彭泽鲫胰蛋白酶多转录本分析及其在水产养殖中的应用可行性研究报告
第一章项目背景及立论依据
1.1本项目研究的必要性
早在三千年前，中国的农民已开始淡水鱼塘养鱼；两千年前，又开始在沿海养殖软体水产。数个世纪以来，水产养殖（鱼类、贝类及水生植物）大部分作为一种小规模自给行为而存在，产量较低。但在过去的几十年内，水产养殖业突飞猛进，目前已成为全球增长最快的食物生产体系。专家认为，三十年后，水产养殖将成为人类最大的鱼类及甲壳类消费资源。
水产养殖于二十世纪七十年代急速增长，主要有两个原因。首先，由于人口数量开始飞速增长，专家们担心数亿人口将深受食物匮乏之苦。因此，世界银行等国际机构开始鼓励发展中国家的水产养殖，从而解决贫困人口食物营养并促进贫困地区的经济发展。其次，在同一时期，中国开始了经济改革，大力鼓励水产养殖。
可以说，现代化水产养殖是生逢其时。在二十世纪的最后二十几年，世界人口数量从40亿激增至60亿。人口增长主要是在发展中国家。同时，野生鱼类的捕捞无法跟上不断增长的消费需求。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO)《二十世纪国际渔业及水产养殖报告》（The State of World Fisheries and Aquaculture2000），二十世纪七十至八十年代，野生鱼类捕捞量踌躇不前，进入九十年代后没有增长。预计全球野生鱼类捕捞在未来几年内甚至可能会下降。FAO指出，全球主要海产品资源中约有四分之三已达最大产出潜力。
国际市场对鱼类及其它形式的动物蛋白的需求不断增长。位于华盛顿特区的国际粮食政策研究院（该研究院隶属于一全球性农业研究网络）的一位高级研究人员克里斯多夫-德尔加多（Christopher Delgado）说，“直到现在，发展中国家人口饮食结构还是以淀粉为主，但这些国家的人们已开始寻求其它饮食资源”。
全球有数百万人以鱼类为主食。FAO统计数据显示，2002年非洲地区动物性蛋白质的摄取量19％是来自鱼类，中国是21％、亚洲是23％。依国家层次来看，鱼类占营养需求的比例更高，就菲律宾而言，53％的动物性蛋白质来源是来自于摄取鱼类。
Subasinghe指出，发展中国家人民经常以鱼类尤其是价格低廉的淡水鱼类的主要原因，是因该鱼类是贫困民众所消费得起的鱼类。
除家计经济考虑外，“吃鱼”有更多好处。鱼类富含蛋白质及多种维生素和矿物质，如维生素A、维生素D、磷、镁、硒及碘等等，即使是一小块鱼，亦绝对有益健康。此外，多种鱼油也被证实有益身体健康。
来自联合国粮食与农业组织的报告称：世界上消费的鱼类接近一半为养殖鱼，而不是野生捕捞。2006年世界水产研讨会报告显示：1980年左右，人类消费的鱼类产品仅有9%来自养殖，而今天上升到43%。发展中国家养殖业除可直接打击饥饿外，亦可间接减缓贫穷，提供就业及提高外汇收入。今日，鱼类是国际上最被广为交易的食品之一，2001年世界水产品总产值为560亿美元，其中开发中国家所占比例超过50％。而到2006年消费的养殖鱼总量为4550万吨，价值约630亿美元。
水产养殖是通过现代化技术促进鱼的生长，而不是通过大量增加池塘数量来实现水产养殖业的迅猛增长的。不久前，亚洲养殖业开始使用粒化饲料喂养淡水有鳍鱼。此类饲料的主要成份是农副产品，包含大豆及少量鱼肉。这些现代化饲料根据养殖鱼类进行配方，可提供最适量的脂肪、蛋白质、碳氢化合物、纤维素及维他命。在这些现代化饲料的辅助下，亚洲养殖业的产量增长了10倍。现在，通过采用新的技术，使鱼类个体重量增加，满足我国激增的市场需求。
1.2鱼类消化酶和鱼类生长关系的研究现状
鱼类消化酶的活力和鱼类的生长密切相关，据Lemieux等（2003）报道在大西洋鳕，Dimer等（2004）报道在鲑鱼和神仙鱼中均可通过提高消化酶活力以改善饲料转化效率和生长速率。迄今为止，在欧洲鳟鱼、塞内加尔比目鱼、日本鲽、红鼓鱼、斑点尾鲈、大西洋红鲈等海产鱼以及黄颡鱼、鳜鱼、鲤鱼等淡水鱼中都有类似成功的报道。
近年来，在人工饲养的条件下，如何提高鱼类消化酶的活力一直是水产养殖研究热点。早期研究主要集中在分析和鉴定各个鱼种的消化酶的特性，根据各种鱼消化酶
的特性配制合适的人工饲料，为鱼体内消化酶提供良好的环境，使鱼体内的消化酶活力处于最佳的状态，以提高鱼体对营养的消化和吸收。研究表明，消化酶活力与鱼龄相关，随发育阶段的不同而不断变化，因此可依据特定养殖鱼类在不同生长阶段的消化酶特性变化，设计出相应的配合饲料以有效、快速地提高其生长及养殖效益。
但是，不同鱼种，不同的生长阶段，消化酶的活力是不同的，同时，消化酶的活力还受到食物的类型的变化，丰富程度的改变而发生变化，因此，准确地判断某一特定时刻鱼体内消化酶的表达情况还非常的困难。所以如何快速而有效的判断鱼体消化酶活力是人工配制饲料方法中急需解决的一个问题。
1.3项目发展及可行性研究
肝胰脏是鱼体的主要消化酶分泌器官，而胰蛋白酶是肝胰脏分泌的一种重要的消化酶，因此胰蛋白酶可以作为分析鱼体消化酶总活力的重要指标。此外研究还表明，胰蛋白酶是成鱼唯一和食物营养的转化率和吸收率直接相关的消化酶，因此其活力高低在调控鱼体的生长速率过程中亦具有重要作用。
胰蛋白酶的多转录本现象首先在1993年于大西洋鳕中被发现，随后在鲑鱼和比目鱼中也发现有胰蛋白酶的多种转录本表达。而且不同鱼种的转录本的核酸及蛋白质序列不同，即转录本具有种属差异性。多转录本的存在被认为是因为不同的转录本在鱼体内行使不同的功能。在鳟鱼中已发现，具有某一特定胰蛋白酶转录本的幼体比没有此转录本的幼体要提早一年长成成鱼，推测这种转录本可能和幼鱼的生长密切相关；在大西洋鲑鱼中也发现了一种新的胰蛋白酶转录本，其存在可以提高胰蛋白酶的消化能力：在相同条件下生长一年，具有此种转录本的个体要比普通鱼的重量增加15%。此外，在比目鱼和鲈鱼等养殖鱼类中也陆续发现有新的胰蛋白酶转录本的表达，但其功能还有待于进一步确认。
综合以上研究报道，我们认为有可能通过增加胰蛋白酶的持续表达以提高养殖鱼类的生长速率，而寻找胰蛋白酶的新转录本无疑是提高其表达的一个很好的切入口。
1.4本项目研究工作的概况
我们已就彭泽鲫的胰蛋白酶活力和鱼体生长做了初步研究，在之前的多次实验，结果显示不同个体的胰蛋白酶活力相差比较大，即不同的与个体中胰蛋白酶的活力存
在有个体差异；同时部分鱼体的生长和其胰蛋白酶活力呈正比关系。因此，我们认为寻找的胰蛋白酶新转录本可以解释这一酶活力的个体差异性，同时，结果显示，因为鱼体因为胰蛋白酶活力的不足，导致鱼体生长的速率下降，进而使鱼的生长时间延长，提高了鱼类养殖的成本。因此，我们下一步的工作将在彭泽鲫中寻找转录本，以证实我们的推断。
第二章技术方案分析
2.1项目创新点以及技术水平分析
2.1.1本项目拟定分离和鉴定的基因具有重要的理论意义
我们已就彭泽鲫的胰蛋白酶活力和鱼体生长做了初步研究，结果显示不同个体的胰蛋白酶活力相差比较大，即胰蛋白酶的活力存在有个体差异；同时部分鱼体的生长和其胰蛋白酶活力呈正比关系。因此，我们计划寻找的胰蛋白酶新转录本对于解释这一酶活力的个体差异性以及提高鱼体胰蛋白酶的表达具有重要的理论意义。
2.1.2本项目的顺利实施对提高彭泽鲫的养殖效率有重要的经济意义
根据已经报导的文献资料，在某些鱼类中，具有特定胰蛋白酶转录本表达的个体比没有此转录本的鱼生长数率要高15-25%左右。例如Torrissen在1991报道，大西洋鲑鱼中有特定胰蛋白酶转录本表达的个体要比对照组的重30%。本项目拟在彭泽鲫中寻找胰蛋白酶的转录本，研究具有这类转录本的彭泽鲫的食物利用率及生长速率是否要比没有此转录本的个体更高，并进一步探讨以分子遗传学技术批量培育具有此转录本的鱼种的可能性，这对提高彭泽
鲫的养殖效率显然具有重要意义。
2.1.3本项目的实施对填补我省在胰蛋白酶研究方面的空白具有重要的意义
国外对于养殖鱼类消化酶的研究主要集中在胰蛋白酶上，但研究的对象大多为鲑鱼、欧洲鲈鱼等国外经济类鱼。国内目前有关消化酶的研究仍主要集中在饲料组成、温度及酸碱性等对于消化酶活力的影响方面。对于我国常见养殖鱼类是否也有胰蛋白酶转录本的表达、以及这类转录本对常规养殖鱼类食物消化及个体生长有何影响等的相关研究，迄今还几乎是空白。我省是养殖大省，因此，增加对鱼类消化酶的研究分
析，将更加有利于的促进水产养殖的可持续发展。
2.2项目技术方案
2.2.1胰蛋白酶基因cDNA的分离和鉴定
电子信息杂交筛选。从GenBank数据库中得到鱼胰蛋白酶候选基因。用Clustalw 软件对多个鱼种（如鲑鱼、比目鱼、鲽等）中胰蛋白酶基因编码序列进行同源分析，选取高度保守的编码序列作为信息探针，将其输入美国国家生物信息中心（NCBI）的局部同源比较服务器筛选鱼类EST数据库进行BLASTN分析(Alstchul等，1997)，筛选出长度≥100bp，同源度在75%—95%的EST作为候选序列，送入GenBank核酸数据库检索，排除已克隆基因的ESTs后，利用GCG中ASSEMBLY程序将余下ESTs 序列进行整和拼接，获得统计上一致的序列，构建EST重叠群。
2.2.2候选基因cDNA的分离。
○1总mRNA提取及总cDNA池（cDNA pool）的合成。根据胰蛋白酶基因在鱼体组织的表达信息，取鱼的肝脏、血、脾、肠道等组织，用TRIzol(Life Technologies, GIBCO BRL)总RNA抽提试剂盒从上述组织中抽提总RNA，进而提取总mRNA并合并成总cDNA池。应用MarathonTM cDNA Amplification Kit(CLONTECH Inc,美国)在cDNA两端平端连接含有多个限制性内切酶位点、自身互补的黏性末端接头，试剂盒配有公用的接头引物（adaptor primer,AP）。
○2阻抑性RACE方法。以同源性高的保守序列为依据设计引物对目的基因进行搜寻，具体方法是针对所构建的EST重叠群整合序列，进行计算机同源性比较，选取同源性最高的一段序列，综合考虑引物设计的几项原则，用PRIMER5.0软件设计基因特异性引物（gene specific primer,GSP1），与接头引物AP1一起经PCR扩增出相应的cDNA并纯化克隆测序。再根据测序结果，设计出相反方向的基因特异性引物GSP2，进一步获得全长的目的cDNA。PCR反应条件：94℃预变性3min，然后94℃1min，55min～60℃1min，72℃2min，共35个循环，后接72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。经克隆测序后，用GCG软件Assemble进行拼接。
○3完整可读框的证实。在所拼接的含完整可读框的cDNA序列5’UTR和3’UTR 设计一对引物，在彭泽鲫cDNA文库中扩增，以证实可读框。
2.2.3计算机软件分析
将所获得的cDNA序列通过NCBI检索查新，并在GenBank注册。并用PC-GENE(IntelliGenetics Inc.Switzerland)等软件对新基因cDNA的核苷酸序列进行结构分析，推导出编码氨基酸序列。用Clustalw等软件将推导的氨基酸序列与同源基因编码的氨基酸序列进行同源性比较，找出该序列中存在的保守结构域。
2.2.4分离的转录本的经济性状关联分析
和其他鱼类已经公布的胰蛋白酶序列进行比较，分析新得到的转录本和各经济性状的关联。研究的主要经济性状包括：蛋白消化率，鱼的生长速率，鱼肉的脂肪含量，蛋白质含量等。
2.3项目分阶段所达到技术指标
2007.1-2007.7彭泽鲫鱼的养殖，主要是通过人工的方法，调节鱼的生长，使鱼体大小均衡。
2007.8-2007.12胰蛋白酶转录本的克隆与鉴定从鱼的肝脏、血、脾、肠道等组织中提取RNA，逆转录PCR，克隆，寻找到彭泽鲫胰蛋白酶新的转录本2008.1-2008．7胰蛋白酶新转录本的功能鉴定我们将分析胰蛋白酶新转录本在鱼体中的表达情况，并根据表达情况推测其功能，进一步，我们将选取具有新转录本表达的与个体，分析其生长状况，胰蛋白酶活力的强弱，以及对饲料的利用率等情况。
2.4资金使用状况
项目投资与资金筹措表
单位：万元序号项目金额
1投资总额7
固定资产投资3
流动资金0.5
2资金筹措0.5自筹资金
其中：已完成投资
新增投资
申请科技三项经费 3.5
借（贷）款
项目拟购设备清单
序
号设备名称规格型号单位
数
量
单价
(万元)
金额
(万
元)
1PCR仪台10.30.3 2水泵台80.0250.2
申请科技三项经费使用预算表序
号名称单位数量
金额
(万元)
使用时
间
1开发费 1.5
项目开发人员费
原材料动力费0.5
检测费0.5
调研费0.5
查新费
技术咨询费
转让、合作费
2设备费0.5
申请三项经费资
助设备：
3试制费1
人员费
原材料动力费0.7
检测费0.3 4鉴定验收费0.5
第三章项目的实施条件
3.1项目的人员组成
本课题组有一支结构合理，有不同专长（水产学、细胞生物学、分子生物学、现场管理）的科研队伍。其中教授一名，博士一名，硕士一名，以及部分在读硕士研究生。
3.2项目组已具备技术
3.2.1本研究室自建立起来已先后承担国家级、省级科研课题，并且长期从事鱼类生长方面的研究，在鱼类生长研究方面具有丰富的学术背景和科研能力。并且在国内外核心期刊上发表有相关文献。
3.2.2通过本项目申请人及项目组和研究室成员参加的国家自然科学基金项目，省自然科学基金等项目的研究,已建立了较为完善的DNA、RNA提取、PCR扩增、多态分析及电泳检测、酶切、Southern杂交、Northern杂交、文库构建、基因定位、分子克隆、mRNA差异显示等技术，掌握了生物信息学的基本理论、方法和相关软件应用。这些工作积累为本项目研究的顺利实施提供了技术保证。
3.2.3本课题组有一支结构合理，有不同专长（水产学、细胞生物学、分子生物学、现场管理）的科研队伍。
3.2.4本课题组一直十分注重文献收集工作，随时通过国际互联网络查询检索最新的相关资料及从国内外专家、本室在国外的留学生得到文献，并讨论相关问题。因此，本课题组能及时了解国内外的发展现状、趋势及存在问题，这也是本申请课题能顺利完成的重要保证。
3.3实验室设备准备情况
本项目将全部安排在本实验室内完成。本实验室已拥有进行DNA、RNA分子生物学、细胞遗传学与育种研究所必需的分子生物学操作室,无菌室,暗室与培养基室,拥有可进行PCR扩增、DNA多态性检测、分子克隆、分子杂交、基因定位、细胞遗传学分析所需的实验设备，拥有称量、恒温、干燥、细胞细菌培养、灭菌、离心、冷冻、搅拌、振荡、PCR扩增、电泳、分子杂交测序等基本设备,其中包括超净工作台、台式高速离心机、高速冷冻离心机、低温冰柜、冰箱、恒温冷冻摇床、进口PCR仪、ABI310序列分析仪、蛋白质/核酸浓度测定仪（DU640，美国），高压定时电泳仪、聚丙烯酰胺测序胶电泳槽、可见紫外检测仪、液氮罐等,还配有联网微机、刻录机、扫描仪及一些分子生物学和生物信息学分析所需的软件包,如用于PCR引物设计的软件Primer Primer，用于蛋白、DNA序列分析用的软件包DNASIS、Clustlw，检测
已知序列DNA酶切位点的软件generun,以及其他有关数量遗传、群体遗传方面的软件。
第四章市场分析
4.1市场调查
江西彭泽鲫是农业部向全国重点推广的五种淡水鱼之一，虽以肉多味美而闻名，过去总是难以远销。但自从这些鲫鱼“钻”进小氧气袋后，便迅速身价倍增，俏销全国各大市场。与往年相比，今年彭泽鲫的价格涨幅达到了20－50％，彭泽鲫与鲤鱼相比，生产效益明显提高，彭泽鲫的价格是鲤鱼的2倍。因此饲养彭泽鲫是切实可行的，通过全国大面积的推广，已产生显著的经济效益和社会效益。近年来随着市场对彭泽鲫的需求量越来越大及其经济价值的提高，其人工养殖规模也相应不断扩大。除了江西省，全国其他省市也积极养殖彭泽鲫，通过彭泽鲫的饲养，作为提高农民收入，发展农村经济的一种手段。资料显示，天津市大力发展优质淡水鱼养殖业，建成了内地最大的鲫鱼出口基地，目前，天津市优质出口型鲫鱼养殖规模超过2666.7公顷，年出口总量30000吨。积极开拓彭泽鲫鱼对韩国、日本等国的出口渠道，到2004年底已带动天津市上千个水产大户靠养殖彭泽鲫鱼出口致富。
4.2产品产量调查
在二十世纪的最后二十几年，世界人口数量从40亿激增至60亿。人口增长主要是在发展中国家。同时，野生鱼类的捕捞无法跟上不断增长的消费需求。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO)《二十世纪国际渔业及水产养殖报告》（The State of World Fisheries and Aquaculture2000），二十世纪七十至八十年代，野生鱼类捕捞量踌躇不前，进入九十年代后没有增长。预计全球野生鱼类捕捞在未来几年内甚至可能会下降。FAO指出，全球主要海产品资源中约有四分之三已达最大产出潜力。国际市场对鱼类及其它形式的动物蛋白的需求不断增长。位于华盛顿特区的国际粮食政策研究院（该研究院隶属于一全球性农业研究网络）的一位高级研究人员克里斯多夫-德尔加多（Christopher Delgado）说，“直到现在，发展中国家人口饮食结构还是以淀粉为主，但这些国家的人们已开始寻求其它饮食资源”。
今日，鱼类是国际上最被广为交易的食品之一，2001年世界水产品总产值为560亿美元，其中开发中国家所占比例超过50％。而到2006年消费的养殖鱼总量为4550万吨，价
值约630亿美元。彭泽鲫作为我国主要推广的淡水鱼类，增加彭泽鲫的产量，不但可以满足国内市场需求，而且可以增加出口。
第五章社会效益和环境效益调查
5.1对社会发展作用
通过研究工作，寻找使彭泽鲫的胰蛋白酶的新转录本，提高鱼体的胰蛋白酶的活力，进而培养生态适应性广、抗逆强、增产明显的新的彭泽鲫的品种，提高彭泽鲫的产量同时，优化彭泽鲫的品种，在市场对彭泽鲫大量需求条件下，既可以满足市场的需求，同时可以增加养殖户的收入。同时，以这项技术为核心，通过进一步的市场的推广，为我省的彭泽鲫的遗传育种研究及养殖业的持续发展构建一个新的平台，为我省淡水养殖生物的遗传育种的深入研究，良种产业的发展起带动作用，对推动海水养殖业健康发展，具有深远的社会意义和战略意义。
淡水有鳍鱼类养殖在整个东南亚迅猛发展，对人类健康作出了重大贡献。“低价值池塘水产养殖的增长无疑改善了亚洲贫困人口的饮食结构”。德尔加多说，“水产养殖已成为改善营养结构的非常重要的手段”，“尤其是在亚洲”。
繁荣渔村经济、安定渔村社会，对沿海地区渔村经济之繁荣及社会安定有相当大的贡献，同时也带动相关产业的发展，对整体经济的发展具有正面作用。
5.2对资源利用情况
绝大多数人工饲养的鱼类——鲤科鱼、鲶鱼等——其食物结构主要是植物及极少比例的鱼粉。有的杂食性鱼类的饲料中含约3-10%的鱼粉。过滤摄食鱼类，如蛤、扇贝、及某些鲤科鱼种是完全食草的。相反，人工饲养的大马哈鱼的饲料中含35-45%的鱼粉及15-25%的鱼油。制成鱼粉的鱼往往个小，多油，是人们不愿食用的。无论是出于外观还是出于口味原因，这些鱼都是人们不愿意食用的。“没有人愿意吃步鱼，”他说，“你是用一些人们不愿意吃的东西，通过水产养殖，对这些资源加以利用，创造出一些人们确实想吃的东西”。同时，我们的实验将会提高鱼的生长速率，同时会提高鱼体的饲料的利用率，同等大小的鱼，具有转录本的鱼比正常的鱼可以节约大约10%的饲料。
5.3对人才培养情况
通过这个项目，我们预计培养一至两个硕士生
5.4对环境的影响及效益
鱼类养殖面临着严重的环境问题，随着水产养殖场数量增多，养殖场又想从现有资源获得更大的产出，鱼类疾病将成为重大问题之一，而且预计鱼病还将继续困扰水产养殖业。
但是这并不仅仅指鱼病的问题，同时还必须关注对付鱼病的管理技术。许多养殖场曾试图通过换水，将富含营养的废水排入毗邻河湾、海湾来治理带病菌的鱼塘。世界上许多河湾、海湾已被这些富含营养的废水所害，造成藻类疯长。其中，有的藻类还产生毒素。
最近，科学工作者改进了养殖方法，将水几乎全部保持在鱼场内，不向外排放，泵入的水也极少，称之为封闭系统。尽管所费不菲，亚洲的鱼农还是采用了这一方法，在鱼塘中安装充氧水车。这一技术有助于保持池塘内较高的氧气浓度，从而减少鱼的缺氧。水产养殖专家已经逐渐掌握了通过大量减少池塘换水量的方法控制疾病的爆发。越来越多的虾农坚持只从经严格检疫的孵化场购买无病毒的鱼苗。
大多数专家同意，通过正确选址，并采取适当的管理，鱼类养殖对生态几乎或完全不会造成损害。大型（资本雄厚的）养殖场已采取一系列措施来控制养殖对环境的影响及疾病的传播。这些措施包括对新养殖场的选择进行综合评估来确定水质及水源，土壤特性以及气候条件；避免在同一池塘内放养过量，以免造成缺氧；对发现有感染的池塘进行不排放隔离消毒，以卫生的方式处置死鱼；并使用经检疫的特殊种鱼。大型水产养殖场同时也隶属于水产养殖协会。通过协会，他们可得到技术支持，使其运作符合环境性经营法规。
资金不足的小型水产养殖场通常无法跟上现代化管理的步伐。鱼类养殖是一项风险极大的投资，“当养殖场缺乏资金时，他们就会偷工减料，尽管大量的小型水产养殖场对环境造成很大的损害，但他们往往缺乏改善运作所必需的最起码的信息。
提高胰蛋白酶的活力，增加饲料的转化率，可以有效地降低鱼体排泄废物中的营养成分的含量，降低废水中的营养含量，减少对环境的污染。