差速离心法分离线粒体
课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿
一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）
三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）
五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得
一、实验目的
1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法
二、实验原理
1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降
在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。 离心力 RCF=1.119 ? 10-5 ? r ? n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）
3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 三、实验材料与试剂
材料：小白鼠肝脏
器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，
试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液
四、实验步骤
I 差速离心法分离线粒体
1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；
2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；
3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；
4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；
5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)
6．转移上清液至新EP 管中；
7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。吸20μL 线粒体悬浮液至新EP 管 中，加20μL 詹装 订 线
纳斯绿染色液，混匀后于室温下敞口染色20min左右。
8．吸5-10μL线粒体悬浮液至载玻片上，加盖玻片，置显微镜下观察。
Ⅱ人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
1．取清洁载玻片，用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物涂在载玻片上；2．滴1滴0.02%詹纳斯绿B染液，染色10-15 min；（作用，染液不可干燥，必要时加滴染液）；
3．盖上盖玻片，置显微镜下观察。
五、实验结果与分析
I 差速离心法分离线粒体
1）在4800rpm离心后，得到沉淀1#和上清液1#。对上清液1#进行詹姆斯绿染色后，可以看到显微镜下悬浮着较多浅蓝色较亮的细胞膜碎片和染色较深的细小线粒体颗粒。此为本次实验中观察到的线粒体密度最大的装片。
2）11000rpm离心30分钟后，得到上清液2#和沉淀2#。对上清液和沉淀分别染色。所得到的上清液和沉淀悬浊液中均有深蓝色的线粒体颗粒，而且上清液中的线粒体密度大于悬浊液中的线粒体密度；同时，两者的密度均小于上清液1#中线粒体的密度。
II 人口腔上皮细胞线粒体超活染色与观察
图1 人口腔上皮细胞线粒体染色图
从图中染色的人口腔上皮细胞中可以看到，染成深蓝色短棒状线粒体颗粒较分布在细胞核附近。
六、讨论、心得
在I 差速离心法分离线粒体试验中，詹姆斯绿染色的三个标本都成阳性，这与理论上不符。理论上来说，在第一次较低转速的离心后，沉淀出了较大的细胞组分（细胞核结缔组织）和未破碎的细胞等。而上清液中悬浮着沉降系数较小的细胞组分，包括大部分的线粒体——1#染色结果可以说明如此。在第二次离心之后，上清液中主要存在高尔基体和内质网等沉降系数较小的细胞器，沉淀里面则具有纯度较高的线粒体和溶酶体——但是2#上清液染色成阳性，与理论不符；同时，2#沉淀悬浊液中的线粒体浓度小于2#上清液，也与理论不符。
误差分析：
2#上清液染色成阳性，且密度大于2#沉淀悬浊液的原因可能是：
1）染色步骤是在常温下进行的，且时间较长，线粒体的可能部分失活。
2）两个标本在不同的情况下进行染色，氧化条件不同，染色程度不同
3）詹姆斯绿活体染色后，没有充分水洗，非特异性燃料附着，导致在较低倍数下分辨不清线粒体和其他颗粒；
4）在吸取二次上清液时，操作不熟练，枪头触到沉淀，使上清液中混入了沉淀。
5）上清液和沉淀悬浊液的稀释倍数不同，导致两者的线粒体浓度不能直接比较或在显微镜下看不出明显的密度差别。
6）差速离心的转速不够或离心时间不够长，没有将线粒体完全沉淀下来；
六、思考题
试比较差速离心法和密度梯度离心法的异同：
差速离心：是指用大小不同的离心力使具有不同沉降系数的颗粒依次沉淀分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
密度梯度离心：是用一定的介质在离心管内形成一个连续的密度梯度，将细胞悬浊或匀浆置于介质顶部，通过离心使组分分层、分离。密度梯度可以离心前预先制备或在离心中自然形成。可用于分析型或制备型的离心分离。
相同：均是根据细胞器大小、形状、密度等物理性质差异，将亚细胞组分分离的常用技术。
不同：1）密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的;差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离
2）密度梯度离心只用一个离心转速，而差速离心用两个甚至更多的转速。
3）密度梯度离心的物质是密度有一定差异的，而差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分。