亲和色谱的分离技术
摘要本文主要对亲和色谱的相关信息如起源发展、分类、应用、前景等做了介绍。重点介绍了亲和色谱的分类以及不同的亲和色谱的原理特点以及应用。
关键词亲和色谱起源发展；亲和色谱分类；亲和色谱应用；亲和色谱前景
前言亲和色谱在就是把与目的产物具有特特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。如今，很多研究学者研究不同类型的亲和色谱。冯文科等［1］介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法，并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展；赵胜利等［2］介绍了固定金属离子亲和色谱(IMAC)吸附蛋白质的基本原理、蛋白质吸附与解吸的影响因素以及洗脱过程中需要注意的问题，并简述了IMAC今后研究的方向；孙维敏［等3］研究抗体纯化中亲和色谱配体的进展；庄海宁［4］研究免疫亲和色谱的原理及其在食品安全检测中的应用；王迪等［5］研究免疫亲和色谱及其在兽药残留检测中的应用；王继华等［6］阐述了免疫亲和色谱技术生化提纯可溶性核糖核蛋白SSA抗原、SSB抗原的特点，同时展望了免疫亲和色谱的发展状况；贾凌云等［8］研究亲和色谱仿生配基在筛选和设计方面的进展；苏成芝等［10］制备了Trypsin Sepharose 4B亲和层析柱，采用硫酸铵、三氯醋酸沉淀、离心色谱、降冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，测定各步中的活性；钱俊青［11］等应用前沿亲和色谱研究分子间相互作用及其应用。
本文主要介绍亲和色谱的发展、原理、分类以及各种亲和色谱的特点以及应用，还有其前景发展。
1、亲和色谱的起源和发展
1910年Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上研究了抗体和抗原的相互作用并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密；
1924年Engelhardt提出固定配偶原理作为分离生物活性物质的方法；
1933年Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从淀粉酶中分离出淀粉酶；
1951年Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上用以纯化抗体；
1953年Lerman将偶氮染料固定在纤维素上纯化蘑菇中的络氨酸酶；
1954年GrubhoferSchleith为应用目的将羧肽酶淀粉酶胃蛋白酶核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上；
1959年Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中使亲和色谱得到快速发展；
1963年Merrifield提出固相肽合成方法为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径；
1964年Hjerten研制出球形琼脂糖它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质；
1967年AxenPorthErnback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法为多肽蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法；
1968年Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念扩展亲和配位体范围包括酶抗原半抗原抗体激素维生素外援凝集素糖蛋白膜蛋白病毒细胞等确立了生物特效亲和色谱方法；
1970年Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法并提出在固相基体和配位体之间插入空间间隔壁的概念和方法成功的解决了配位体的立体可接受性问题对亲和色谱的发展做出了突破贡献；
1972年Yon提出利用在水溶液中非极性官能团之间的接触组合来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法Wulff提出了印迹分子色谱法；
1973年Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体SpheronBrocklehurst提出用2吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法Hayman用亲和色谱法分离细胞；
1974年Epton提供聚丙烯酰吗啉载体EnzacrylEasterday提出用三苯甲烷染料作配位体的染料配位色谱方法；
1975年Kristeinsen用亲和色谱法分离病毒；
1977年Porath提出用24二硝基苯作配位体的电荷转移色谱方法；
1978年Porath提出用金属离子螯合物作配位体的定位金属离子亲和色谱方法Ohlson 提出以大孔微粒硅胶作载体的高效液相亲和色谱法；
1980年到1990年CD冠醚穴醚杯芳烃大环抗生素用作亲和包合配位体发展包含了配合物亲和色谱方法Armstrong首先应用包合配合物亲和色谱方法；
1990年到2000年新型载体获广泛应用如灌注色谱固定相Poros无极氧化物ZrO2TiO2CeO2WO3及杂化材料ZrO2脲醛树脂复合微球；
如今，亲和色谱已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。通过人们不懈的研究，利用亲和层析技术已成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品。该技术的最大优点在于：利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质，它有效地集合了化工与生物技术，是生物化工的重要发展方向。
2、亲和色谱的原理以及基本过程
2.1 亲和色谱的原理
亲和色谱也称为亲和层析，是色谱分离技术的重要分支，是一种利用固定相的结合特性来吸附目标产物，而达到分离纯化的液相色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连续与待分离的物质有一定结合能力的分子，涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引力、络合作用以及空间位阻效应等作用力因素，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的集团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质的一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。
2.2 亲和色谱的基本过程
（1）配基固相化将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在水不溶性载体上制成亲和吸附剂后装柱
（2）亲和吸附将含有纯化对象的混合物通过亲和柱纯化对象吸附在柱上其他物质流出色谱柱
（3）解吸附用某种缓冲液或溶液通过亲和柱把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来
如果分离的目的是去除溶液中某种分子那么只要分子能与介质结合即可可以不必进行洗脱
3、亲和色谱的分类
按照分离原理可以分为免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱以及拟生物亲和色谱。
3.1 免疫亲和色谱（IAC）
3.1.1 IAC的原理
免疫亲和色谱的应用出现在上世纪八十年代末，是一种将免疫反应和色谱分析方法相结合的分析方法。它是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上，从而有效地分离和纯化各自互补的免疫物质。该法基于免疫反应的基本原理，利用色谱的差速迁移理论。首先，将抗体与惰性微珠共价结合，然后填入柱中，再将含有抗原的溶液过免疫亲和柱，抗原与固定的抗体结合，其它成分则直接沿柱流下，最后再用合适的洗脱剂将待测组分洗脱下来，而得到纯化的抗原。
3.1.2 IAC的特点
（1）专属性：IAC是利用抗体一抗原的专属性反应实现分离纯化的，只有具有特征决定簇的分析物才能与IAC柱上固定的抗体发生特异性的结合，因此，制备高纯度的抗体(如单克隆抗体)以及具有多个活性位点的抗体可以提高结合抗原时的选择性；
（2）高效能：其高效能首先体现在它能成百上千倍的提高样品的纯化率，还体现在可以缩短分析时间，提高分析效率，另外，IAC柱可以再生，大大提高了其利用效率。影响IAC效率的主要因素有：柱容量，基质的选择，基质的活化与抗体的偶联，抗原抗体结合能力及流动速率与柱压；
（3）灵敏度高：生物样本分析中，样品浓度通常较低，故分析方法的高灵敏度是首先要考虑的。
3.1.3 IAC的应用
现今，免疫亲和膜的应用主要在以下两个方面：1)抗体的分离纯化，免疫亲和膜主要应用于从多种免疫球蛋白的混合物中，如从免疫的动物血清中，提取某一特定的组分，此法快速简便，能获得特异性很强的抗体。目前，多种抗体采用硝酸纤维素(NC)膜进行分离纯化。2)快速诊断测试，将特异性的抗原(或抗体)以条带状固定于膜材料上，将胶体金标记试剂吸附在结合垫上。当待测样品(血清或尿液)加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解固化在结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原(或抗体)的区域时，待测物和金标记试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果，而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。此外，庄海宁等在食品检测、兽药残留检测以及核糖核酸蛋白等中发挥着不可替代的作用。
3.2 金属亲和色谱（IMAC）
3.2.1 IMAC的原理
主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而实现分离蛋白质的目的。
3.2.2 IMAC的特点
(1)配基稳定性高，不易脱落；
(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低；
(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附；
(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑、EDTA便可将吸附蛋白解吸下来。影响蛋白质与金属螯合柱作用的因素很多，主要有金属离子和蛋白质表面配体的性质、溶液pH、离子强度和其它竞争配体等。
3.2.3 IMAC的应用
IMAC在生物大分子研究中的应用表现在两方面：蛋白质的识别和分离纯化。赵胜利等研究蛋白质在固定金属离子亲和色谱中吸附与洗脱的一些情况。
3.3 拟生物亲和色谱
近几年发展起来的仿生亲和小分子配基新技术，其要旨为：对需要纯化的目标蛋白，在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基，然后将其固定到支持介质上，这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定，特异性及重复性更好。主要代表为染料配基亲和色谱和多肽亲和色谱。
3.4 分子对亲和色谱
分子对亲和色谱是利用生物分子对之间专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的一种亲和层析方法。
3.5共价亲和层析
共价亲和层析是生物分子中的功能性集团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种分离层析方法。可以用于纯化牛乳巯基氧化酶，从大肠杆菌培养液中纯化青霉素酰化酶等。
3.6 疏水层析
疏水层析是生物分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的疏水键结合的一种亲和层析方法。
3.7 凝集素亲和层析
凝集素亲和层析是利用生物分子中的功能性基团与层析剂上的凝集素配基形成可逆性亲和结合的一种亲和层析方法。
4、亲和色谱的应用
不管哪种亲和色谱的方法，在蛋白质纯化和蛋白质的识别、兽药残留检测、食品安全检测、固定金属、抗体等方面都起着重要作用。
5、亲和色谱前景
亲和色谱技术发展至今已具备了比较完整的体系，它以其高选择性和可逆性开创了生化分离的新纪元，并在这一领域独领风骚。但不可否认的是，该项技术并非尽善尽美，必须一步一步去的完善。，膜亲和色谱正以更快的速度在发展。有人称：“膜的表面改性技术领导膜进入了9O年代”；“未来的lO年将是产生新的更为先进的第三、第四代膜的时代”。这里所指的第三、第四代膜就是包括亲和膜在内的各神化学改性膜。无疑和国外一样，膜亲和色谱技术今后也将在我国获得进一步的发展，得到更广泛的应用，产生更大的经济和社会效益，逐渐成为一种新的生物大分子纯化分离的重要手段。
讨论
亲和膜分离的操作过程，开始阶段一般都是手动、分步操作从平衡、上样到洗涤洗脱、清洗要数十分钟到数小时。近些年来，随着微处理机的使用，整个分离过程可在微处理机控制下，实现全盘自动化操作。一次循环的分离时间有些可缩短到几分钟内完成无论是输减泵，切换阀、膜分离器，还是检测器、馏分收集器等的性能都有了很大改进膜分离器形状已由最初单一的板式发展成板式、卷式、中空纤维多种形式，体积也越来越小。中空纤维式由于有很高的样品负荷容量，又可在较低的压力下操作，对于大规模的纯化分离是最有发展前途的一种。但是由于制作困难、价格昂贵。目前还用得较少［7］。国外对亲和膜和分离装置的制作方法几乎都列为专利，严加保密。自80年代以来，随着我国膜分离技术的迅速发展和在生物、医药领域中的逐步应用，膜的表面化学改性研究也已起步。研制成功了胰蛋白酶改性聚砜膜，并利用膜亲和色谱技术对胰蛋白酶抑制剂进行了纯化分离，引起了许多国家生物医药界专家的兴趣和关注。
参考文献
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亲和色谱 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点： 具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。 所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。 特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。 亲和色谱的基本过程： 把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。目的物质被吸附，杂质直接流出。变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。 亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系 ①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子； ②抗体：抗原、病毒、细胞； ③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白； ④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞； ⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白； ⑥细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。 亲和色谱操作中的洗脱方法 在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。 普通洗脱法：与其他色谱分离方法一样，可以通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。 专一性洗脱法：是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。一般说来，专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。 但是，专一性洗脱剂的价格都比较昂贵，所以常与普通洗脱条件配合作用。 离子交换色谱 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
第三章气相色谱分离技术 第一节气相色谱系统 气相色谱法是一种很重要的，以气体为流动相，以液体或固体为固定相的色谱方法，气相色谱法（GC）有以下特点： （1）高选择性GC能够分离分析性质极为相近的物质。如氢的同位素，有机物的异构体。 （2）高效GC可在较短的时间内同时分离分析极其复杂的混合物。如用空心毛细管柱一次可以分析轻油中的200个组分。 （3）高灵敏度由于使用了高灵敏度的检测器，可以检测10-11-10-13克物质。检测浓度可达到ppt级。 （4）分析速度快GC一般只要几到几十分钟的分析时间，某些快速分析，一秒可以分析十几个组分。 GC法的应用相当广泛，在一千万个化合物中，大约有20%的物质可以用GC方法进行分析，如： 生物化学分析：GC一开始就是用于生物化学领域，气-液GC的创始人Martin首先进行了脂肪酸和脂肪胺的分析。 石油化工分析：用200m的毛细管GC法一次可以分析200个化合物。 环境分析：如水中有机物分析。 食品分析：如粮食中残留农药的分析。 药物临床分析：氨基酸、兴奋剂的分析。 法庭分析：各种物证鉴定。 空间分析：如飞船中气氛分析。 军工分析：如火药、炸药分析。
图3-1是GC的流程示意图。 9 图3-1气相色谱流程示意图 1—高压瓶，2—减压阀， 3—净化器，4—气流调节阀，5—进样口，6—气化室，7—色谱柱，8—检测器， 9—记录仪 气相色谱仪的种类很多，但主要由分离系统和检测系统组成。 3.1.1 分离系统 分离系统主要由气路系统、进样系统和色谱柱组成，其核心为色谱柱。 1.气路系统 气路系统指流动相载气流经的部分，它是一个密闭管路系统，必须严格控制管路的气密性，载气的惰性及流速的稳定性，同时流量测量必须准确，才能保证结果的准确性。载气通常用N2，He，H2，Ar等。 2.进样系统 进样系统包括进样装置和气化室。气体样品可以用注射器进样，也可用旋转式六通阀进样。气化室必须预热至设定温度。 3.色谱柱
色谱分离技术的应用与研究进展 摘要：色谱技术作为分离分析的重要方法之一，是分析化学中最富活力的领域之一，能够分离物化性能差别很小的化合物,对蛋白质进行高效率和高灵敏度分离分析研究,在我国工业生产中具有广泛应用,也是生命科学研究的热点领域之一。本文综述了色谱技术的原理，色谱技术的分离以及色谱技术在医药、精细化工以及现代色谱技术在蛋白分离和分析中最新应用及进展，并介绍了几种常见色谱技术以及近期发展起来的一些新型色谱技术的研究进展及应用。 Abstract：One important method of chromatographic analysis technique as separation was one of the most vibrant areas in analytical chemistry ，which can isolate compounds with very small performance difference，high efficiency and high sensitivity for protein separation and analysis research，has a wide range of applications in China's industrial production，and it was one of the hotspot in the field of life science research．the application progress in pharmaceuticals，fine chemicals and The recent applications and development of modem chromatographic technique in protein separation and analysis were introduced concisely，prospects the development of chromatographic techniques．The research progress of several common and the recently emerged chromatography technology were elaborated． 关键词：色谱技术；应用；进展；蛋白质分离 Key words：chromatographic technique；application；progress；protein separation 一、引言 色谱这一概念首先由俄国著名植物学家Tswett提出，在研究植物色素组成时发现了色谱分离的潜力，首次提出了色谱法这一概念。色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一。作为一种物理化学分离分析的方法，色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一，能够分离物化性能差别很小的化合物。当混合物各组成部分的化学或物理性质十分接近，而其他分离技术很难或根本无法应用时，色谱技术愈加显示出其实际有效的优越性。它主要利用复杂样品本身性质的不同，在不同相态的进行选择性分配，以流动相和固定相的相互位移对复杂样品中的单一样品进行分类洗脱，复杂样品中不同的物质会以不同的洗脱速度在不同的时间上脱离固定相，最终达到分离复杂样品的效果。色谱不仅是一种分析的手段，也是一种分离的方法。色谱分离技术是一类分离方法的总称，包括吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等，广泛应用于生化物质分离的高度纯化阶段，具有高分辨率的特点。色谱分离技术是生化分离技术这门课程中的一个分离单元，属于生物工程下游技术的范畴。色谱技术最初仅仅是作为一种分离手段，直到20世纪5O年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等生命科学和制备化学领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段。在色谱技术的发展过程中，提出众多理论，推动了色谱技术的不断发展。主要有踏板理论，平衡色谱理论，速率理论，双模理论和轴向扩散理论。 二、色谱技术分类
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]： 1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。 近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。 入射光 散射光 图9-1光散射现象 9.1 基本原理 9.1.1凝胶渗透色谱分离原理 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分
色谱技术简介 发布者：杭州科晓化工仪器设备有限公司发布时间：2007年1月30日 Audo look6.0下载引言 色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的 色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。其后的一个重大进展是1941年Martin和Synge 发现了液－液（分配）色谱法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，简称LIC]。他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在两相之间分配。Martin和Synge 因为这一工作而荣获1952 年诺贝尔化学奖。在使用柱色谱的早期年代，可靠地鉴定小量的被分离物质是困难的，所以研究发展了纸色谱法（Paper Chromatography，简称PC）。在这种“平面的”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而发展了薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，简称TLC），在这种方法中，分离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。 在Stah－l于1958年进行了经典性的工作将技术和所用材料加以标准化之后， 薄层色谱法方赢得了声誉。为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的分离效率，可以向纸或板施加电场。这种改进了方法分别称作纸上电泳或薄层电泳。 新近发展起来的色谱法 气相色谱法是Martin和James于1952 年首先描述的，现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种方法，它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体，即便对于很复杂的混合物，其分离时间也仅为几分钟左右，这已属司 空见惯。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规 方法。近年来，因为新型液相色谱仪和新型柱填料的发展以及对色谱理论的更深入了解，又重新引起对密闭柱液相色 谱法的兴趣。高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）迅速成为与气相色谱法一样广泛使用的方法，对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的试样来说，高效液相色谱法常常是更可取的。 色谱法分类 色谱法有多种类型，也有多种分类方法。 （一）按两相所处的状态分类 液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquid chromatograp-hy）；用气体作为流动相，称为“气相色谱”（gas chromatogr-aphy）。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相，所 以层析法按两相所处的状态可以分为： 液－固色谱（liquid-solid chromatography） 液－液色谱（liquid-liquid chromatography）
一、液-固色谱原理 液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术，柱色谱属于液-固吸附色谱。 当混合物溶液加在固定相上，固体表面借各种分子间力（包括范德华力和氢键）作用于混合物中各组分，以不同的作用强度被吸附在固体表面。 由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。 二、柱色谱分离条件 （1）固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。
吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为： 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4～4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。
吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。 吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的在重叠，适得其反。 （2）流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。 展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。 当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。 三、柱色谱分离操作
蛋白质色谱分离方法 摘要蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。依据蛋白质的物理、化学及生物学特性，已有多种分离手段，如：超滤法、SDS-PAGE、亲和层析等，其中，液相色谱分离技术由于具有重复性好、分辨率高等优势在蛋白质分离检测中得到了广泛的应用。 关键词高效液相色谱高效离子交换色谱反相高效液相色谱高效凝胶过滤色谱高效亲和色谱 一、引言 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质完全的从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。 1、蛋白质纯化的总战略考虑 蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收率至少达到90%以上。然后进一步作精纯化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，同时要使样品的体积得到充分浓缩，一般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的体积大大缩小，便于下一步精纯化。而且每一步都要做电泳判断纯化效果。 2、蛋白质分离纯化技术的选择 要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列，以及蛋白质的空间结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息，根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异，利用一种或多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择最佳的蛋白质提纯方法。 二、色谱技术简介 1、色谱分离技术基本概念 色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。当流动相中携带的混合物流经
色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理：由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法：色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9 107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。 液相色谱法 气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。 原理和分类 液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法。 液固吸附色谱 高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有
第十四章色谱法分离原理 一．教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二．重点与难点 1.塔板理论，包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三．教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四．学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有
碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（G C） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（G S C）和气液色谱（GL C）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（L SC）和液液色谱（L LC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SF C）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CB PC）. 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。
亲和色谱的分离技术 摘要本文主要对亲和色谱的相关信息如起源发展、分类、应用、前景等做了介绍。重点介绍了亲和色谱的分类以及不同的亲和色谱的原理特点以及应用。 关键词亲和色谱起源发展；亲和色谱分类；亲和色谱应用；亲和色谱前景 前言亲和色谱在就是把与目的产物具有特特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。如今，很多研究学者研究不同类型的亲和色谱。冯文科等［1］介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法，并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展；赵胜利等［2］介绍了固定金属离子亲和色谱(IMAC)吸附蛋白质的基本原理、蛋白质吸附与解吸的影响因素以及洗脱过程中需要注意的问题，并简述了IMAC今后研究的方向；孙维敏［等3］研究抗体纯化中亲和色谱配体的进展；庄海宁［4］研究免疫亲和色谱的原理及其在食品安全检测中的应用；王迪等［5］研究免疫亲和色谱及其在兽药残留检测中的应用；王继华等［6］阐述了免疫亲和色谱技术生化提纯可溶性核糖核蛋白SSA抗原、SSB抗原的特点，同时展望了免疫亲和色谱的发展状况；贾凌云等［8］研究亲和色谱仿生配基在筛选和设计方面的进展；苏成芝等［10］制备了Trypsin Sepharose 4B亲和层析柱，采用硫酸铵、三氯醋酸沉淀、离心色谱、降冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，测定各步中的活性；钱俊青［11］等应用前沿亲和色谱研究分子间相互作用及其应用。 本文主要介绍亲和色谱的发展、原理、分类以及各种亲和色谱的特点以及应用，还有其前景发展。 1、亲和色谱的起源和发展 1910年Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上研究了抗体和抗原的相互作用并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密； 1924年Engelhardt提出固定配偶原理作为分离生物活性物质的方法； 1933年Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从淀粉酶中分离出淀粉酶； 1951年Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上用以纯化抗体； 1953年Lerman将偶氮染料固定在纤维素上纯化蘑菇中的络氨酸酶； 1954年GrubhoferSchleith为应用目的将羧肽酶淀粉酶胃蛋白酶核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上； 1959年Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中使亲和色谱得到快速发展； 1963年Merrifield提出固相肽合成方法为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径； 1964年Hjerten研制出球形琼脂糖它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质； 1967年AxenPorthErnback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法为多肽蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法； 1968年Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念扩展亲和配位体范围包括酶抗原半抗原抗体激素维生素外援凝集素糖蛋白膜蛋白病毒细胞等确立了生物特效亲和色谱方法； 1970年Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法并提出在固相基体和配位体之间插入空间间隔壁的概念和方法成功的解决了配位体的立体可接受性问题对亲和色谱的发展做出了突破贡献； 1972年Yon提出利用在水溶液中非极性官能团之间的接触组合来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法Wulff提出了印迹分子色谱法； 1973年Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体SpheronBrocklehurst提出用2吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法Hayman用亲和色谱法分离细胞；
基本原理 毛细管电色谱(Capillary electrochromatography, 简称CEC)是在毛细管中填充或在管壁涂布、键合液相色谱的固定相,然后在毛细管的两端施加高压直流电，在电场作用下产生电渗流(Electroosmotic flow ，简称EOF）,流动相在电渗流的驱动下通过色谱柱。对中性化合物，其分离过程和HPLC类似，即通过溶质在固定相和流动相之间的分配差异而获得分离；当被分析的物质在流动相中带电荷时，除了和中性化合物一样的分配机理外，自身电泳淌度的差异对物质的分离也起相当的作用。 毛细管电色谱（capillary electro chromatography，CEC）以内含色谱固定相的毛细管为分离柱，兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理，既可分离带电物质也可分离中性物质。毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。 因此，毛细管电色谱法可以说是HPLC和HPCE 的有机结合，它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展，而且柱内无压降，使峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效，同时还具备了HPLC 的选择性。 HPLC是用压力驱动流动相。流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。流速在管中呈抛物线轮廓，因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。而CEC是采用电场推动流动相。其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的，因而在毛细管中几乎没有流速梯度。谱带展宽效应相应的就十分小。这点是CEC与HPLC的本质差别，也是CEC
效率高于HPLC的根本。 依靠电渗流（EOF）和电渗流结合压力流推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而达到分离分析。 仪器设备: 毛细管电色谱的早期研究是在改装的CE商品仪器上进行的，随着研究的深入和对研究前景的良好预期，现在已有商品仪器既可进行电泳模式也可方便地进行电色谱研究。目前，主要是Beckman 公司的P/ACE 系列和HP公司的HP3D系列。检测器根据分析样品性质的不同，可选UV 检测器( 包括DAD ) 、电化学检测器、LIF 及CE－MS等。 类型：在毛细管电色谱（CEC）中，色谱柱是电色谱的心脏，按照固定相的装填方式不同可以分为[7]：填充毛细管电色谱(PCCEC)，开管毛细管电色谱(OTCEC)，整体式毛细管电色谱(MCEC)。PCCEC是将固定相装填在毛细管中，OTCEC是将固定相涂渍或键合在毛细管内壁上，MCEC是通过在毛细管内原位聚合或固化的方法，制成的具有多孔结构的整体式固定相。根据分离过程中驱动力的不同可以将毛细管电色谱分为电驱动和压力驱动电色谱。前者是靠电渗流作为驱动力，这种情况下样品区带可以保持塞状流型，分离效率比较高。在最初的研究中人们都使用电驱动电色谱。压力驱动是指除了使用电渗流作为驱动力外，同时可以使用压力作为驱动力，这样可以加快分析速度，便于梯度洗脱，减小气泡生成的可能性。其缺点是流体力学所引起的抛物线流型使柱效有所损失，一般的操作过程中所使用的压力都
亲和色谱原理及其应用 陕西科技大学职业技术学院生物化工工艺092班郝少杰20090305247 摘要：亲和色谱也称为亲和层析，是液相色谱的一个分支，主要用于生物分子的分离、纯化和分析。是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色谱固定相表面配位体之间，存在的生物学和生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性分离生物分子的分离方法。 至今，亲和色谱已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物工程、临床医学、新型高效药物研究中，成为常规的分离、分析和制备的有效工具，并且在生物大分子的结构、功能研究中，成为一种普遍采用的方法。 关键词：亲和色谱，分离方法，纯化，普遍采用的方法。 一、亲和色谱的原理 生物大分子（肽、蛋白质、核酸等）的一个共同特性，是它们具有以特有的高效方式去识别或键合到其他分子上的能力，这就使得所有的生物大分子，可借助亲和作用过程来进行分离和纯化。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。 二、一般流程 亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。 三、影响亲和色谱的因素 1、上样体积若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱
色谱分离方法[1] 根据分离原理还可将色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。利用物质吸附能力不同进行分离的称为吸附色谱，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。利用物质在两相不互溶的溶剂中的分配比不同进行分离的称为分配色谱，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维粉等，液滴逆流色谱（DCCC, droplet counter current chromatography）和高速逆流色谱(HSCCC , high speed counter current chromatography)则是在分配色谱与逆流分溶相结合的基础上发展而成的一种新技术。利用物质解离程度不同进行分离的称为离子交换色谱，常用的离子交换树脂有强酸型（磺酸型）、强碱型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱碱型（三级胺型）等。利用物质分子大小不同进行分离的称为凝胶色谱（亦称分子筛或排阻色谱），常用的支持剂有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离的称为电泳色谱，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳等。本书将根据其在天然药物分离工作中的重要性择要介绍。 色谱法的特点是分离效果好，对于经典方法难以得到分离的化合物采用色谱法往往可以得到满意的分离，但对于所用的吸附剂或支持剂、试剂、仪器设备等要求较高，技术操作较细致，操作周期也较长，故在工业生产中用得较少，目前主要是作为一种实验室常规分离方法用于天然药物中生物活性成分及化学成分的研究。 由于天然药物中有效成分的结构类型不同，理化性质也不同，所以选择的色谱方法也是不同的，要根据具体情况选定。 通常生物碱的分离可选用硅胶或氧化铝色谱，对于极性较强的生物碱可选用分配色谱或反相色谱，对于碱性较强的生物碱可选用离子交换色谱，对于水溶性生物碱如季胺型生物碱、氮氧化物生物碱等也可选用分配色谱或离子交换色谱。 苷类化合物的色谱分离与苷元的性质有关，对于水溶性较大的苷如皂苷、强心苷等通常采用分配色谱或反相色谱分离，对于水溶性较小的苷则可采用吸附色谱分离。 挥发油、甾体、萜类、萜类内酯（成苷者除外）等往往首选硅胶及氧化铝色谱，若在氧化铝色谱上有次级反应，则宜用硅胶吸附色谱分离。 黄酮类、醌类等含有酚羟基的化合物则可采用聚酰胺色谱进行分离。 有机酸、氨基酸等含有羧基或氨基类的化合物通常可选用离子交换色谱进行分离，有时也可用分配色谱进行分离。氨基酸类化合物还可采用活性炭色谱进行分离。 对于大分子化合物如多肽、多聚糖、蛋白质以及极性较大的化合物则通常采用凝胶色谱进行分离。 第一节硅胶柱色谱 硅胶色谱是最常用的色谱方法，适用于亲脂性成分的分离，广泛用于萜类、甾体、强心苷、苯丙素、黄酮、醌类、生物碱等类化合物的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、适用范围广、不易与有机酸、酚类以及色素等类化合物形成不可逆吸附，样品损失较少、回收率较高、副反应较少等优点。但与氧化铝色谱相比，具有分离效果较差、样品处理量较少、对杂质的吸附能力较差等缺点。 二．硅胶吸附色谱 （一）．色谱柱的选择 有多种多样的色谱柱可供选择（见图2-1）。下端带有玻璃塞的或不带有玻璃塞的以及带有垂熔筛板的均可选用。吸附色谱所用的洗脱剂均为有机溶剂，因有机溶剂可溶解在玻璃塞上起润滑和密封作用的凡士林，故对玻璃塞的密封和润滑需要用淀粉甘油糊，而不能用凡士林。在用不带有玻璃塞的色谱柱时，含氯的溶剂如氯仿、二氯甲烷等对胶管的腐蚀很大，
四川大学 硕士研究生课程考试试卷 姓名唐昌云学号 2012224050107 学院华西药学院专业生药学 任课教师王曙教授 课程名称高等生药学 课程成绩 考试时间 2012.12.31. 四川大学
高速逆流色谱分离技术的运用 1 发展历史 高速逆流色谱(HSCCC)是在1982年，美国国立卫生院的一个教授首先研究和发展起来的一种不同于传统液相色谱法的现代色谱分离制备技术。作为一种新的色谱技术，HSCCC分离系统可以理解为以螺旋管式离心分离仪代替HPLC的柱色谱系统。HSCCC不使用固相载体作固定相, 克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。由于不需要固定相，HSCCC技术具有进样量大、无不可逆吸附等优于其他色谱技术的优点，此项技术已经被广泛地应用于医药、环境、化工等领域。 2 原理 2.1 色谱分离原理 高速逆流色谱分离原理结合了液液萃取和分配色谱的优点，是一种不需任何固态载体或支撑的液-液分配色谱技术，其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，主要是利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。而HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内，螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，形成行星运动。由此加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。因为样品中各组分在两相中分配系数不同，导致组分在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品组分按分配系数的大小次序被依次洗脱下来的一种色谱分离技术。在流动相中分配比例大的先被洗脱, 在固定相中分配比例大的后被洗脱。 2.2 固定相的保留 在高速逆流色谱仪设计方面，其有两个轴，其中一个为公转轴，一个为自转轴，两个轴由一个电动机带动。仪器的公转轴呈水平方向，圆柱形的螺旋管支持件围绕此轴进行行星式运转，同时围绕自转轴进行自转。由于螺旋管柱的行星式运动产生了一个在强度和方向上变化的离心力场，使在螺旋柱中互不相溶的两相不断混合从而达到稳定的流体动力学平衡，两相分离成两层，重相占据螺旋管的每一段的外部，轻相占据每一段的内部，并且两相沿螺旋管形成一个清晰的线性
亲和色谱法及其在我国的研究发展状况 【摘要】：亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。技术蓬勃发展，中国色谱专 家同时也非常注重国际间色谱技术的交流。随着国际间交流加深，中国的色谱技术已经跟上了世界的步伐。色谱与生命科学 的交叉研究、色谱与其它分析技术的联用表现得异常活跃。 【关键词】：亲和色谱历史现状 1．亲和色谱 1.1色谱概述 20世纪初，俄国植物学家茨维特首次提出色谱法。他把碳酸钙粉末装到玻璃管中，将植物叶 子的石油醚萃取液作为样品倒入管内，然后再用石油醚自上而下洗脱。随着洗脱的进行，植物叶子中的各种色素向下移动逐渐形成一圈圈的色带，茨维特将这种色带分离过程称为色谱，所用的玻璃管内的碳酸钙填充物称为固定相,洗脱用的石油醚称为洗脱液或洗脱剂，也就是我们常说的流动相。后来，采用该法分离了许许多多的物质，虽然分离过程中看不到色带存在，但色谱法一直沿用至今。 色谱法在当今物质尤其是具有生物活性物质的分离中起到举足轻重的作用。然而在色谱发展的早期有许多的人往往将色谱看做一种艺术, 但是随着色谱理论的发展，以及色谱技术的不断推广，色谱逐渐的称为了一种科学。对于从事生物大分子分离的物质常常用一句话来形容色谱的重要作用：“色谱技术是当今生物工程下游技术的核心”。当今的色谱法包括分离和检查两部分，能够同时实现分离和分析。色谱法也必定会随着材料、生物等多学科研究的深入会更加广泛的应用到分离科学和分析化学之中的。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原 和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种 特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法。 在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称 为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。 亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称
1.环境中含芳烃污染无的废水样品分析检测前科采用哪些分离方法进行组分富集?纺织厂 废水中含有的十二烷基苯磺酸及氨基蒽醌化合物如何进行检测? 参考：（1）溶液萃取、固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、毛细管固相微萃取 蒸发、减压蒸馏、水蒸气蒸馏等 浓缩富集：1L CH2Cl 萃取四次（20ml*4）,Na2SO4干燥，过滤，1m样品经N2流吹，1ml 乙腈:水=9:1溶解，最后超声震荡过滤。 （2）十二烷基苯磺酸——高效液相色谱和UV联用 以80%甲醇为流动相，在流动相中添加7mmol/L醋酸铵电解质，流速0.5ml/min，PH=9的条件下使用高效液相色谱和UV联用，可以快速检测十二烷基苯磺酸。检出限1.32μg/ml 氨基蒽醌的测定——可用高效液相色谱法或者薄层色谱法 高效液相色谱法：甲醇为流动相，用1，4—二氧六环：丙酮（4：1）溶解溶解标样和样品，采用CLC—ODS 0.46×15cm不锈钢色谱柱及UV474nm的检测器 薄层色谱法：先把样品用薄层板展开，把1-氨基蒽醌斑点用小刀刮下，乙醇洗脱，再用72型分光光度计测吸光值。 2.中草药等天然产物中的有效成分(如极性不同的热敏性有机化合物)如何进行分离分析, 应用哪些方法?中药大黄中的大黄素如何进行分离及分析检出? 传统提取中草药有效成分的方法有水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法、溶剂萃取法等，这些方法通常是工艺复杂、耗时、产品纯度不高、对环境污染大，而且易残留有害物质。所以科研工作者们一直在试图寻找提取效率高、选择性好、污染小的方法，随着现代科学技术的不断发展，涌现出了许多新的分离提取方法，加快了提取过程，提高了提取效率。超临界流体萃取技术就是其中之一，较传统提取方法而言，该方法具有简便、快速、提取率高、无污染等特点。 超临界流体的特点超临界流体既具有液体对溶质有比较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性，传质速率大大高于液相过程(超临界流体的扩散系数为～10-4cm2/s，液体的扩散系数为～10-5 cm2/s)。也就是说超临界流体兼具气体和液体的性质，即具有较低的粘度和较高的扩散力。所以超临界流体萃取率高，萃取速度快。 萃取和分离合二为一当饱含溶解物的超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得流体与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不存在物料的相变过程，无需回收溶剂，操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。 超临界流体萃取通常在较低温度下进行可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，特别适合于那些对热敏感性强、容易氧化分解成分的分离提取。 超临界二氧化碳流体常态下是气体，无毒与萃取成分分离后，完全没有溶剂的残留，有效地解决了传统提取方法的溶剂残留问题。 流体的溶解能力与其密度的大小相关而温度、压力的微小变化都会引起流体密度的大幅度变化，并相应地表现为溶解度的变化。因此，可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程。 参考：极性不同的热敏性有机化合物：亚临界萃取，“热敏性”成份不变性、不氧化，是天然产物活性成分“高效、保质”萃取的理想技术 传统分离纯化方法有：浸出提取法、水蒸气蒸馏法、升华法等； 新发展的分离方法：超临界流体提取，超声波、微波辅助提取，膜分离方法、分子蒸馏、离子交换层析、高效絮凝等。 大黄素 高效液相色谱是中药活性成分分离分析的有效技术之一，具有高效、灵敏、快速、准确、适用范围广、重现性好及自动化操作等优点，特别适合于分析高分子量、高沸点、不易挥发、