头雌鼠注射PMSG 5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现 （图16.3）。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。在合笼后每天上午8-9 时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。 二、受精卵及囊胚的获得 1. 受精卵的获得： 将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。在腹部中央横剪一小口（0.5cm 宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出（图16.4，16.5），置于盛有培养液的表面皿中。在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（图16.6）。如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
1 1 范围 本标准规定了绵羊的胚胎生产和移植的供体羊的选择和饲养管理、供体羊的超数排卵及人工授精、手术冲卵技术及胚胎质量鉴定、冻胚的解冻、受体羊的选择及饲养管理、胚胎手术移植技术和妊娠受体羊的饲养管理技术。 本标准适用于秦皇岛地区绵羊的胚胎生产和移植。 2 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 DB 1303/T 098-2000 羊的人工授精技术操作规程 3 3 供体羊的选择和饲养管理 3.1 3.1 供体羊的选择 a）a）体羊品种优良、生产性能好； b）b）传性稳定、谱系清楚； c）c）体质健壮。繁殖机能正常，无遗传和传染性疾病。年龄在2岁至7岁为宜； d）d）具有畜牧部门颁发的种畜禽鉴定合格证书。 3.2 3.2 供体羊的饲养管理 3.2.1 3.2.1 保持饲养环境稳定，饲养环境卫生、干燥、棚舍温度适宜。避免应激反应。 3.2.2 3.2.2 制定合理的供体羊日粮配方，保证正常的营养平衡。 3.2.3 3.2.3 满足供体羊清洁饮水的需要。 4 4 供体羊的超数排卵及人工授精 4.1 4.1 超数排卵 4.1.1 4.1.1 超数排卵的季节和发情周期：绵羊最适超数排卵季节为9月下旬至11月上旬。绵羊的发情周期在15d—17.5d。供体母羊在超数排卵前需观察1—2个完整的发情周期。 4.1.2 4.1.2 用于超数排卵的激素选择 FSH—P（垂体促滤泡素） LH—P（垂体促黄体生成素） ICI80996（氯前列烯醇） 4.1.3 4.1.3 激素剂量（注射总量/只） FSH—P剂量（肌注）：120IU—160IU LH—P剂量：根据FSH的注射剂量，肌注100—120IU。 ICI80996：肌注0.08mg/次，注射两次/d。 4.1.4 4.1.4 超数排卵方法 FSH—P 3天注射法 以母羊发情之日作为发情周期的0d，在母羊发情周期的第13d或13.5d（周期大于17.5d的羊在第13.5d）开始，每天早：（6：00—7：00）和晚（18：00—19：00）各注射1次FSH，连续3天，递减注射。 FSH、LH用生理盐水稀释。 在第5、6次注射FSH—P时，同时肌肉注射ICI80996。 确定供体羊发情后立即注射LH。如果FSH—P未注射完供体羊已发情，停止注射FSH—P，立即注射LH。
榆林市苏州中学 年级 高二 学科生物 学期二 编写人：张瑞 审核人： 审批人： 授课教师： 班级： 小组： 姓名： 日期4.23 课时编号17 体内受精和早期胚胎发育 (二) 【学习目标】 ．1.简述哺乳动物的受精过程。 2．简述哺乳动物的胚胎发育过程及其主要特点。 【学习重点】 1.受精过程。 2.早期胚胎发育过程及主要特点 【学习难点】 早期胚胎发育过程及主要特点 受精作用 1．场所： 。 2．过程： （1）准备阶段： ①准备阶段1 精子 ； 精子必须在 发生相应生理反应后，才获得受精能力。 ②准备阶段2 卵子的准备 在（ ）内达到 期时，卵子才具备与精子受精的能力。 （2）受精阶段 ①精子穿越 和 首先发生 反应，是顶体内的 释放出来，直接溶解卵丘细胞间的物质，穿越放射冠。 穿过放射冠的精子立即与 接触， 随后将透明带溶出一条孔道，精子借自身 穿越透明带。 精子触及卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，这个反应叫 做 反应，它是防止多精入卵受精的第一道屏障。 ②精子进入 卵黄膜表面有大量的 ，能抱合精子，随后，精子外膜与卵黄膜融合，精子入卵。精子入卵后，卵黄膜会立即产生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，这种生理反应称 作 作用，这是防止多精入卵受精的第二道屏障。 ③ 形成 a ．雄原核的形成：精子 脱离，并且原有的 破裂，随后，精子形成一个比 原来精子还 的核，叫做雄原核。 b ．雌原核的形成：精子入卵后，卵子被激活，完成 分裂，排出 后， 形成雌原核，雌原核一般略 于雄原核。 ④配子结合 胚胎发育 一、 探究问题 1. 发生受精的部位在哪？描述受精的各个阶段的特征？ 2,受精卵发育的部位在哪里？受精卵形成早期胚胎经历哪些阶段，每一阶段有什么特点？ 二、 课堂检测
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计 所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学 学生姓名 学生学号 指导教师 XXXX年XX月XX日 小鼠早期胚胎发育的研究 一、引言 胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。 动物胚胎的发育过程 虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。 受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界， 卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是
对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。 不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。 原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。例如由内胚层发展而来，具有具有多潜能性的的间叶细胞，可以分化成纤维母细胞、软骨母细胞、硬骨母细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、横纹肌母细胞、造血母细胞等等。 器官形成:外胚层、中胚层与内胚层形成各种组织和器官的过程，称为器官形成，也称做器官发生。以青蛙的胚胎为例，在器官形成的早期，外胚层会在突起之后向内凹陷，形成神经脊与神经管;中胚层则会形成中胚叶节(somite)与脊椎，中胚叶节包围的空间称为体腔。 小鼠应用于生命科学研究中已有上百年的历史，成为研究人类遗传疾病的最佳动物模型。它是最小的哺乳动物之一，体形小，易于饲养管理;繁殖和发育速度都特别快;性情温顺，胆小怕惊;对外来刺激极为敏感;便于提供同胎和不同品系动物;成雌鼠在动情周期不同级段，阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期性变化，且市场价格较低，。虽然小鼠和人类在体型大小和形态上相差很大，但在生物进化上非常接近。所以以小鼠作为研究人类遗传疾病的材料最为合适。
《动物遗传育种与繁殖专论》 课程作业 胚胎移植技术在畜牧业中的应用 姓名： 学号：
胚胎移植技术在畜牧业中的应用 畜牧业发展水平占农业的比重是衡量一个国家和地区现代化水平的重要标志，近年来，畜牧业已成为我国农业发展的重心．胚胎移植技术也称受精卵移植技术，就是将良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到同种的生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体，所以该项技术又被称为“借腹怀胎”。胚胎工程技术是胚胎移植技术发展到一定程度而出现的名词, 是由发育工程演变而来的。由于胚胎移植技术可最大限度的发挥优秀母畜在品种改良和育种中的作用，同时它又是体外受精、转基因、体细胞核移植等胚胎工程的基础性环节，因此，胚胎移植技术被誉为家畜繁殖技术的第二次革命。 胚胎工程技术根据其发展现状包括以下9类:胚胎移植技术;胚胎冷冻保存技术;胚胎分割技术;试管动物技术(体外受精技术);性别控制技术,即XY精子分离和胚胎性别鉴定技术;转基因动物技术;动物克隆技术(细胞核移植技术);胚胎干细胞技术;胚胎嵌合技术。目前, 前5种技术已在生产实践中得到不同程度的应用,但应用较多的是前2种技术, 其他几种技术由于设备投入成本较大、成功率较低, 尚处于实验室向生产转化阶段。 胚胎移植技术可使引进的种畜在较短时间内快速纯种繁殖，成为大群体，满足牛羊业迅猛发展的需要。同时，牛、羊业的快速发展和这种市场化发展的需求，使胚胎移植技术受到更多研究者和生产者的
高度重视，进而促进了胚胎移植技术快速发展和商业化。20世纪90年代后期，胚胎移植技术在畜牧生产中得到应用推广，同时胚胎移植技术又解决了畜牧业发展中的一些难点问题。 胚胎移植技术是继人工授精之后发展起来的繁殖高新技术, 目前已成为扩大优秀家畜遗传资源的主要手段, 有的称作MOET技术( 超数排卵与胚胎移植技术)。作为家畜育种的重要手段之一, 自20 世纪50年代初第一头胚胎移植牛在美国诞生以来, 胚胎移植技术飞速发展。据不完全统计, 全世界目前年产胚胎移植牛超过35万头, 美国、法国等发达国家每年参加后裔测定的青年公牛的80%来自胚胎移植所产的后代。20世纪80年代后期, 我国在生产中开始应用牛、羊胚胎移植技术, 近几年该技术在全国得到迅速发展。本实验室1990年奶牛新鲜胚移植妊娠率达62.2%, 达76%。在6省区规模化生产中, 绵羊和山羊的移植妊娠率在60%左右, 达76.8%。根据国际胚胎协会的统计, 20多年来,进行胚胎移植的动物数量和种类每年都在增加, 胚胎移植已经成为畜牧业中最活跃的产业。 胚胎移植技术在畜牧业发展中的作用主要体现在促进家畜的遗传改良，充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率．优良后代的增加，既取决于种公畜，也有赖于优良母畜。尤其是生产性能取决于父母双方，如果说人工授精技术的出现使公畜的繁殖潜力得到最大限度地发挥的话，那么胚移技术的出现可以使母畜的繁殖潜力得以充分发挥，从而有效促进家畜的遗传改良。更为重要的是，如果超数排卵时利用优良公畜冻精配种优良母畜(供体)，然后利用采出的胚胎进行
肉牛胚胎移植技术 胚胎移植又称受精卵移植，是将l头良种母畜(供体)配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种的生理状态相同的母畜(受体)的子宫内，使之继续发育成为个体，所以也叫人工授胎或“借腹怀胎”。 (一)胚胎移植的意义 1．充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率由于牛的胚胎移植可以利用非手术法反复从一头供体中收集胚胎，所以繁殖率得以更加提高。据报道国外已能做到从一头供体牛一年获得40～50头犊牛。 2．加速品种改良，扩大良种畜群利用超数排卵、胚胎移植技术能使母畜排出较多卵子，山东永丰牧业同时解除其妊娠胚胎的职能，这样一头良种母牛就可产生多量的后代。使一头优良母畜在育种工作中的意义大为提高。 3．诱发肉牛怀双胎，提高生产效率在肉牛业中，有一种由胚胎移植技术演化出来的所谓“诱发双胎”的方法，即向已配种的母畜(排卵的对侧子宫角)移植一个胚胎，这样配种后未受胎的母畜可能因接受移植的胚胎而妊娠，而已受精的母畜由于增加了一个外来胚胎而可能怀双胎o 4．代替种畜的引进，保存品种资源通过胚胎的运输代替以往的种牛进出Vl山东永丰牧业，大大节约了购买和运输种牛的费用。同时可用保存胚胎的方式解决牛品种资源保存的问题。 (二)胚胎移植的操作原则 1．胚胎移植前后所处环境的一致性即胚胎移植后的生活环境和胚胎的发育阶段相适应山东永丰牧业。包括生理上的一致性(即供体和受体在发情时问上的一致性)和解剖位上的一致性(即移植后的胚胎与移植前所处的空问环境的相似性)以及种属一致性(即供体与受体应属同一物种，https://www.doczj.com/doc/bd11536495.html,但并不排除种间移植成功的可能性)。 2．胚胎收集期限胚胎收集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日进行移植。通常是在供体发情配种后3～8日内收集和移植胚胎。 3．在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素(物理的、化学的、微生物的)的影响而危及生命力。移植的胚胎必须经鉴定并认为是发育正常者。 (三)胚胎移植技术的基本程序胚胎移植的基本程序包括：供授体母牛的同期发情、供体母牛的超数排卵、供体母牛的配种、胚胎的收集、山东永丰牧业胚胎的检查、胚胎的保存和移植等程序。如图3—4所示。关于超排和同期发情处理在前面已有叙述，下面仅介绍其余部分。 1．供体母牛的配种经超数排卵的供体母牛，为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2～3次，每次间隔8～12 h。 2．胚胎的收集 从供体母牛收集胚胎的方法，可采用手术法和非手术法两种。手术法是按外科剖腹术的要求进行山东永丰牧业，手术部位在右肋部或腹下乳房至脐部之问的白线切开。 https://www.doczj.com/doc/bd11536495.html,伸进手指找到输卵管和子宫角，引出供。母体十畜同期发情处理受体母畜 辛辛辛辛
江丙农业学报2010，22(12)：144～146 A c t a A g r i c uhu r ae J i an gxi 小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究 林峰，陈玉霞+，孙克宁，杨婷，田晓军 (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002) 摘要：为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响，分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明：子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0．01)，而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P< O．05)，两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P>0．05)，说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著，且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明：超排处理后，在公母鼠合笼后76～79．5h采胚，胚胎大多处于桑椹胚期，而在公母鼠合笼后88～91．5h采胚，胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期；采用TC M l99+15％胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。 关键词：小鼠；超数排卵；早期胚胎；体外培养；冲胚方法 中图分类号：Q132．8文献标识码：A文章编号：1001—8581(2010)12—0144—03 St udy on E f f ect of Super ovul a t i on and i n vi t r o C ul t ur e of Ear l y Em br yo i n M ous e LI N Fe n g，C H E N Y u—xi a‘，SU N K e—ni ng，Y A N G Ti ng．T I A N X i ao—j u“ (C ol l ege of A n i m a l H us ba ndr y a nd V et er i nar y M e di ci ne，H enan A矛c ul t ur al U ni ver si t y．Z he ngzhou450002，C hi na) A bs t r act：I n t hi s paper．t he e ffe c t of dif f erent m e t h ods of c o l l ec t i n g e m br yos on t he s uper ovul at i on of m i c e w a s s t udi ed，and t he e m br yos i n t he suoer ovul at ed m i Ce w er e coll ected by usi ng t he ut erus—m i nc i ng m e t ho d a nd ut er us—col l ect i ng m e t hod re s pec t i ve l y．ne r es ult s show e d t ha t t he aver age num ber of eggs and em bryos obt ai ned by t he ut er us—co l l ect i ng m e t ho d w er e,ext r em el y s ignif i ca ntl y hi gher(P<0．01)t han t hos e obt ai ned by t he ut e r us—m i nci ng m e t hod，an d t he aver age nu m ber of us abl e em bryos obt ai ned by t he u t e r r us—coll ect i ng m e t he d w强si gni f i cant l y hi gher(P<0．05)t han t ha t di d by t he ut erus—m i nc i ng m et hod．ne aver age num be r of an-fe r t i l i zed eggs obt ai ned by t hes e t w o m e t h ods w a s no t s ignif i cant ly di f f er e nt(P>O．05)．So t he s uper ovu l at i on e ffe c t of m i c e W a S s i g-nif i e ant lv i nnue nee d by t he m e t ho d of coll ect ing em bryos．T he obs er vat i on r es ult s of ear l y e m br yos de vel opm ent i ndi cat ed t hat m ost of t he em bryos coll ected76—79．5hour s aft er com bi ni ng cages w e r e at m or ul a s t age．w hi l e m os t of t}l e em bryos coll ected88～91．5 hour s a ft e r com bi ni ng cages w e r e a t com pa ct e d m or u l a s t a ge and bla s t o e yst s t ag e．I t W a S f eas i ble t ha t t he em bryos of m i c e w er e cul t i—vat ed i n vi t ro by usi n g t he m i xed s o l ut i o n of T C M l99and15％F C S． K e y w or ds：M ouse；Sup er ov ul at i on；E ar l y em br yo；I n vi t ro cul t ur e；M e t hod of coll ect ing em bryos 雌性哺乳动物一生所产的卵子总数早在其胚胎发育形成卵巢的过程中已被确定，成熟卵子在成年后的发情周期中分别排出，但是单纯依靠动物的自然排卵，一方面所得到的卵母细胞数或胚胎数较少，另一方面又消耗大量的时间和浪费较多的动物．因此为了获取大最的胚胎，多采用超数排卵的方法，即利用外源性促性腺激素诱发多个卵泡同时发育并排出具有正常受精能力的卵子¨。1。该技术大幅度地开发利用了卵巢上的卵母细胞资源，为胚胎工程和转基因动物等相关领域的研究提供了大量的研究素材。小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强等特点，是畜牧兽医科学研究领域应用最为广泛的实验动物，研究小鼠超数排卵对动物胚胎工程等研究具有重要意义。 近年来，随着遗传工程小鼠的大量开发，人们对小鼠卵母细胞和胚胎的需求量日趋增多，因而完善的超数排卵技术是遗传工程小鼠研究获得成功的重要前提条件。到目前为止，能够获得大量胚胎来源的技术仍为超数排卵。超数排卵反应是一个极其复杂的生理过程。研究资料表明，小鼠超排效果受激素的种类、剂鼍以及动物的生理状态等多种因素影响，这些因素错综复杂，使超数排卵效果很不稳定H—o。为了进一步研究冲胚方法对超数排卵的影响及小鼠冲胚的有效方法，本试验在控制以上因素一致的条件下，采用两种不同的冲胚方法来进行对比，以期为今后的小鼠超数排卵研究提供一定的参考依据，为胚胎生物技术研究提供借鉴。 l材料与方法 1．1试验地点和时间本试验于2009年l O月16日至2010年5月27日在河南农业大学牧医工程学院胚胎生物技术研究室进行。 1．2试验动物 1．2．1试验动物的条件试验用昆明小白鼠购于河南省实验动物中心。雌性小鼠(未经产)为17周龄、体重30 收稿日期：2010一 基金项目：河南省重点科技攻关计划项目(82102130005)；河南省蕈大科技攻关计划项目(0422011200)。 作者简介：林峰(1972一)。男．山东栖霞人．副教授，博士，主要从事动物胚胎生物技术研究。通讯作者：陈玉霞。
小鼠胚胎培养方法的研究 摘要 目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。 方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵
山西医科大掌 裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。 结果： 一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。两组比较有显著性差异。２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。与对照组比较有差显著性异。３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。与对照组无显著性差异。 二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。 三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组
小鼠1-细胞胚胎体外培养条件的研究* 【摘要】目的检验培养基(Whitten、CZB、SOM和KSOM)、培养器皿(进口、国产新旧平皿)与配制培养基的水质对小鼠胚胎体外发育的影响。方法采用微滴培养法培养昆明种小白鼠1-细胞胚胎，以胚胎发育到囊胚的比例为判断培养效果的标准。结果Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中2-细胞发育率分别为100%、100%、100%和98.6%，而囊胚发育率却分别为0%、78.3%、4.8%和9.5%；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基，培养囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和52.4%；国产和进口新平皿的囊胚发育率分别为68.0%和72.2%；国产和进口旧平皿的培养囊胚发育率为27.2%和4 6.1%。结论昆明小白鼠早期胚胎存在体外发育阻断现象；CZB培养基培养昆明小白鼠早期胚胎效果最好；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB 培养基培养结果无显著差别；进口和国产新平皿的培养效果相近，但再次使用时培养效果显著下降。 【关键词】1-细胞胚胎培养系统小鼠 STUDIES ON THE CONDITIONS FOR THE CULTURE OF ONE-CELL MOUSE EMBRYOS Liu Zhonghua, Tan Jinghe△, He Guixin (Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin) 【Abstract】Objective To study the effects of culture media, types of culture dish and types of water used for preparation of media on the in vitr o development of one-cell embryos in the mice of Kunming breed. Metho d One-cell mous e embryos collected from the oviduct o f the superovulated mice were cultured in microdrops of medium and the percentage of embryos developed to blastocyst stage was used as evaluation criteria. Results (1)Wh en one-cell mouse embryos were cultured in the Whitten's, CZB, SOM and KSOM media, the cleavage percentages were 100%,100%,100% and 98.6%, respectively, and the blastocyst percentages were 0%, 78.3%, 4.8% and 9. 5%, respectively. (2)The blastocyst percentages obtained from the CZB medi a prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water wer e 40.8%, 54.1% and 52.4%, respectively. (3)The blastocyst percentages prod uced from the Chinese-made and the imported culture dishes were 68.0% an d 72.2%, respectively, but those obtained when the dishes were used for the second time were decreased significantly (bein g only 27.2% and 46.1%, res pectively). Conclusions There existed a development block during the in vitro development of the mouse embryos of the Kunming breed. Among the me dia tested CZB was the best in supporting the development of one-cell mou se embryos to blastocyst stage. No significant difference was found among t he CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deioni zed water in blastocyst percentages. Bot h the Chinese-made and the importe
羊的胚胎移植 一、胚胎移植概述 二、胚胎移植原理 三、胚胎移植技术程序 一、胚胎移植概述 1.胚胎移植的发展历史 2.胚胎生物技术的研究意义及其在畜牧生产中的应用 3.胚胎移植目前存在的问题 4.影响胚胎移植的主要因素 5.胚胎移植的经济效益 6.胚胎移植的发展前景 1.1国外胚胎移植发展史 George是世界上第一个提出动物胚胎移植的人。1890年4月，Walter Heape用兔作为实验动物，成功地获得了世界上第一个动物胚胎移植后代。Heape兔胚胎移植的成功，极大的影响着繁殖生物学和畜牧业的发展。1900年，Heape的杰出接班人FHA Marshall和John Hammond总结了他的主要工作内容，提出了哺乳动物性季节的概念，也就是现在所说的发情周期。1911-1913年，奥地利维也纳的Biedl 等进行了兔的胚胎移植实验，但由于战争，直到1922年才报道了其研究结果。虽然他们做了70多个实验，但由于把输卵管的胚胎移植到子宫，结果只有一只受体兔妊娠，这充分证明了胚胎和受体的同步性是非常重要的。1932年和1933年，Warwick,Berry和Horlache第
一次把胚胎移植技术用在绵羊和山羊上，Dr. Berry也因此成为了第一个国际胚胎移植协会先驱奖的获得者。1948年，张明觉用超数排卵技术从2只母兔获得88枚受精卵，给7只受体母兔移植，成功地产出76只小兔，这次试验的成功具有划时代的意义。1950年12月19日，33岁的美国人Elwyn Willed成功地获得了世界上第一头胚胎移植牛犊。60年代初，全部采用的是手术回收胚胎和移植，1964年Mutter 等和1965年Sugie相继报道了非手术移植胚胎获得成功。70年代中期，牛的非手术移植完全取代了手术移植. 1974年，成立了国际胚胎移植协会(IETS )，随后相继成立了美国胚胎移植协会、加拿大胚胎移植协会、欧洲胚胎移植协会 1.2 国内胚胎移植发展史 我国的胚胎移植研究起步较晚，于20世纪70年代初才开始。1973年首先在家兔上获得成功。1974年，中科院遗传所在绵羊胚胎移植上取得成功。1976年郭志勤、谭丽玲等在家兔胚胎和绵羊胚胎低温(100C)保持1天和10天后移植成功。手术法和非手术法牛胚胎移植在1978年和1980年也相继成功。1980年中国农业科学院畜牧所在绵羊胚胎超低温保存后移植产羔。20世纪80年代，胚胎移植进入了实验阶段，掀起了全国的研究高潮，20几个省近30个单位相继开展了胚胎移植研究工作。20世纪90年代初期，我国的胚胎移植工作逐渐进入了生产应用初始阶段。生产应用比较好的地区主要是内蒙古、新疆和黑龙江、北京 1.3 羊的胚胎移植发展历史
一次性使用胚胎移植导管 适用范围：与注射器配合，经阴道向子宫内转移经过体外受精(IVF)的胚胎或受精卵用。 1.1 产品型号 表1一次性使用胚胎移植导管尺寸及公差
1.2 划分说明 XXXXX –d –L XXXXX：表示胚胎移植导管（PTYZ/PTYZ1） d：一次性使用胚胎移植导管外径（F）（1F=0.333mm） L：一次性使用胚胎移植导管长度（cm） 1.3 结构组成 一次性使用胚胎移植导管结构如图1所示。PTYZ型由引导导管、移植管和可塑型的不锈钢内芯组成；PTYZ1型由引导导管、移植管和标记环组成。 引导导管管材：PTYZ-d-L为：医用聚氨酯，针座为ABS；PTYZ1-d-L为：聚醚-聚酰胺共聚物，针座为ABS，标记环：为医用硅胶。 移植管：由304不锈钢管、聚氨酯管和ABS针座组成。 可塑型的不锈钢内芯：由304不锈钢丝和ABS手柄组成。 针座和导管的连接为机械螺旋拧压方法。 PTYZ-3-23/ PTYZ-5-23
PTYZ1-3-23/ PTYZ1-5-23 图1一次性使用胚胎移植导管示意图 2.1 尺寸 一次性使用胚胎移植导管尺寸及公差应符合表1的规定。 2.2 外观 外表面应清洁无杂质，不应有加工缺陷和表面缺陷，末端圆滑、无毛刺。 2.3 物理性能 2.3.1 断裂力 管材的断裂力：直径＜1.15mm的管材最小断裂力为5N，≥1.15mm ~ ＜1.85mm 的管材最小断裂力为10N，≥1.85mm管材最小断裂力为15N。 2.3.2 标记线应清晰可见。 2.3.3 接头 2.3.3.1 移植管的管座头端与引导导管的接头应相匹配，连接后无明显摆动。 2.3.3.2 移植管的接头应符合GB/T 1962.2-2001的要求。 2.3.4 无泄漏 移植管的针座和导管连接部分应无泄漏现象。 2.3.5 耐腐蚀性：一次性使用胚胎移植导管中的不锈钢管和不锈钢内芯不应有腐蚀痕迹。 2.4 化学性能：（除金属部件外）
动物胚胎移植技术
摘要 胚胎移植又称受精卵移植，是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或是子宫内，使之继续发育成新个体的技术。 动物胚胎移植主要是通过对优良供体母畜作同期排卵处理和体内胚胎生产或体外人工授精（IVF）的方法，以大量获得优良的动物胚胎后再将其移植给普通代孕受体母牛进行快速繁殖优良动物的生物技术。胚胎移植技术主要用于快速扩大优秀种公牛和核心母牛的数量。尽管单个胚胎的生产成本较高，但由于种公牛和种母牛较高的经济价值和社会价值，以及利用胚胎移植在育种方面可以获得同胞或同卵双生牛进行后裔测定等优势，因此，该技术在种公牛的选育和优质核心母牛群的培育以及加快育种步伐方面均具有极大的优越性。 本论文将对动物胚胎技术作比较全面的阐述，使大家对动物胚胎技术有一个比较全面的认识。 关键词：供受体超数排卵同期发情胚胎回收胚胎检查胚胎移植
1.1 发情后生殖器官的孕向发育 家畜在发情后生殖器官会发生一系列变化，如：卵巢中功能性黄体的形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的增强，以及其他生理生化的特异现象。这些变化都为胚胎的生存和发育创造了适宜的条件，为妊娠作准备。 配种受孕后的动物其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要，如黄体的持续存在以及孕酮的分泌和维持，子宫内膜的继续发育。而未受孕的动物其生殖系统会退回到发情前状态。 发情供体和受体发情周期的同期化程度前后不超过一天，否则移植成功率就会降低，甚至移植失败 因此发情后或交配刺激后雌性动物生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植的主要生理学基础。 1.2 早期胚胎的游离状态 胚胎在发育的早期有相当一段时间是游离存在于子宫内的，和子宫黏膜没有建立紧密联系，其发育主要靠自身贮存的养分。这样，早期的胚胎容易从生殖道中取出，而且在离体情况下，可短期培养，易存活。 早期胚胎处于游离状态是能够进行胚胎移植技术的基础 1.3 子宫对早期胚胎的免疫耐受性 1.4 胚胎遗传物质的稳定性 在同一物种之内进行胚胎移植不会产生排斥现象;同时，受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新个体的遗传特性，也不会减弱起优良性状在出生后的表现程度。