生物制药技术复习资料
一、名词解释（5题，每题4分，共20分）
1．细胞全能性：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。
2．细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
3．体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
4．酶活力单位：1961年，国际生物化学联合会规定：在特定条件下(温度可采用25℃或其他选用的温度；pH等条件均采用最适条件)，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个活力单位。
5．固定化酶：与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内气催化作用的酶优点：纯化简单，提高产物质量，应用范围广，多次使用，可以装塔连续反应。缺点：首次投入成本高大分子底物较困难方法：吸附法、包埋法（凝胶/半透膜包埋法）、结合法（离子键/共价键结合法）交联法、热处理法。
二、简答题（5题，每题5分，共25分）
1．幼胚培养时胚的发育方式有哪几种？各有何特点？
胚性发育：按活体内方式发育形成成熟胚，再按种子萌发方式成苗。
早熟萌发：直接萌发成苗。
愈伤组织：先形成愈伤组织多为胚性愈伤组织，再分化植株。
2．人工种子利用有何优点?其前景如何？
可以周年生产贮藏；能直接播种，可机械化操作和常规管理。微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物及天然种子繁殖变异大的植物。
3．简述酶的催化作用机制？
答：酶与底物结合时，两者构象的改变使它们互相楔合，底物分子适当地向酶分子活性中心靠近，并且趋向于酶的催化部位，使活性中心这一局部地区的底物浓度大大增高，并使底物分子发生扭曲，易于断裂。在另一些情况中，可能还有一些其他的因素使酶反应速度稍有一些增高，如酶与底物形成有一定稳定度的过渡态中间物——共价的ES中间物，这种ES中间物又可迅速地分解成产物；又如酶活性中心的质子供体和质子受体对底物分子进行了广义的酸碱催化等。
4．简述维持酶的稳定化的作用力？
答：1．金属离子、底物、辅因子和其他低相对分子质量配体的结合作用；2．蛋白质—蛋白质和蛋白质—脂的作用；3．盐桥和氢键；4．二硫键；5．对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低；6．氨基酸残基的坚实装配；7．疏水相互作用3．简述酶固定化后活力变化的可能原因？
答：①酶分子空间构象有所变化，甚至影响活性中心的氨基酸；②酶分子空间自由度（空间位阻）受到限制，影响活性中心对底物的定位作用；③骨扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。
5简述修饰酶热稳定性提高的主要原因？
答：由于修饰剂共价连接于酶分子后，使酶的天然构象产生一定的“刚性”，不易伸展失活，并减少了酶分子内部基团的热振动，从而增加了热稳定性。而且这种热稳定性效果和修饰剂与酶之间的交联点的数目有关，通常交联点增多，酶的热稳定性就可提高。热稳定性提高的另外一个原因是修饰剂本身增加了酶分子的表面亲水性，使酶分子在水溶液中形成新的氢键和盐桥。
三、分析题（共10分）
在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的
技术流程。请据图回答：
⑴A过程需要的酶有(同一种)限制酶、DNA连接酶(缺一不可)。
⑵要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用Ca2+处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。
⑶含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C] 脱分化和[E]再分化。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入卡那霉素。
⑷如想利用分子杂交技术检测再生植株中的抗虫基因是否转录，应该用放射性同位素标记的目的基因作为探针与mRNA杂交。
四、论述题（第一题10分，第二题15分，共25分）
1、试论述实施天然酶化学修饰的必要性和可行性？
答：（1）酶的化学修饰的必要性
酶作为蛋白质，其异体蛋白的抗原性、受蛋白水解酶水解和抑制剂作用、在体内半衰期短等缺点严重影响医用酶的使用效果，甚至无法使用。工业用酶常常由于酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的pH和温度不总是在酶反应的最适pH和最适温度范围内；底物不溶于水或酶的Km值过高等弱点而限制了酶制剂的应用范围。酶的化学修饰就是对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。在酶工程中，酶的化学修饰的主要目的在于提高酶的稳定性。对于医学上的治疗用酶，还有一个目的就是要降低或消除酶分子的免疫
原性。在基础酶学研究中，化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。（2）化学修饰的可行性
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素主要有两个：一是蛋白质功能基的反应性；二是修饰剂的反应性。现分述如下。(1)影响酶蛋白功能基反应性的因素A、微区的极性：微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。B、氢键效应：天然蛋白质或它的离子通过氢键来维持其稳定性，也是使pK发生改变的一个因素。C、静电效应：用高分辨率的核磁共振法对组氨酸残基的电离行为进行的研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。D、位阻效应：处于蛋白质表面的功能基，一般说来比较容易与修饰剂反应。但是，如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位阻效应。（2）酶蛋白功能基的超反应性：超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差。（3）修饰剂反应性的决定因素：选择吸附：化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质—修饰剂复合物的形成。静电相互作用：带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。位阻因素：蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。（4）化学修饰的措施：修饰酶的功能基团酶分子中的可解离基团如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等，都是可以被修饰的基团。
2、试论述植物组织培养的概念、生理依据基本类型和主要特点。
（1）植物组织培养的概念
高等植物的组织培养（tissue culture）技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。
（2）植物组织培养的生理依据
细胞全能性(cell totipotency)：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。（3）植物组织培养的类型
组织培养按培养对象可分为组织或愈伤培养、器官培养、植株培养、细胞和原生质体培养等。
1．组织或愈伤组织培养（tissue, callus culture）为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。
2．器官培养（organ culture）即离体器官的培养，根据作物和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养
3．植株培养（plant culture）是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。
4．细胞培养（cell culture）是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。
5．原生质体培养（protoplast culture）是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。
组织培养是本世纪发展起来的一门新技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。
（4）植物组织培养的特点
植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之广泛，是由于具备以
下几个特点：
①培养条件可以人为控制
组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
②生长周期短，繁殖率高
植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。