质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定
一、实验目的
1、学习和掌握限制性内切酶的特性
2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法
3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法
4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法
5、掌握α互补筛选法的原理
6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法
7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法
二、实验原理:
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA 分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养，可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建
酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）
连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶，它可以
连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。
2.感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA 导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以
E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。
3.重组子的筛选鉴定
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coliDH5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组
质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个PCR扩增，检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。
4.PCR技术
PCR（Polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，其原理类似于DNA的体内复制，又叫做“体外基因扩增”。反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程。这三个反应构成一个循环，反复进行。每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍，反复30次，特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106。通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。
现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的TaqDNA聚合酶，而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率。反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引物，一条称为下游引物或者反向引物。引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构，避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰，但是3’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的3’端要避开密码子的第三位。模板的浓度不能太大，dNTP的浓度为2.5mmol/L，金属离子的浓度为1.5mmol/L，缓冲液为pH 为7.2~8.0的Tris—HCl溶液。
二、实验材料：
1.菌株：E.coliDH5α
2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）
3.试剂材料：
酶切反应：（DNAPUC19质粒，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，λDNA。）连接反应：（酶切后的DNAPUC19质粒和λDNA，连接10×buffer，T4连接酶，重蒸水。）感受态细胞的制备：（0.1MCaCl2）转化：（连接液和感受态细胞，0.1MCaCl2，冰块。）
重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有RnaseA的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HBbuffer,DNAwashingbuffer，elutionbuffer）,酶切后的DNAPUC19质粒，试剂盒抽提的DNA，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。上样缓冲液，EB染液。
PCR检测：10×PCRbuffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，TaqDNA聚合酶，琼脂糖，TAE、溴化乙锭（EB）
4.仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖，1.5ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳槽，紫外仪，PCR扩增仪
三、实验步骤
载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测
（一）酶切
1、在两支Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如下：
2、在37℃恒温水浴锅中反应1h以上。
3.分别取上述酶切样品2~5uL，与1~2uL电泳上样缓冲液混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应是否彻底，剩余样品可以继续酶切。
4.待电泳观察酶切反应完全后，将剩余样品从恒温水浴锅中取出，置65℃恒温水浴锅中保存10~15min，终止酶切反应
5.样品可以直接进行酶切反应或者保存于-20℃冰箱备用
（二）连接
1、在Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下：
3、连接产物可用于转化实验。
（三）感受态细胞的制备
1、用接种环从含有E.coliDH5α的培养基平板上挑取少量灰白色E.coli菌落接种到20mlLB培养基里，37℃振荡培养过夜。实验均在无菌条件下，以防污染；
2、取37℃过夜培养物，此时的培养物较浑浊，颜色变深。按1%的接种量吸取200μl 转接到20mlLB培养基中，37℃振荡培养2.5~3小时；
3.分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中，5000rpm离心5min，弃上清液，吸干；重复收集菌体一次，使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的
1ml0.1mol/lCaCl，漩涡震荡使细胞悬浮混匀，冰上放置15min，4℃5000rpm离心5min；
4、弃上清液，吸干后，加入100ulCaCl悬浮冰浴至使用；上述方法制好的感受态细胞置于冰上，48h之内均可用于转化，分装成2x50ul和100ul三管。
（四）转化实验
1、取制备好并摇匀后的3管感受态细胞悬液，分别作如下处理：
（1）感受态细胞悬液50uL+pUC19质粒DNA1uL
（2）感受态细胞悬液50uL+DH5a
（3）感受态细胞悬液100uL+连接产物5uL
2、将以上各样品管轻轻摇匀，冰浴10min，在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上2~3min，质粒已经吸附到感受态细胞的表面，此时不能剧烈振荡，以增加转化效率；
3、向上述3管中分别加入450ul、450ul和900ul新鲜的LB培养基混匀后，37℃摇床培养1~2h，使受体菌恢复正常生长状态。
（五）稀释和涂布平板
1、无菌操作，将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：
⑴受体菌对照管：取50ul受体菌液分别涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基；
⑵pUC19质粒对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基；
⑶重组质粒转化组：取50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基
2、当菌液完全被培养基吸收后（大约10min）倒置培养皿，于37℃恒温培养24~36h，观察菌落生长情况（红白菌落法）。
（六）重组子的筛选与鉴定
1、取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板，在底部划线分成6个区域；
在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取6个单个的白色转化子，用接种针划线转接到平分成6份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上；37℃过夜培养；
2、在划线的6个单菌落中选取4个，分别接种到含有5ml带氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；
（七）试剂盒抽提重组质粒DNA及鉴定
1、分别取3ml菌液，用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA，具体步骤见说明书；
2.将pUC19质粒酶切及两组重组质粒酶切体系加入10*loadingbuffer，混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳1h左右。（1~2uL样品+1~2uLLB+1~2uL水）
注意事项
1.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
2.实验中所用塑料器材都必须是新的，并且经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程中要注意环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Ep管开盖的时间。
3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。且前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
4.Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
5.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程应在无菌条件下进行。
6.电泳时使用的缓冲液最好是现配现用，以免影响电泳效果。
7.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。制胶时要除去气泡。拔梳子时要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。
8.上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
9.溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应带上乳胶手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。
10.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害，对眼睛尤甚。观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜或眼罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。
11.实验中加样后应及时更换吸头，以避免试剂的污染。
12.PCR反应高度灵敏，应设法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR 管和吸头，反应加样区应与DNA模板制备区及PCR产物电泳检测区分开。13.PCR管单加样时，对于非常微量的样品一定将样品加在管壁上或者液体中，防止漏样。
14.实际操作时，为了防止少加样，可以保存每次用过的枪尖，通过数枪尖知道自己加到哪一步了。
五、结果与分析
1、pUC19质粒DNA酶切结果
目的基因与pUC19质粒载体酶切以后经过琼脂糖凝胶电泳，紫外成像如下：
从左到右各泳道分别为：
第1泳道：λDNA/HindIII；
第2、3泳道：λDNA及λDNA/HindIII；
第4、5泳道：pUC19质粒及pUC19/HindIII；
第6-15泳道：第1-10组的pUC19/HindIII样品；
第16泳道：pUC19/HindIII；
第17泳道：λDNA/HindIII；
我所在组为第9组，为第14泳道所电泳样品。
对比酶切时的Marker和商业酶切质粒，可知带①为线性pUC19质粒，带②基本上为未切开的双螺旋pUC19质粒。对比带①与带②可以发现，带①的亮度和宽度仅为带②的一半左右，所以说明有三分之二的双螺旋质粒没有被切开，具体原因可能为：酶切时间短；酶活性较低；酶切反应的buffer不合适等。
2、转化结果
质粒转化进入感受态细胞后，在培养基上进行涂布并过夜培养，第二天观察培养基培养情况。
表4平板内菌落的正确生长状况
但是我们组的平板内全部有很多菌落生长，可能原因有：
1.操作不当，涂布时有其他液体混入
2.氨苄失活
3、重组质粒的筛选与鉴定
（1）重组质粒进行酶切以后，进行琼脂糖凝胶电泳，得成像如下图（本组使用的重组质粒来自其他组）
从左至右各泳道分别为：
第1泳道：λDNA/HindIII；
第2泳道：pUC19质粒；
第3-22：第1-10组的重组质粒（R，R）；
我所在组为第9组，重组质粒为第19、20泳道。通过对比可以看出两个重组质粒连接的应该都是125bp的小片段
六、实验小结
1、总结与反思
⑴溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。⑵酶切反应的所有塑料制品（Eppendorf管、吸头等）必须是新的，并经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程不要求无菌，但要注意手和空气中杂酶的污染，因此要求环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Eppendorf管的开盖时间；
⑶感受态细胞必须从纯菌种开始。从划线纯化的单菌落开始，进行活化培养，不要使用多次转接或储存在4℃的培养菌液，其目的是为了保持菌株的纯度和活力；
⑷培养时间：过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：染色体断裂多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间；
⑸菌体的彻底悬浮：如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在SolutionII加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在SolutionIII加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源；
⑹使用相对过量的试剂：这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体；
⑺配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶，琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓；
⑻限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；
2、思考题
（1）从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全？
答：没有酶切的质粒处于超螺旋状态，因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带。单酶切后质粒处于线状，如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在，可以添加原质粒未酶切样品及同种质粒酶切完全样品做Maker，通过对比单酶切后的质粒条带是否单一及是否为线性进行判断。
（2）影响质粒DNA转化效率的因素有哪些？
答：准备用来制备感受的细菌的生长状态与密度，制备感受态时细菌应处于对数期或者对数前期；质粒DNA的数量、大小与构型，质粒DNA数量不应太多，而分子量越大的质粒转化效率越低，超螺旋质粒DNA的转化效率高于重组DNA，环状DNA转化效率高于线性DNA；进行转化所用的试剂的纯度、质量和器材的洁净程度；数否杂菌及外源DNA污染。
一、实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法； 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法； 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。 二、实验原理 1.PCR： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。 ①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链； ②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链； ③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法： A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。 4、琼脂糖凝胶电泳： A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法： (一)、材料 1、样品： 菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 2、试剂： LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul) 3、仪器与器材： PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 【实验原理】 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。 本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。 对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。 【实验步骤】 本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。 1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。 2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。 3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。 4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。 5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。 6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。 8. 重复上一步， 9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。 10. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。 11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）
实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机
2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的
质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应 ) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1). 碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；
B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2). 离心层析柱： A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度； A260/A280=1.8DNA 纯净 A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA 。
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验 一．实验目的 1．检验重组质粒的插入片段的大小 2．学习PCR技术的使用 二．实验原理 （一）重组质粒酶切鉴定 将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二）PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。 1.聚合酶链式反应原理 PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。 PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。 2．PCR的反应动力学 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA