中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第1期 2010–01–01出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 1, 2010 Vol.14, No.1
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
531
Department of Spinal
Surgery, Hospital Affiliated to Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 2
Dongming County Hospital of Chinese Medicine, Heze 274500, Shandong Province, China
Li Quan-xiu ★,
Studying for master’s degree, Attending physician,
Department of Spinal Surgery, Hospital Affiliated to Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China sdspine@https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html,
Correspondence to: Chen Bo-hua, Doctor, Professor,
Department of Spinal Surgery, Hospital Affiliated to Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Received: 2009-08-28 Accepted: 2009-12-05
新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化★
李全修1，陈伯华1，蔡月艳2
Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells-induced nucleus pulposus cells under new-style layer coculture
Li Quan-xiu 1, Chen Bo-hua 1, Cai Yue-yan 2
Abstract
Li QX, Chen BH, Cai YY.Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells-induced nucleus pulposus cells under new-style layer coculture.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(1): 53-56. [https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html, https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html,]
摘要
李全修，陈伯华，蔡月艳.新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(1):53-56. [https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html, https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html,]
李全修，等.新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/bd15046460.html,
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1
青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市266003；2山东省东明县中医院，山东省菏泽市274500
李全修★，男，1971年生，山东省菏泽市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主治医师，主要从事脊柱外科方面的研究。
sdspine@sina. com
通讯作者：陈伯华，博士，教授，青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东省青岛市266003
中图分类号:R394.2 文献标识码:A
文章编号:1673-8225 (2010)01-00053-04
收稿日期：2009-08-28
修回日期：2009-12-05(20090828009/ ZS ·Q)
0 引言
腰背痛在正常人群中占有相当高的比例[1]
，大多数是由椎间盘退变引起，目前治疗都存在一定的局限性，疗效不甚满意，不能从根本上治疗椎间盘退变[2]
。随着组织工程学的发展，应用髓核细胞和骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退变得到快速发展[3-4]，但自体髓核细胞较难获得，异体髓核细胞又存在伦理问题，骨髓间充质干细胞疗效未完全得到证实，抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法。
实验采用新式分层培养法，建立骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞分化的体外培养模型，观察在接触情况下骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响。
1 材料和方法
设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2008-08/2009-06在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。
材料：人椎间盘髓核组织来源于16岁先天性脊柱侧弯患者T 12 L 1、L 1-2椎间盘髓核组织，根据国务院《医疗机构管理条例》规定[13]
，患
者家属知情同意。第3代人骨髓间充质干细胞株
由广州赛业生物科技有限公司提供。
实验用主要试剂与仪器：
实验方法：
人髓核细胞的分离培养：取人椎间盘髓核组织，
胰酶、胶原酶消化法消化组织，镜下计数，将细胞接种于25 cm 2
培养瓶中，加入含100 mg/L 青霉素、250 mg/L 链霉素和体积分数为10%胎牛
血清的LG-DMEM ，置于37 ℃、体积分数为5%的CO 2细胞培养箱内，5 d 后首次换液，以后每两三天换液1次，第2代髓核细胞90%贴壁后制作成细胞悬液备用。
人骨髓间充质干细胞的复苏与培养：液氮中取
骨髓间充质干细胞冻存管，迅速将冻存管投入已预热至37 ℃的水浴锅中并不断摇动，1.0~2.0 min 后冻存管内液体完全溶解，将冻存液移入离心管冲洗离心，制作细胞悬液，并移入培养瓶放入培养箱，24 h 更换培养液，以后每两三天换液1次，显微镜观察细胞约90%贴壁后按1∶3传代。
新式分层培养与传统分层培养：取传至第4代
的骨髓间充质干细胞制作细胞悬液，按1.2×107 L -1接种于6孔培养板底，24 h 显微镜观察细胞贴壁后吸去培养液，分为2组：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell 小室，膜孔0.4 μm ，其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1；传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell 小室。同时设立单独髓核细胞培养组作为对照，单独将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell 小室内。各组均培养7 d 。
Ⅱ型胶原的表达免疫组化法检测：随机取各组
培养细胞各6孔，吸除孔内培养基，刮去新式分层培养组小室底外侧壁的骨髓间充质干细胞，40 g/L 多聚甲醛固定髓核细胞10 min ，PBS 冲洗3次，3~5 min/次；0.2% Triton X-100于室温下透化5 min 后，PBS 冲洗3次，3~5 min/次；于室温下封闭液阻断60 min 后，PBS 冲洗3次，3~5 min/次；滴加鼠抗人Ⅱ型胶原一抗，37 ℃下放置1 h 后，PBS 冲洗3次，3~5 min/次；滴加HRP 标记的兔抗鼠IgG 二抗，37 ℃下放置30 min 后，PBS 冲洗3次，3~5 min/次。DAB 显色试剂盒显色15 min 后封固，200倍光镜下随机取5个视野，对阳性细胞进行计数，对所得数据进行统计处理。
蛋白多糖的合成35S 放射标记渗入放免定量检测：取各组剩余孔细胞，吸除孔内培养基，PBS
冲洗，每孔加入含35S-sulfate 的无血清DMEM 溶液1.5 mL ，于培养箱内继续培养48 h 。取出培养板，置入-20 ℃冰箱，冻结，终止蛋白多糖的合成及35S 的整合。解冻后将小室内培养液和细胞移入透析袋内，透析至液体澄清，置入67 ℃烤箱内24 h 完全干燥，将透析袋置入闪烁杯，加入闪烁液，液体闪烁计数器测定每分钟的脉冲数。
试剂与仪器
来源 LG-DMEM 、胰酶 Ⅱ型胶原酶 胎牛血清
小鼠抗人Ⅱ型胶原单 克隆抗体
35
S-sulfate 同位素标记试剂 倒置相差显微镜
CO 2培养箱
β射线液体闪烁计数器
Transwell 小室 Gibco Sigma 杭州四季青 Chemicon
Amersham Nikon HERAUS
瑞典LKB-1209 rackbeta corning
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主要观察指标：①髓核细胞形态观察。②免疫组化法检测Ⅱ型胶原的表达。③35S 放射标记渗入放免定量法检测蛋白多糖的合成。
设计、实施、评估者：设计和结果评估为第一、二作者，实施为第一、三作者，均接受过相关专业的培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一、三作者采用SPSS 10.0软件进行统计处理，数据以x _
±s 表示，采用SNK-q 检验法进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果
2.1 髓核细胞大体形态学观察 新式分层培养组髓核细胞6 h 开始贴壁，传统分层培养组、单独髓核细胞培养组的髓核细胞均在
12 h 左右开始贴壁。
培养
7 d
后，
传
统分层培养组的髓核细胞密集程度强于单独髓核细胞培养组；新式分层培养组的髓核细胞较另2组相对密集，
细胞伸出伪足相互接触，见图1。
2.2 Ⅱ型胶原免疫组化染色结果 Ⅱ型胶原免疫组化染色后，阳性细胞的胞浆呈棕黄色，无着色者为阴性。
镜下计数结果显示，单独髓核细胞培养组、传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数分别为(12.37±2.12)，(27.00±2.39)，(44.67±2.61)个。与单独髓核细胞培养组比较，传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数均明显增加(P < 0.05，P < 0.01)，且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05)。
2.3 蛋白多糖的合成 35S 放射标记渗入放免定量法检测结果显示，单独髓核细胞培养组、传统分层培养组、新式分层培养组的蛋白多糖每分钟脉冲数分别为55.12±9.24，158.45±11.35，270.17±1
3.16。与单独髓核细胞培养组比较，传统分层培养组、新式分层培养组蛋白多糖的合成均明显增加(P < 0.05，P < 0.01)，且新式分层培养组蛋白多糖合成量大于传统分层培养组(P < 0.05)。
3 讨论
椎间盘退变是18岁后随着年龄的增加而出现的椎间盘退行性改变[5]，是多种原因引起的椎间盘成分、结构和功能逐渐改变的慢性过程，进而导致椎管狭窄、神经根病变、椎间盘突出和腰椎不稳等病理改变[6-7]，以致出现颈肩腰腿痛和下肢放射痛。椎间盘退变首先是髓核细胞的退行性改变，表现为髓核细胞和细胞外基质Ⅰ、Ⅲ胶原的增加，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原等物质的减少，以及髓核细胞数的逐渐减少且被成纤维细胞替代，进而导致含水量的降低，椎间盘功能丧失[8-10]。于是椎间盘退变的细胞治疗也主要集中在植入新细胞替代退变的髓核细胞或修复原有髓核细胞的功能。
骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等[11-13]。骨髓间充质干细胞与支架复合或单纯植入兔椎间盘内，骨髓间充质干细胞还可向髓核细胞方向转化，从而延缓了椎间盘退变[14-18]。但骨髓间充质干细胞与支架复合植入兔椎间盘内，难以说明是何种成分在延缓椎间盘退变中发挥作用；采用兔为实验对象，其椎间盘内髓核细胞含量较人的丰富得多，且在成年兔椎间盘内一直有脊索细胞存在，脊索细胞可以明显促进移植细胞再生和基质合成储存[19]。可见这些实验结果对治疗人椎间盘退变参考价值不大。
髓核细胞为类软骨细胞，而软骨细胞表型的改变有赖于支架材料的选择、机械性刺激、加入生长因子等细胞外环境的变化[20-24]。生长因子和骨髓间充质干细胞可促进体外培养椎间盘器官内细胞的增殖分化[25]，骨髓间充质干细胞还可为髓核细胞营造一个适宜的外环境，通过营养髓核细胞，使软骨基因发生改变并维持其分化增殖[26]。Yamamoto 等[15，27]将骨髓间充质干细胞和髓核细胞体外混合共培养，可明显促进髓核细胞增值和蛋白聚糖等合成，但混合培养存在细胞分选的困难，很难将两种细胞完全分离开，给检测结果带来误差。方中等[28]将骨髓间充质干细胞和髓核细胞传统分层共培养，证明骨髓间充质干细胞也能促进髓核细胞增殖分化。
实验采用新式分层培养法，不仅为髓核细胞和骨髓间充质干细胞营造接触共培养环境，且有易于实验结果
a: Single culture
b: Conventionally laminar culture
c: New-style culture Figure 1 Morphology of
three groups of nucleus pulposus cells at day 7 (×200)
图1 培养7 d 后各组髓核细胞形态特点(×200)
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分析。显微镜观察见新式分层培养组髓核细胞较传统分层培养和单独髓核细胞培养组细胞贴壁时间早，增殖快，聚集生长，形成较多的细胞连接，这可能与骨髓间充质干细胞能较早的黏附于小室外底建立细胞连接有关[29]。免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原，35S 放射标记渗入放免定量法检测蛋白聚糖的表达，结果显示新式分层培养组Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达较单独髓核细胞培养组显著增高(P < 0.01)，新式分层培养组较传统分层培养组和传统分层培养组较单独髓核细胞培养组也有所增高(P < 0.05)。可见在非接触条件下，骨髓间充质干细胞虽能促进髓核细胞的增殖分化及特征性物质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，但在接触条件其作用更明显。在接触情况下，细胞之间可能通过连接建立信号传导途径，细胞间信号相互传导，明显增加了某细胞因子等的合成，这些因子不仅可维持髓核细胞表型，还可明显促进髓核细胞的分化增值；细胞之间相互接触，还可能通过细胞间的电传导刺激，促进细胞的分化增殖。但在细胞非接触情况下，细胞之间不能形成信号传导和电传导刺激，骨髓间充质干细胞只能分泌少量的细胞因子作用于髓核细胞，故其对髓核细胞的作用不如在接触条件下显著。
实验选用未退变的髓核细胞为观察对象，骨髓间充质干细胞明显促进其增殖分化，若骨髓间充质干细胞与退变的髓核细胞共生存，是否能促进退变髓核细胞的增殖分化，还有待于进一步分析。
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bone-marrow-derived mesenchymal stem cell on collagen electrospun fibers.Biomed Mater.2009;4(3):35006.
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成 免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。因此在一定意义 上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。 第一节 造血干细胞的特性和分化 一、造血干细胞的起源和表面标记 （一）造血干细胞的起源 哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以 及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺 是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。 早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell）， 具有自我更新（self?renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予 机体在整个生命过程中始终保持造血能力。多能造血干细胞最初分化为共同淋巴 样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。 （二）造血干细胞的表面标记 白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。 （1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达 CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单 克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。随着造血干细胞的分 化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。 （2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原 癌基因c?kit的编码产物Kit。CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70% CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。 （3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细 胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免
造血干细胞移植的护理常规 1、移植前的护理 1.1、供者准备选用HLA相合的同细胞作为最适合供者，移植前两周对供者进行循环采血。 1.2、无菌层流室的准备：室内一切物品需经清洁、消毒、灭菌处理，室内不同空间采样，行空气细菌检测合格后病人方可进入。 1.3、病人准备： 1.3.1、心理护理：对病人及家属详细讲解骨髓移植的方法，过程和相关知识，使其有充分的思想准备和经济准备，鼓励病人建立战胜疾病的信心。 1.3.2、进行全面的身体检查。 1.3.3、无菌护理：进行口、眼、耳、肠道的无菌准备，行药浴，更换无菌衣裤后进入无菌室。 1.3.4移植前一天行中心静脉插管。 1.3.5预处理：是指全身射线照射和使用免疫抑制剂。其目的是杀灭受者的免疫活性细胞，使之失去排斥外来细胞的能力，从而允许供者的骨髓植入而使造血功能重建，同时还可消灭体内的异常细胞起到一定的治疗作用。执行预处理方案时需密切观察病情变化，鼓励病人多饮水，每天入水量4000ml以上，防止尿酸性肾病的发生。 2、术中护理 2.1、正确采集骨髓或外周造血干细胞，并保证足够的细胞数。 2.2、骨髓液回输：在无菌层流室6小时输完，每袋骨髓液至最后5ml时应留在袋中弃去，以防脂肪颗粒进入血液循环引起肺栓塞，外周血干细胞不需要过滤。 2.3、病情观察：监测生命体征的变化，并注意观察病人有无胸闷，气促等情况，配合医生做好相应处理。 3、移植后护理 3.1、心理护理：护士应多与病人交谈，调节病人情绪，传递家属信息，以解除病人的恐惧心理和孤独感，充分调节病人的积极性。 3.2、并发症护理： 3.2.1、感染；是最常见的并发症，对骨髓移植病人必须实行全环境保护：a严格执行无菌环境的清洁及消毒隔离制度b严格落实病人的各项无菌护理c 加强扩胸运动，防止肺部感染ｄ严密观察生命体征及病情变化。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
骨髓间充质干细胞的主要表面标志 1 骨髓间充质干细胞的发现和来源 骨髓组织中有多种细胞成分，除基质细胞等已经分化的细胞外，还含有两类多潜能干细胞：造血干细胞和间充质干细胞。1987 年Friedenstein 等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下可分化为多种类型的细胞，而且经过20－30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞, 故称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs),或间质祖细胞(MPCs)，是成人多能干细胞的一类。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)，或骨髓基质成纤维细胞(Marrow stromal fibroblast，MSF)。Friedenstein AJ , Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow o steogenic stem cells: in vit ro cult ivat ion and t ransp lantat ion in diffusion chambers. Cell T issue Kinet, 1987, 20 (3) : 263-267] 2 鉴于其强大的增殖能力及多向分化潜能，可在体外长期培养和遗传背景较稳定，而且用自体干细胞诱导构建的组织不涉及伦理问题，也不存在MHC限制，所以骨髓间充质干细胞日益受到重视。但是与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs的数量非常少，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少。因此，如何简便有效地从骨髓中获取高纯度的MSCs显得尤为重要，寻找高度特异性的MSCs的表面抗原也就成为MSCs研究中的一项重要任务和目标。 不仅如此，一种同样来源于骨髓、贴壁生长、被认为更原始（可以分化为MSCs）也具有更强增殖能力的干细胞也被鉴定，它就是多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell (MAPC) or mesodermal progenitor cell(MPC)）[Reyes, M., Lund, T., Leuvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., Verfaillie, C.M. (2001) Purification and in vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98, 2615-2625]，因能和MSCs一起被纯化而统称BM stromal stem cell。 3 利用流式细胞仪的研究显示,MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①
1、什么是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)? 人体大部分骨头的中央部门有骨腔,骨腔内所含的物质即骨髓.骨髓中有一种能起着造血功能的细胞就叫造血干细胞.人血中的红细胞,血小板,淋巴细胞,粒细胞等,都是由它经过多次分化发育而成的. 2、什么是造血干细胞移植? 造血干细胞移植是指他人骨髓中的造血干细胞移植到人体内,平时所说的”骨髓移植”实际上就是造血干细胞移植. 3、造血干细胞移植能治疗哪些疾病? 利用造血干细胞移植治疗的疾病很多.可治疗肿瘤性疾病,如:白血病,某些恶性实体瘤等,以及非肿瘤性疾病,如:再生障碍性贫血,重症免疫缺陷病,急性放射病,地中海贫血等.目前,对造血干细胞的研究又有一些新突破,如对重症天疱疮严重并发症(双侧股骨头无菌性坏死)以及生症肌无力等疾病的患者治疗. 4、什么是HLA,它在造血干细胞移植中的作用是什么? HLA即人类白细胞抗原,存在于人体的各种有核细胞表面.它是人体生物学”身份证”,由父母遗传,能识别”自己”和非已”,从而保持个体完整性.因而HLA在造血干细胞移植的成败中起着重要作用,造血干细胞移植要求捐献者和接受移植者HLA配型. 5、兄弟姐妹的HLA相合率是多少?非血缘关系的捐献者中与患者的HLA相合率是多少? 同卵(同基因)双生兄弟姐妹为100%,非同卵(异基因)双生或亲生兄弟姐妹是1/4. 人类非血缘关系的HLA型别中,相合几率是四百分之一到万分之一,在较为罕见的HLA型别中,相合几率只有几十万分之一.由于独生子女家庭的普遍性,高相合率人群减少,今后移植主要在非血缘关系供者中寻找相合者. 6、为什么要建立中国造血干细胞捐献者资料库? 我国需要造血干细胞移植的患者有数百万人,仅白血病患者每年就新增4万人以上,要成功地进行造血干细胞移植治疗,捐献者与患者之间的HLA型别要相合.如果不合,移植后就会产生严重的移植物抗宿主反应,甚至危及患者生命.因此,必须建立中国人的造血干细胞捐献者资料库,并且是参加的志愿者越多,库容量越大,患者找到相合捐献者的机会就越多,”生机”就越大. 7、中国造血干细胞捐献者资料库是什么机构?
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期