xx日：
多酚氧化酶活性的测定。
一、试验目的
本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。
二、试验原理
酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
三、试验材料、试剂及试验用品
材料：
李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：
果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。
药品：
预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚
４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）
四、实验方法：
1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。
2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。
3.
最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：
以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。
4.
多酚氧化酶酶活的计算公式：
E=M×60/V(式1)式中：
M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
毕业论文文献综述 生物工程 多酚氧化酶活性测定及控制 1 前言 多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。 2 主题部分 2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例） 2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。【1】 2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。【2】 2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性
实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O 2 ——————→ 邻醌＋ H 2 O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L －1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min 内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力以每min内A 525 和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
朴东日：多酚氧化酶活性的测定。一、试验目的 本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原 理及操作技术。 二、试验原理 酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色 的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生 变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 三、试验材料、试剂及试验用品 材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发 育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯 处理。 药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ １ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚 ４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４） 四、实验方法：
1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。 2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。 3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。 4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
江南大学-食品化学实验讲义茶葉多酚氧化酶的活性測定 茶葉多酚氧化酶的活性測定 一、目的要求 通過實驗，掌握茶葉多酚氧化酶活性的測定方法。 二、基本原理 茶葉多酚氧化酶是茶樹體內最重要的酶類之一，它不僅在茶樹生理代謝 過程中起著重要作用，而且在茶葉加工，尤其在紅茶製造過程中，催化 多酚類物質的氧化也起著主導作用。 多酚氧化酶的活性檢測方法，包括檢壓法、分光光度法、氧電極法和滴 定法等。多酚氧化酶是一種含銅的氧化酶，在一定的溫度、pH條件下， 有氧存在時，能使催化鄰苯二酚氧化生成有色物質，單位時間內有色物 質在460nm處的吸光度與酶活性強弱成正相關，即可計算出多酚氧化酶 的活力和比活性。反應式如下： 多酚氧化酶 鄰苯二酚（兒茶酚）＋1∕2 O2——————→ 鄰醌＋ H2O 三、材料、儀器及試劑 1、材料：茶樹鮮葉。 2、儀器：721型分光光度計；離心機；恆溫水浴；研缽或勻漿機；試管；移液管；紗布袋等。 3、試劑：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸緩衝液（pH6.5）；硫酸銨；1%鄰苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。 四、操作步驟 1、粗酶液的製備 稱取洗盡茶樹鮮葉5.0g於研缽（或勻漿機）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡 咯烷酮（事先用蒸餾水浸洗，然後過濾以除去雜質）和100ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液,磨成勻漿，用幾層紗布袋過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，
離心除沉澱，上清液再加硫酸銨使達60％飽和度，離心收集沉澱。將所 得沉澱溶於2~3ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液中，即為粗製酶液。 2、活性酶的測定 取酶液1ml於離心管中，加入3ml反應混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸緩 衝液，0.6ml 1%鄰苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恆溫水 浴中保溫10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml終止反應。 4000rpm離心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波長處，在1~2min內測定吸光度值（A）。空白對照用緩衝液代替反應液中的鄰 苯二酚，其它條件相同。 五、酶活性的計算 以每克樣每分鐘內A460增加0.1為1個酶活力單位。 A460×酶提取液總量（ml） 酶活力（0.1A?g-1?min-1）＝—————————————————————————— 0.1×反應時間（min）×樣品鮮重（g）×測定時酶液用量（ml） 六、注意事項 1、反應混合液必須現配現用，否則會因鄰苯二酚自動氧化而失效；鄰苯 二酚還可用兒茶素代替。 2、脯氨酸是用作有色氧化產物形成的穩定劑和加速劑。
多酚氧化酶特性研究 摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。 关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。1材料与方法 1.1材料 板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。 1.2试剂与仪器 主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。 主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。 1.3试验方法 1.3.1粗酶液的制备 酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。 1.3.2褐变度( BD) 的检测 称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL 甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。 将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。 1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测 称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。 1.3.4酶活性的测定 取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用
货号：QS1404 规格：50管/24样 多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。 测定原理： PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃避光保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。 5min 第1页，共2页
实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时） 一、目的要求 1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。 2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。 二、基本原理 茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。 多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O 三、仪器及试剂 1、材料：茶树鲜叶。 2、仪器：721型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）；硫酸铵；1%邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。 四、操作步骤 1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴中保温10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。4000rpm离心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波长处，在1~2min内测定吸光度值（A）。空白对照用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚，其它条件相同。 五、结果计算 以每克样每分钟内A460增加0.1为1个酶活力单位。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
实验二苹果中多酚氧化酶最适pH 的测定 一、实验原理 存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。一是一元酚羟基化，二是邻-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻-二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂：0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮 仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机 三、实验步骤 1、从苹果中萃取多酚氧化酶 将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和400mL左右预先冷冻至－26℃的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。将所得丙酮粉转移至150 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌30 min，然后离心（4℃,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。 2、不同pH下多酚氧化酶活力的测定 在比色皿中分别加入1.8~1.1 mL pH为3.6的缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，搅匀后加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400 nm 下的吸光值随时间的变化，参比以缓冲液代替酶液。依次测定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0几个pH。
多酚氧化酶活性测定 实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下: 多酚氧化酶 邻苯二酚(儿茶酚)，1?2 O ——————? 邻醌， HO 2 2 三、材料、仪器及试剂 1. 材料:马铃薯块茎等 2. 仪器:UV,1206或UV,1240分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵或匀浆机;试管;移液管;纱布袋等。 ,13. 试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP);0.01mol?L pH 6.5磷酸缓冲液;0.1m mol?L,1,1pH6.5磷酸缓冲液;0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液;30%饱和度硫酸 铵;0.1 ,1mol?L儿茶酚; 20,三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏,1水浸洗，然后过滤以除去杂质)和100ml 0.1mol?LpH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加,1
硫酸铵使达60,饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2,3ml 0.01mol?L pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定 ,1,1在试管中加入3.9ml 0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol?L 儿茶酚在37?恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液(可视酶活性增减用量)，迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1,2min内测定吸光度变化(A)值。 五、酶活性的计算 以每min内A值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力525 和比活性。 A 酶提取液总量(ml) ,1 酶活力(0.01A?min),———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量(ml) A 酶提取液总量(ml) ,1酶的比活性(0.01A?gFw?min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量(ml) 公式中:A —为反应时间内吸光度的变化值;W为样品鲜重(g)。
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法 （一） 试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。 2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。 3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。 4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。 贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。 贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升） 5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配） 方法： 1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。 2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。 3、结果计算：A多酚=0.44{[⑥-(④+⑤)/2]-[③-(①+②)/2]}*V1/V2/W/t V1：提取时酶液总量（毫升）V2：测定时酶液用量（毫升） ①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升） t：酶反应时间（分） 2 4 2 2 同上 3 4 2 2 1 空白测定 4 4 2 1 2 测多酚氧化酶 5 4 2 1 2 同上 6 4 2 1 2 1 空白测定
多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚微板法) 简介： 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体 Leagene 多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)检测原理是以邻苯二酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪420nm 处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的多酚氧化酶活性，尤其适用于检测水果中多酚氧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、研钵或匀浆器 3、离心管或试管 4、低温离心机 5、酶标板 6、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、准备样品： ①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的PPO Lysis buffer 研磨或匀浆，10000g，4℃离心，留取上清液，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PPO Lysis buffer 进行适当匀浆，10000g，4℃离心，取上清液，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 编号 名称 TE0427120T Storage 试剂(A):PPO Lysis buffer 500ml 4℃避光试剂(B):PPO Assay buffer 5ml 4℃避光使用说明书 1份
邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性 试剂配制 (1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。(3)0．5N盐酸。(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5N HCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。 (5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 2。投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正 没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在 无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。 3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。 多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克 数表示。 我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（ 配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，
曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、 总酚含量和丙二醛含量的测定方法 1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定 1.1基本原理： 多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。 1.2实验试剂和仪器： a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL） b．试剂 1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。 取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。 2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。 3）50mmol/L邻苯二酚溶液 取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。 1.3实验步骤 1）酶液制备 称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 2）活性测定 取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液加蒸馏水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μL 酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 1.4数据处理： 记录反应体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 梨、苹果、马铃薯等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3．50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 （二）活性测定 取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1．将测定的数据填入下表
植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定 在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。 植物超氧化物歧化酶活性测量
多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法) 产品简介： 多酚氧化酶(polyphenol oxidase ，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。 Leagene 多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)检测原理是以邻苯二酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的多酚氧化酶活性，尤其适用于检测水果中多酚氧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 研钵或匀浆器 3、 离心管或试管 4、 低温离心机 5、 比色杯 6、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的PPO Lysis buffer 研磨或匀浆，离心，留取上清液，冻存，用于多酚氧化酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 编号 名称 TE0429 60T Storage 试剂(A): PPO Lysis buffer 500ml 4℃ 试剂(B): PPO Assay buffer 25ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
第25卷第1期2005年1月 云南师范大学学报 Journal of Y unnan N ormal University V ol.25N o.1 Jan.2005植物多酚氧化酶活性测定方法的改进Ξ 李忠光, 龚 明 (云南师范大学生命科学学院,云南昆明650092) 摘 要: 文章介绍了多酚氧化酶反应产物邻醌的吸收光谱和酶测定反应的动力学分析,确定了邻醌的最高吸收光谱和酶测定的适宜参数。这一测定方法与原方法[1]相比,提高了多酚氧化酶测定的准确性、重复性和可比性,使灵敏度提高了5倍。 关 键 词: 改进;多酚氧化酶;动力学曲线 中图分类号: O946.5 文献标识码: A 文章编号: 1007-9793(2005)01-0044-02 多份氧化酶(P olyphenol oxidase,PPO)是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶[2,3],它包括单酚氧化酶[酪氨酸酶(tyrosinase), EC.1.10.3.2]、双氧化酶[儿茶酚氧化酶(catechol oxidase),EC.1.10.3.2]、漆酶(laccase,EC.1.10.3. 1)[4,5]。它可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应的醌类物质[6,7]。醌类物质对病原微生物起着抑制作用或杀伤作用,具有一定的抗病能力。因此,在感病的植物体中,PPO活性都有不同程度的提高,以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织[4,5]。此外,PPO对食品和饮料生产也会产生重大影响,它不仅影响食品和饮料的色泽,也影响其品质,特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出[8,9]。所以,准确测定PPO活性,具有重要的生理和现实意义。 PPO常用的测定方法有比色法[1]和氧电极法[6],本文通过对比色法的改进,极大地提高了PP0测定的准确性、重现性和可比性,使灵敏度提高了5倍。 1. 材料的准备和处理方法 1.1植物材料的培养和选购 挑选饱满的玉米(Z ea Mays)品种大黄的种子,以0.1%HgCl2消毒10min后,漂洗干净,于26.5℃下吸涨12h,播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘(24cm×16cm)中,于26.5℃下黑暗中萌发60h。随后,于同样的温度下继续培养10天,每天光照16h和不断补充蒸馏水。苗龄为12.5天的玉米幼苗根系作为PPO测定材料。 另一种材料为马铃薯块茎,品种为H-6,购自昆明市种子公司。 1.2酶液的提取 酶液的提取按朱广廉[1]方法。 1.3PPO反应产物吸收光谱分析 马铃薯块茎PPO与底物反应后,加入20%三氯乙酸终止反应。反应产物用UNIC-2000分光光度计于波长400～550nm下每隔2nm测定光密度。 1.4PPO测定反应的动力学分析 马铃薯块茎PPO与底物反应后,在不同时间段检测两个波长410nm和525nm下的光密度。取0～3min时间段,即3min反应时间来计算酶活性,并且用光密度变化0.01个单位所需要的酶液量作为一个活力单位(U)。 2. 结果与分析 PPO与邻苯二酚反应的反应产物邻醌用U2 Ξ收稿日期:2004-04-06 基金项目:国家自然科学基金(3986000),云南省自然科学基金(98C002Z) 作者简介:李忠光(1971-),男(彝族),云南省永德县人,实验师,主要研究方向为植物逆境生物学. 通讯作者:龚 明