目的基因到工程菌的构建
1基因工程的诞生
1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究，他们把SV40（一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起，成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞生了。
SV40病毒
第一个重组体的构建
1.1基因工程技术的三大理论基础
一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。三是20世纪60年代关于遗传信息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质的方向进行传递的。
1.2基因工程技术的三大技术基础
三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三
是如何将所获得的基因片段重新连接。20世纪70年代，由Smith等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现，解决了上述三大问题。
限制性核酸内切酶
限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
DNA连接酶
作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，其起作用时不需要模板。
基因工程的载体-质粒
基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复制子是外源基因的载体。此外，为满足其使命，还必须具备如下一些特性：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。②易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。③载体DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，并位于DNA 复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。某些病毒载体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助存在时才能进行正常增殖。④具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。
1.3基因工程的基本过程
1.4基因工程的应用
2目的基因的获取
基因工程订是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常我们把插入到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段称为“目的基因”。
来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小的一部分，为其10-5 -10-7 ，即使多拷贝基因也只有其10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。
目的基因的获取大致可以分为三类：一是利用PCR技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物个体的基因组文库或者cDNA文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆；三是近年来发展的利用基因差异表达获取目的基因的技术。
直接分离法（鸟枪法）
直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又称“散弹枪法”。其是将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。优点是速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA一样的有内含子的真核基因DNA片段。逆转录法（cDNA法）
逆转录法合成DNA是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。主要用于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，以dNTP为底物，酶催化按5ˊ→3ˊ方向合成一条与RNA模板互补的DNA 单链（cDNA），它与RNA模板形成RNA与DNA的杂交体。随后又在反转录酶的作用下水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，由RNA指导的DNA合成过程完成。
反转录-聚合酶链式反应法（PCR法）
该法是将mRNA经反转录全成cDNA的第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。常用于含其极微量mRNA的细胞。
cDNA文库
cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转
录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。原理是将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接。
cDNA文库的构建：
cDNA第一链的合成
利用反转录酶合成cDNA第一链
cDNA第二链的合成
①自身引导合成法：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.此法存在的缺点是在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排.
②置换合成法：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.此法的优点是：合成cDNA的效率高；直接利用第一链的反应产物，不需纯化；避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA。
③引物-衔接头法
④Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA
双链cDNA分子的克隆
①同聚物加尾法:利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3’端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞.
②接头-衔接头法
③mRNA-cDNA克隆法
方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将 dA残基加到mRNA：cDNA 杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞，在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）
cDNA文库的筛选和鉴定
①核酸杂交
1）同源探针；至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.
2）部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.
3）总cDNA探针：通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+ mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.
4) cDNA扣除探针: 从第一种mRNA制备cDNA探针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交; 回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.
②特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测.
③cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆.
④cDNA克隆的确证:cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.
基因组文库
基因组文库或简称基因文库，其是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。通过构建基因文库可以贮存和扩增特定生物基因工程组的全部或部分片段，同时又能够在需要时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。
理想的基因组文库应具备下列条件：①重组克隆的总数不宜过大，以减轻从文库中筛选目标克隆的工作量。②克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于从同一克隆中获得完全的单一基因。③含有相邻DNA片段的独立克隆间，部分序列重叠的大小合理，一方面利于基因文库各克隆建立叠连群，进行染色体步查；另一方面，又不重叠过多，使步查效率低下。④克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列。⑤重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。
基因组文库的构建：
①细胞染色体大分子 DNA 的提取和大片段的制备；
②载体 DNA 的制备；
③载体与外源大片段连接；
④体外包装及基因组 DNA 文库的扩增；
⑤重组 DNA 的筛选和鉴定。
?表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选
?抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长
?分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选
?免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选
?PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段
cDNA文库和基因组文库的区别
时效性: cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因。
序列组成不：cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
两种文库均有应用，如何选择：根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。
化学合成法
该方法有个先决条件就是必须已知其核苷酸顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的核苷酸序列。用化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成黏性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。常用于较小分子蛋白质或多肽的合成。
物理化学方法
其原理是从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对，T和A配对的这些特性，从而分离目的基因的目的。
密谋梯度离心法
液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC配对的双链DNA 片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小公布开来。进而通过与某种放射性标志的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。
单链酶法
碱基GC配对之间有三个氢键，比AT配对的稳定性高，当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应用单链特异的S1核酸酶切除单链，殖民地经氯化铯超速离心，获得无单链切口的DNA。
分子杂交法
单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这就是分子杂交的原理。其既可以分离，也可以鉴别某一基因。
3 基因与载体的连接（以质粒为例）
质粒的提取
通过加入SDS（十二烷基硫酸钠）对宿主细胞进行裂解，使质粒DNA 顺利溢出并与染色体DNA和蛋白质等分离。其中，微量碱变性法提取质粒具有简单快速、经济实惠优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种纯化质粒DNA的方法。当然，也可以采用试剂盒进行，目前，商品化产品很多，其基本原理大多是基于碱裂解法结合硅胶模等微型离心纯化柱。
质粒载体的构建
天然质粒往往存在这样或那样的缺陷，不适合直接用作克隆载体，需要进行人工改造，这些改造主要有以下几方面：
（1）选择合适的复制起始位点。为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞中进行有效复制，且获得足够数量的拷贝数，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起始位点。
（2）加入合适的选择标记基因。为了便于重组子筛选，需要在质粒克隆载体上加入合适的标记基因，主要有lacZ和抗生素抗性基因，前者用于克隆子蓝、白斑筛选；当外源DNA片段插入到克隆位点后，可导致抗生素抗性基因失活。
（3）增加或减少酶切位点。质粒载体利用限制性内切酶识别位点来作为外源DNA片段插入的克隆位点，这种位点必须是单一酶切位点，而且数量
越多越便于多种类型末端的DNA插入。可通过删除天然质粒中的部分重复的限制性内切酶识别位点使之成为单一的酶切位点，可通过增加新的单一限制性内切酶位点在特定的部位组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）。
（4）缩短长度。质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质量质粒转化效率较高。可通过切去质粒上不必要的片段，提高转化宿主细胞的效率，提高其外源DNA片段的装载量。
目的基因与载体的连接
用一定的限制性酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端；再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，形成一个重组的DNA分子（重组质粒）。
4 重组基因导入受体细胞构建工程菌
受体细胞的选择
常用的宿主细胞有如下几种：①DH5: 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。②HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高。③JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌。④JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌。⑤MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌。
重组质粒转化受体细胞
常用方法有①转化法；②转导法；③转染法。
5 筛选含有目的基因的受体细胞
原理：质粒上的抗生素的抗性基因
方法：利用选择培养基筛选
工程菌筛选方法
载体表型选择法
载体表型选择法是根据载体分子所提供的表性特征，直接选择重组DNA 分子的方法，主要包括：
抗药性标记插入失活选择法
pBR322质粒是分子克隆中最常用的一种载体分子，编码有tetr ampr 使带有该质粒的宿主细胞能在含有四环素或氨苄青霉素的培养基中生长。具体做法：将此转化菌先涂布在含有氨苄青霉素的平板上，并将存活的菌落原位影印到另一个含有四环素的夹板上，凡是在氨苄青霉素平板上生长，而在四环素夹板上不生长的菌落上就可能是已经获得了这种重组体质粒的转化子克隆。
半乳糖苷酶显色反应选择法
除了抗生素抗性筛选之外，质粒等载体上常用的另一种筛选标志是β-半乳糖苷酶显色反应。当外源DNA插入到载体lacZ上，导致β-半乳糖苷酶基因失活，可通过大肠杆菌转化子菌落再添加由X-gal-IPTG培养基中的着色变化直接观察出来。
根据插入基因的表型选择法
其基本原理是：转化进来的外源DNA编码的蛋白，能够对大肠杆菌宿主菌株所具有突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征。这种筛选法受到一定的条件限制，他不但要求克隆的DNA片段必须大到可以包含一个完整的基因序列，而且还要求目标基因能够在大肠杆菌宿主细胞中实现功能表达。无疑，真核生物基因难以满足这些要求。其原因在于有许多真核基因是不能对大肠杆菌的突变发生抑制作用或起互补效应。此外，大多数的真核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中所需要的剪辑机理，这样便阻碍了他们在大肠杆菌宿主细胞中实现基因产物的表达。
DNA电泳检测法
分离质粒的DNA并测定其分子长度是证明重组质粒分子质量增加的直接方法。常用操作程序比较简单的凝胶电泳来测定。由于质粒DNA电泳迁移率是与其分子质量大小成比例的，所以那些带有外源DNA插入序列、分子质量较大的重组体DNA在凝胶中的迁移率比不具有外源DNA序列、分子质量较小的质粒DNA来得缓慢。根据这些差别就可鉴定出哪能些菌落的载体中含有外源DNA片段。
PCR检测法
PCR是鉴定阳性克隆最为简单的方法，可根已知的外源DNA序列设计特异性引物进行PCR扩增以检测阳性克隆中是否含有外源DNA片段，或利用载体多克隆位点侧翼的通用引物进行PCR，根据PCR反映产物的长度判断多克隆位点上是否有外源DNA片段的插入。
核酸杂交检测法
从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术，主要有菌落原位杂交、Southern印迹法、Northern印迹杂交和Western印迹杂交技术。
免疫化学检测法
直接的免疫化学检测技术，同菌落杂交技术在程序上十分相似，但它不是使用放射性同位素标记的核算探针，而是用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。此法具有专一性强、灵敏度高的特点，只要有一个克隆的目的基因在大肠杆菌等宿主细胞中表达合成蛋白质，就可以检测出来。
DNA序列分析
DNA测序时最为准确的重组子鉴定方法，对所得的目的基因的克隆，应用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能进一步研究其结构及其与功能的关系。
到此为止，工程菌的构建基本完成。
6 大规模培养工程菌
3 基因工程成果展
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
目的基因到工程菌的构建 1基因工程的诞生 1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了DNA改造的研究，他们把SV40（一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起，成功构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞生了。 SV40病毒
第一个重组体的构建 1.1基因工程技术的三大理论基础 一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌。二是20世纪50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。三是20世纪60年代关于遗传信 息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DN A→RNA→蛋白质的方向
进行传递的。 1.2基因工程技术的三大技术基础 三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；三是如何将所获得的基因片段重新连接。20世纪70年代，由Smith等人发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体的细菌质粒的发现，解决了上述三大问题。 1.2.1 限制性核酸内切酶 限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 1.2.2 DNA连接酶 作用实质：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，其起作用时不需要模板。 1.2.3 基因工程的载体-质粒 基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而而插入复制子DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复
第7章基因工程菌的培养 7.1 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面 工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成 1、培养基的组成 质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 2、培养温度 进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 3、菌体的比生长速率 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。 4、控制基因的过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。 控制外源基因过量表达的方法： 1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间， 在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。 7.2 高密度培养 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。在重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。 1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 1)相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 2)比生长速率也慢慢降低; 3)菌体密度呈线性增加。 2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 1)这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物 质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 2)比生长速率不断改变。
1、大肠杆菌DH5a菌株 DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr 4、大肠杆菌JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5、大肠杆菌TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG 6、大肠杆菌HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7.XL10-Gold菌株：所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞，缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性，提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。
第7章基因工程菌的培养 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面 工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成 1、培养基的组成 质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 2、培养温度 进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 3、菌体的比生长速率 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。 4、控制基因的过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。 控制外源基因过量表达的方法： 1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间， 在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。 高密度培养 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。在重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。 1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 1)相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 2)比生长速率也慢慢降低; 3)菌体密度呈线性增加。 2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 1)这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物 质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 2)比生长速率不断改变。
基因工程菌的发酵 近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。 第一节工程菌的来源和应用 一、何谓基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA 重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 基因工程一般分为4个步骤： 一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA 分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来，可不是一件容易的事。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的
SHMT基因工程菌的构建 第四组 一、实验相关知识 1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下： SHMT 甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸 在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关，但由于SHMT的催化作用理论上是双向的，有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。 2、基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 3、丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。 [大肠杆菌] 细菌染色体DNA 的制备（预习方案）一．实训目的 .学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取方法 二．实训原理及相关知识 1.大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小 0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖 类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后 即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几占粪便干重的1/3。国 家规定，每升饮用水肠杆菌数不应超过3个大肠杆菌的抗原成
第7章基因工程菌大规模 培养 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
第7章基因工程菌的培养 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面 工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成 1、培养基的组成 质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 2、培养温度 进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 3、菌体的比生长速率 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。 4、控制基因的过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。 控制外源基因过量表达的方法： 1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时 间，在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。 高密度培养 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。在重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。 1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 1)相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 2)比生长速率也慢慢降低; 3)菌体密度呈线性增加。 2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 1)这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物 质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 2)比生长速率不断改变。
基因工程菌在废水中的应用 摘要﹕ 随着经济发展，生活水平的提高，环境污染问题日益成为人们关注的焦点，如何治理环境污染也成为我们面前的一个重要问题。微生物技术在治理环境污染中有着各种各样的优点，随着基因工程技术的发展，人们开始利用基因工程技术对微生物进行改造，从而使其在治理环境污染方面发挥更大的优势。本文结合我国的实际污染情况，主要介绍了基因工程技术在治理水污染中的应用。 关键词：基因工程微生物废水处理 1 基因工程技术治理废水的概念 利用基因工程技术提高微生物净化污染物的能力是现代生物技术用于废水治理的一项关键技术。20世纪50年代初，由于分子生物学和生物化学的发展，对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸的结构和功能有了比较清晰的阐述。20世纪70年代初实现了DNA重组技术，逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程的生物技术。这一技术发展到今天，正形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一，广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门，并日益显示出其巨大的潜力，将为世界面临的水污染等问题的解决提供广阔的应用前景[1]。 将基因工程技术应用于重金属废水的治理，就是通过转基因技术，将外源基因转入微生物细胞中表达，使之表现出一些野生菌没有的优良的遗传性状，如对重金属离子高的富集容量以及对特定重金属离子高的选择性，从而实现对重金属离子高效的生物富集。与传统的生物吸附法不同，生物富集法一般被认为是利用活体菌的某些金属离子转运酶通过某些离子转运通道把金属离子转运到细胞内部的过程。虽然在活体菌的细胞壁处仍然会存在表面吸附现象，但主动运输过程占主导地位。对重金属离子的高容量富集或高选择性富集等优良性状与某些微生物对重金属离子的毒性所产生的抗性相关联，由这些微生物在特定的环境中不断进化、变异而获得。微生物由于存在的多样性以及受所生存的特定环境的影响，其对重金属的抗性也具有多样性，这种多样性主要体现在两个方面，一方面是通过在细胞中产生对金属离子具高结合容量的络合物以络合体内的重金属，以减少