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中国荷斯坦奶牛BLF基因5′侧翼区PCRSSCP多态性及其与乳房炎的相关性分析

第35卷第1l期西北农林科技大学学报(自然科学版)V01.35No.111111兰!!星!!:::墼兰些!!:!兰!兰垒!:!坚!!::錾!呈!兰:!兰!;!!:!些!兰!!!!

中国荷斯坦奶牛BLF基因57侧翼区PCR—SSCP多态性及其与乳房炎的相关性分析

方平,昝林森,张佳兰,申光磊,刘新武

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100)

[摘塞]采用PCR-SSCP技术,对中国荷斯坦奶牛乳铁蛋白基因(Bovinelactoferrin.BLF)5’侧翼垣的多态性进行了分析,并用最小二乘法拟合线性模型分析各种基因型与奶牛乳房炎的相关性.结果发现,中国荷斯坦奶牛BLF基因51侧翼区存在AA、BB和AB3种基因型,其基因型频率分别为0,8805,0.0299和0.0896;AA基因型在一148位缺失G;与AA基因型相比,BB基因型在一149位发生C呻T变异,一135位发生G—A变异;BLF基因5’侧

翼区的f值为7.9924(P<o.01),说明BI。F基因s7侧翼区的突变处于Hardy-Weinberg非平衡状态,样本群体中AA基因型的SCSL^w最大,BB基冈型的SCSⅢ最小,两者差异投显著(P<0.01)。表明BLF基因5’侧翼区B]3基因

型可能与乳房炎的抗性有关.AA基因型可能与乳房炎的易感性有关。

[关键词]中国荷斯坦奶牛f乳铁蛋白基因;PCR—SSCP}乳房炎

[中圈分类号]¥823.9+12[文献标识码]A[文章编号]1671—9387(2007)11—0011-04

AssociationofBLF5"-regionpolymorphismswith

mastitisinChineseHolstein

FANGPing,ZANLin-sen,ZHANGJia—lan。SHENGuang-lei,LIUXin—wu

(CollegeqfAnimalScienceandTrrhnotogy}Horn∞ⅢA札FUniversity.Yangling.Shannxi712100,China)Abstract:TodetectDNAvariationofbovinelaetoferringene,thesequenceof5'-regulatoryregionwasstudiedbyPCR—SSCP.Correlationsbetweenallgenotypeswiththemastitiswereanalyzedinthisstudy.TheresultsshowedthreegenotypesofBI。F5’allelewereobservedinChineseHolstein。genotypeAA,gen—otype

BBandgenotypeAB,andthegenotypefrequencywere0.8805,0.0299and0.0896,respectively.Aftersequencing,Gdeletionat一148wasfoundundertheAAgenotype。andC—?TandG—’AtransitionswereidentifiedundertheBBgenotypeincomparisontotheAAgenotype.rtestindicatedthat5'-regulato—ryregiondidnotfitHardy-Weinbergequilibrium(f=7.9924)(P<O.01),TheSCSl.^wofgenotypeAAwashlggestinthesamplecolony,andthesmallestonewasgenotypeBB,SOtherewasgreatlysignificantdifference(P<O.01)betweenthesetwogenotypes,whichshowedthatBI。F5'-BBgenotypemightrelatetotheresistanceofmastiffs.andAAgenotypesmightrelatetothesusceptibilityofmastiffs(P<O.01).KeyWOrds:ChineseHolstein;BI。F;PCR—SSCP;mastiffs

[收稿日期][基金项目][作者简介]

[通讯作者]

2006—09—11

国家“十五”奶业重大专项(2002BA518A17){陕西省重大科技专项(2006KZ07一G1)

方平(1981一).男,制肃白银人,在读硬士,主要从事生物技术在家畜育种中的应用研究。E-mail,fangpin9313@ya-hoo.com.cn

管韩森t1963一),男,陕西获风人,教授,博士生导师,主要从事动物生长发育调控麈牛的遗传育种与繁殖研究。

E-mailI*Znnls@yahoo.gom.蛆。

 

12西北农林科技大学学报(自然科学版)第35卷

牛乳铁蛋白(Bovinelaetoferrin,BI。F)是20世纪50年代末分离和鉴定的一种非血红素铁结合蛋白,由牛乳腺上皮细胞和中性白细胞表达和分泌,属于转铁蛋白家族[“。BLF是相对分子质量约为80ku的单亚基糖蛋白,其mRNA全长为235lbp,编码708个氨基酸。BLF基因全长为34.5kb,有17个外显子,位于牛的第22号染色体上o]。有研究表明,不同时期奶牛乳汁中的BLF含量差异很大,初乳中约为2g/i。,泌乳期降为o.Ol~o.1g/L,干奶期则升高到20g/I.[“。而近几年的研究发现,乳汁中的BLF含最和乳房炎的发生存在显著正相关“j,这说明BLF和乳房炎可能存在某种内在联系,那么是否可以将BI。F基因作为选育抗乳房炎性状的奶牛群分子遗传标记,目前此方面的研究尚未见报道。为此,本试验以中国荷斯坦奶牛为材料,利用PCR-SSCP技术对BLF基因57侧翼区部分序列的多态性进行了检测分析,探讨其与乳房炎之间的关系,以期为奶牛乳房炎的抗病育种工作提供依据。

l材料与方法

1.1材料

1.1_1奶牛血样随机采集西安现代农业开发总公司奶牛一场、五场共134头中国荷斯坦奶牛血样,每头10mL,肝素钠抗凝,一20℃保存。

1.1.2主要试剂基因组提取试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司,Taq酶、dNTPs、丙烯酰胺均购自上海生物工程公司。

1.2中国荷斯坦奶牛血液DNA的提取

采用北京鼎国生物技术有限责任公司生产的基因组提取试剂盒提取中国荷斯坦奶牛全血基因组,具体操作参考试剂盒说明书。

1.3中国荷斯坦奶牛BLF基因5’侧翼区的PCR-SSCP分析

1.3.1中国荷斯坦奶牛BLF基因57侧翼区的PCR扩增根据Zheng等“3在GenBank中发表的奶牛BLF基因的5’侧翼区序列(登录号:AY319306)设计1对引物:上游引物:5'-TTcTCGCTCcCTcG-GTCTC-3’;下游引物:5,-CGTTCTGCGTCCcTT—TATC一37,均由上海生物工程公司合成。以提取的基因组为模板进行PCR扩增,PCR扩增体系为15pL:TaqDNA聚合酶1.5肛L,10×PCRbuffer1.5vL,dNTP1.0“L,上、下罅引物(20pmol/L)各0.25PL,M92+1.5.ul一灭菌水8.0pL。扩增程序:95℃预变性5min;95℃变性408,61℃退火30s,72℃延伸40s,34个循环;72℃延伸6rain,4℃保存。PCR产物用15g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。1.3.2中国荷新坦奶牛BLF基因5’侧翼区的SS-CP分析取4pLPCR产物和8pL的Loadingbuffer(980g/L甲酰胺+0,25g/L溴酚蓝+0.25g/L二甲苯菁+10mmol/LEDTA+2g/L甘油),98℃变性10min,然后立即冰浴5min,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),PAGE的交联度为39:1,浓度为120g/L,120V,室温下电泳6h,银染显带。将PAGE检测的纯合基因型单独扩增后,进上海生工进行测序,把测序结果与Zheng等“3发表的BLF序列进行比对。

1.4奶牛乳房炎的判定

由于乳房炎属次级性状,生产中难以度量,因此选择与乳房炎有中等强正相关的、容易测量的体细胞计数(Somaticcellcount,SCC),作为判定奶牛是否感染乳房炎的间接指标[6]。由于牛乳中的SCC浓度的频率分布是高度偏斜的,并且组问具有显著的异质性方差”],而方差分析中的假设检验要求误差应当正态分布且亚组方差应肖是齐性的n],列此SCC数据在分析之前必须转换为遵循正态分布的体细胞评分(Somaticcellscore,SCS),转换公式为SCS=log。(SCC/100)+3。由于牛乳中的SCS受牛胎次,泌乳时期等影响较大,所以需对SCS进行校正,即将每次测定得到的SCS转换为泌乳期平均体细胞评分(SCSLAW)。判定标准为:若scSL—w<5则为健康奶牛,若SCS。一w≥5则为感染乳房炎奶牛‘¨。j

2结果与分析

2.1中国荷斯坦奶牛BLF基因57侧翼区PCR—SS—CP分析结果

结果显示。扩增片段长度为173bp,存在3种基因型(图1),分别为AA、BB和AB,其基因型频率分别为0.8805,0.0299和0.0896。

2.2中国荷斯坦奶牛BLF基因5’侧翼区序列多态性与奶牛乳房炎的相关性分析

所采样本以SCSLA。划分为健康牛和感染牛,结果显示健康牛有109头,感染牛有25头,其BLF基因5’侧翼区的基因型频率和基因频率见表l。经过0适合性检验,BLF基因5’侧翼区的r值为7,99z4(xg。Ⅲ:n一6.63),说明BI,F基目51侧翼区的突变处于Hardy-Weinberg非平衡状态。

 

第11期方平等:中国荷斯坦奶牛BLF基因5’侧翼区PCR—SSCP多态性及其与乳房炎的相关性分析

13

BLF5’侧翼区

BLF

57region

AA

23BB0AB

95410

0.92000.00000.080

O.8716

0.03670.0917

用SPSS软件(V12.O)计算奶牛BLF基因5’侧翼区不同基因型8(3SL。w的最小均值及其标准误,结果(表2)发现,在样本群体中AA基因型的SCSL^w

最大,BB基因型的SCSt一最小,两者差异极显著(P<0.01)。同时,BI,F基因5’侧翼区基因座位无

论是在感染牛还是健康牛中,都是AA基困型分布频率最高。说明BLF基因57侧翼区BB基因型可能和乳房炎的抗性有关。AA基因型可能和乳房炎的易感性有关。

衰2中国荷斯坦奶牛BLF基因5’埘曩

区座位不同基因型的SCSLAW值

Table

Least

squares

meanandstandard

error

forlittersizeofdifferentBLF5’一region

genotypes

注t不同大写字母表示差异极显看(P<O.O”。

Note:Different

capitallettersin

columnmean

significant

dlfferenee

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2.3中国荷斯坦奶牛BLF基因5’侧翼区扩增片断

测序结果

结果表明,AA基因型在一148位缺失G;与AA基因型相比,BB基因型在一149位发生了C—T变异,一135位发生了G—A变异;BB基因型的几个突变位点均位于上游控制元件(UpstreamCOIl—trolelement,UCE)区,这是否影响到核心元件转录启始的效率,从而对含有突变位点的奶牛个体的抗

乳房炎的能力产生影响,还需要进一步深入研究。

3讨论

近年来,对标记奶牛乳房炎抗性基因的研究从未停止。Ashwell等”o对奶牛基因进行筛选,发现第22号染色体含有与体细胞数紧密相关的数量性状位点。Schulman等“1】利用差异显示PCR和定量RT-PCR技术,通过基因作图,确定4个基因与乳房炎抗性有关。高树新等”23采用PCR—SSCP技术,发现奶牛DQA—B/DRB3一C、DQA—G/DRB3一F两种单倍型可能与乳房炎易感性有关,而DQ睁F/DRB3一E单倍型可能与奶牛乳房炎的抗性有关。张利军等[1”研究发现,BLF基因启动子区存在RFLP多态性,该多态性与乳房炎存在一定的关系。因此,乳房炎的发生除受环境影响外,还和机体内在的遗传机制有关,改变奶牛遗传因子则可能降低乳房炎的发生。BLF是乳中~种重要的乳清蛋白,具有非

常广泛的功能,如有抑菌和杀菌作用,并参与许多免疫反应。因此,了解BLF基因的结构和基因突变对奶牛免疫功能的影响,尤其研究该基因的5’侧翼区是如何影响和调节基因的表达和调控的,进而探讨乳铁蛋白与奶牛乳房炎的关系.对研究BLF基因是否可作为乳房炎抗性的候选基因,并应用于奶牛核心群育种中o“。有着重要的理论意义和实践意义。本研究发现,BLF基因5’侧翼区BB基因型可能与乳房炎的抗性有关,AA基因型可能与乳房炎的易

感性有关。因此,在中国荷斯坦奶牛的抗病育种过

 

14西北农林科技大学学报(自然科学版)第35卷

程中,应加强选择含有乳房炎抗性基因的个体,逐步建立具有抗乳房炎特性的奶牛品系。

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中国荷斯坦奶牛BLF基因5′侧翼区PCR-SSCP多态性及其与乳

房炎的相关性分析

作者:方平, 昝林森, 张佳兰, 申光磊, 刘新武, FANG Ping, ZAN Lin-sen, ZHANG Jia-lan, SHEN Guang-lei, LIU Xin-wu

作者单位:西北农林科技大学,动物科技学院,陕西,杨凌,712100

刊名:

西北农林科技大学学报(自然科学版)

英文刊名:JOURNAL OF NORTHWEST A & F UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)

年,卷(期):2007,35(11)

引用次数:2次

参考文献(14条)

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相似文献(1条)

1.学位论文孔振兴中国荷斯坦奶牛乳铁蛋白基因多态性与乳腺炎相关性的研究2008

本研究选取中国荷斯坦奶牛群体共计250头个体为研究对象,采用PCR-RFLP技术对试验牛群中存在的乳铁蛋白基因的四个多态位点进行了PCR扩增、酶切检测和测序分析,发现该牛群的乳铁蛋白基因四个多态位点均存在三种基因型;结合试验牛群的DHI测定所得到的育种资料记录和生产性能指标(主要选择体细胞评分、产奶量、乳脂率和乳蛋白率),运用最小二乘线性模型,对这几个位点的多态性与奶牛乳腺炎之间的相关性进行了分析,发现乳铁蛋白基因-916位点的T/G突变和-927位点的G/A突变所产生的不同基因型与生产性状之间的效应检验不显著,而+72位点的T/C突变和-478位点的G的插入所产生的不同基因型之间的生产性能指标出现差异,并找到了具有乳腺炎抗性的基因型和优良的等位基因,为进一步的标记辅助选择提供了有力的依据

,并为奶牛乳腺炎的抗病育种工作提供了理论依据。研究结果如下: 根据NCBI上已登录的乳铁蛋白基因序列并参考Seyfert所报道的多态位点,确定所研究的四个突变位点并对乳铁蛋白基因进行了PCR扩增和测序分析。研究发现:本试验奶牛群体在这四个位点上均存在突变,分别是-927位点的G到A的突变,-916位点的T到G的突变,-478位点的G的插入和+72位点的T到C的突变,预期结果与报道的一致。 利用改造的酶切位点对-927位点、-916位点和+72位点的PCR扩增产物分别进行TaqⅠ、HaeⅢ和Eco T14Ⅰ酶切,利用已存在的酶切位点对-478位点进行HpyF10VⅠ酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物检测分析,发现在这四个突变位点上均存在有三种基因型:AA基因型、AB基因型和BB基因型。 结合DHI测定所记录的该试验奶牛群的生产性能数据,利用统计分析软件SAS将乳铁蛋白基因四个位点上的突变所产生不同基因型对体细胞评分、产奶量、乳脂率和乳蛋白率的效应进行最小二乘均值显著性检验。结果发现:+72位点(T/C)的AB基因型个体的SCS值极显著低于BB基因型个体(P<0.01),显著低于AA基因型个体

(P<0.05),BB基因型个体与AA基因型个体差异不显著(P>0.05);同时,AB基因型个体的产奶量值显著高于AA基因型、BB基因型个体(P<0.05),表明本试验奶牛群中AB基因型个体表现出乳腺炎抗性;-478位点(/G) AA基因型个体的SCS值极显著低于AB基因型、BB基因型个体(P<0.01),同时AA基因型个体的产奶量值显著高于AB基因型、BB基因型个体,表明本试验奶牛群中AA基因型个体表现出了乳腺炎抗性;另外,-478位点(/G) AB基因型个体的乳蛋白率、乳脂率显著高于AA基因型、BB基因型个体。因此,A等位基因是优良的等位基因。-916位点(T/G)和-927位点(G/A)的基因型对体细胞评分、产奶量、乳脂率、乳蛋白率的效应检验不显著。

引证文献(2条)

1.杨东英中国荷斯坦乳牛DRB3基因多态性的PCR-SSCP分析及其与泌乳性状的相关性[期刊论文]-中国兽医科学2008(10)

2.赵春林.WANG Chuan.吴润.LI Fa-di.柳纪省绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化[期刊论文]-中国兽医科学 2008(08)

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