从尿样中生产人类诱导多能干细胞1
Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples
人类诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells，iPSCs)可从多种组织中诱导得到。但是，在大多数情况下，供体细胞的获得方法并非容易。在这我们介绍一种详细的方法，从尿液中的脱落的肾上皮细胞中生产iPSCs.该方法具有多方面优点，因为从尿液中分离方法简单(30ml尿液便足够)、廉价，并且通用(适合应用于各个年龄、性别和种族)。此外，整个的程序相当快速——约2周时间的尿液细胞培养及3-4周时间即可重编程，利用逆转录病毒转入外源因子产生iPSC克隆的产率也普遍较高，可达4%。尿iPSCs (UiPSCs)也显示出极好的分化潜能，因此代表了生成来自正常个体或遗传病患者(包括与肾脏有关的)多能细胞的一个极好的选择。
前言
自从Yamanaka和Takahashi的2006年的经典实验以来，将体细胞转化成胚胎干细胞(ESC)-样细胞的重编程转化，吸引着大量研究人员的目光1-3。这项技术不论是体外疾病模型，还是潜在的临床移植或者其他领域的应用价值都是非常值得探讨的4-6。然而，最近证实的——有可能引起特定的变异、且拷贝数目不确定、副基因变更抑或免疫原性等问题，却让人们开始对该技术产生质疑7-10。为了评估这些问题，有必要研究是否不同来源的供体细胞产生的iPSCs的特性不同的。具有早期胚胎的这些明显特性的重编程细胞，也可能有助于更好地去理解改变细胞命运的分子机制，并有助于改进该项技术。鉴于此，包括我们实验室在内的多个实验窒已经系统化地重编程了多个种类的人类细胞，包括皮肤成纤维细胞1,3、角质细胞11、生黑色素细胞12、脂肪干细胞13-15、外周血16-18、骨膜膜13、牙周韧带19、神经干细胞20、肝细胞21、羊水细胞 22,23以及从而外的
胚胎组织中(脐带血、基质、胎盘羊膜和绒毛膜间充质细胞(MCs))13,24-26。
由于许多方法生产重编程细胞需要大量的细胞源，这就意味着需要处理大量的组织。常遇到的问题也包括我们不太情愿对供体施行这么残酷的行为。血液是相对比较容易利用的来源之一，但是实验方法也同样残酷27; 即使用较容易得到的毛囊，也存在同样的问题28。其实，有很多从其他组织中获取细胞的被认为比较人道的方法。例如，胚胎外组织29就含有各种类型的细胞，像脐带血就可被用来生产iPSCs，但是仅限于胎儿
出生的那段较短时间内，除非能找到一种合适的保存方法的话可能会有所改善。而且，即便世界上很多国家已经建立了脐带血库，由于价格高昂等原因仍旧没被普遍应用。很明显，从尿液中提取是除了肾功能衰退病人以外，可用于任何年龄、性别、种族情况的人的一种重要方法。因此，我们设想，如果该方法能够成功，势必会成为一种较好的剥离细胞的方法。
尿液可作为细胞来源生产多能细胞
哺乳动物的泌尿器官一般包括两个肾、两根输尿管、膀胱和尿生殖道，通过控制排泄容量和调节电解质来维持稳态功能。另外，还对机体的酸碱平衡的血压调节中发挥重要作用。
1 Key Laboratory of Regenerative Biology, Chinese Academy of Sciences, and Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, South China Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Guangzhou, China.
2 Aging and Immortalization Research, Department of Biotechnology, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Austria.
3 Cardiology Division, Department of Medicine, Queen Mary Hospital, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, Hong Kong, China.
4 Guangdong Stem Cell and Regenerative Medicine Research Centre, University of Hong Kong, Hong Kong.
5 Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Guangzhou, China.
6 Evercyte, Vienna, Austria.
7 These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to M.A.E. (esteban@https://www.doczj.com/doc/bb11857438.html,).
实验设计
首先，我们设计一种较为简单、高效又实惠(仅培养液花销)的尿样收集方法。在第一次实验中，我们从57个样本中筛选42个样本的原代细胞。期中有30个男性样本中有一个污染的，27个女性样本中有4个污染的。在第二、三和四次的培养中我们进一步从5个样本中分离出了1个样本的原代细胞。这意味着总体的成功率可达82%。然后，我们再用逆转录病毒改进我们的方法，以便于从任何条件下成功的产生UiPSCs43。
原代培养液成份含10%FBS(V/V)，以防细胞粘连和生长。对于尿液细胞的扩增我们利用的是近期报道的43RE(renal epithelial)培养液。另外，我们用RE/MC(renal epithelial/mesenchymal cell)培养液也同样成功培养出了尿液细胞(见实验材料，试剂准备和补充表格1)，虽然在两种培养液中都能生第长，但是在后者中增殖率更高。一般在培养数天后，不论供体性别如何，每个12孔板的培养空中可观察到3～10个小克隆。培养2～3周后传至第二代前，细胞总数可达100000-200000。
如之前报道的那样32,37,40，尿液细胞一般可分为两种形态特征的细胞，我们命名为I型细胞和II型细胞
(图1)。其中
I型细胞具有比较规则的外形，轮廓光滑，如鹅卵石样。II
型细胞的形态是随机的，而且生长速
度较I
型更快。
型稍频繁一些。经过不同的分离，可使来自同一样本的个体被纯化成I型或II型克隆。根据mRNA分析和免疫荧光分析，两种类型的细胞克隆都表达上皮细胞标记物，但是后者II型细胞的免疫荧光结果略微弱一些(补充表格2)，与之前报道的结果一致32,40，我们在I型和II型细胞中均发现有RE标记物的存在(补充表格2)，
但是没有检测到尿道上皮标记物——尿溶蛋白III(uroplakin III)。
本实验中，尿液细胞的数量在传至1代或2代时，便足以进行逆转录病毒感染之用(更多用2代)。此时转染也可高效的生产iPSC细胞。根据我们的实验程序，用可表达外源因子的逆转录病毒载体转化293T人类胚胎肾细胞(HEK 293T)，需在用于转染的尿液细胞分裂12h前进行(box1,表箱1)。含有高逆转录病毒滴度的上
清液产物是重变成成功与否的关键因素。建议用GFP对照逆转录病毒载体作为对照，观察转化效率和转染效率。
Box1
1,在转染尿液细胞的5d前解冻HEK 293T细胞。对其进行计数，然后将约2×106细胞接种到100mm的含有HEK 293T培养液的组织培养皿中，37℃培养；
2，两天后将会有90%的细胞汇合，抽走培养液，用10ml洗涤液轻柔地冲洗一次，吸走洗涤液加入1.5ml含0.05%（wt/vol）胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育2min，然后从一侧轻微吹打组织培养块以确保所有细胞都完全分离；
▲关键点：为保证逆转录病毒的高产量，HEK 293T细胞的健康程度非常重要。
3，用9ml的HEK 293培养液冲洗培养皿，转至50ml的离心管中；
4，将混合物200×g 室温离心3min，弃上清；
5，用10mlHEK 293T培养液重选细胞，然后用血细胞计数板或自动细胞计数器技术；
6，将4×106个细胞接种到含10ml HEK 293T培养液的100mm培养皿中，37度培养24h；
▲关键点：接种细胞的数量依据增殖率(与FBS的批次有关)及转化所需时间而调整。这个关系很大，因为HEK 293T细胞的粘度低，要不然可在转化后高度汇合时再分离。培养液中不要加抗生素，否则会降低转化效率；
7，接种HEK 293T细胞24h后(汇合率可达80%)，根据试剂说明书，制备脂质体2000/DNA复合物以备转染。对于200mm的培养皿，相关pMXs载体用量为20μl，Pcl-Eco包装载体为20μl，脂质体2000为45μl。除了OCT4,SOX2,KLF4及c-MYC外，我们一般用pMXs-GFP作为对照，以便观察转染效率。因此需要5个不同的培养皿；
！注意：利用II级(或以上)生物安全柜操作，特别注意上层的病毒。
8，轻柔地加入脂质体/DNA复合物，逐滴均匀的加到培养液中，37度过夜；
9，转染24h后，小心地弃掉培养皿中的转染液，加入10ml新鲜HEK 293T培养液，37度过夜培养；
▲关键点：转染HEK 293T细胞开始24小时后分离尿液细胞。下一个24小时后会收获第一次分裂的逆转录病毒。
▲关键点：用荧光显微镜检测pMXs-GFP产生的信号，确保有100%的HEK 293T细胞被转染。
10，转染36h后，用自动移液器小心的收集每个转录因子的病毒上清液(约10ml)，或者转至15ml的试管中。轻柔地加入10ml新鲜的HEK 293T培养液。
！注意：将培养液小心地滴在培养皿的侧面，一点小心勿将细胞冲走。
11，用0.45μm过滤器过滤上清液；
12，在转染前加入聚凝胺(终浓度8μg/ml)至病毒上清液中。然后用该上清液转染尿液细胞(第一轮转染；实验方法中第19步)；
13，再过24h后，如BOX中第10-12步那样，再次收集病毒上清液，然后再对HEK 293T细胞处理。此次准备的细胞用于第二轮转染(实验方法中第21步)；
■暂停点：病毒上清液可在4℃保存24h。这对于准备用于转染用的尿液细胞和逆转录病毒产物的同步协调非常重要，但是会略微影响转染效率。
实验材料
试剂：
1.尿液(见试剂制备)!注意：恰当地告知捐赠者，并取得签名的协议书；
2.洗涤液(见试剂制备)；
4.两性霉素B溶液(Sigma,cat.No.A2942)；
5.Penicillin/streptomycin solution (Hyclone, cat. no. SV30010)
6.Primocin (InvivoGen, cat. no. ant-pm-1)
7.Gelatin, 0.1% (wt/vol) solution (Millipore, cat. no. ES-006-B)
8.Primary medium (see Reagent Setup)
9.RE proliferation medium (see Reagent Setup)
10.MC proliferation medium (see Reagent Setup)
11.RE/MC proliferation medium (see Reagent Setup)
12.DMEM/high glucose (Hyclone, cat. no. SH30022.01B)
13.Ham’s F-12 nutrient mix (Gibco, cat. no. 11765-054)
14.Renal epithelial cell growth medium (REGM) SingleQuot kit supplement and growth factors (Lonza, cat.
no. CC-4127)
15.FBS (PAA, cat. no. A15-101)
16.REGM BulletKit (Lonza, cat. no. CC-3190)
17.GlutaMAX (Invitrogen, cat. no. 35050)
18.Non-essential amino acid solution (NEAA; Invitrogen, cat. no. 11140)
19.Recombinant human fibroblast growth factor-basic (bFGF; Peprotech, cat. no. 100-18B)
20.Recombinant human epidermal growth factor (EGF; Peprotech, cat. no. AF-100-15)
21.Recombinant human platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB; Peprotech, cat. no. 100-00AB)
22.BSA (PAA, cat. no. K31-011)
23.Trypsin-EDTA (0.25%; Gibco, cat. no. 25200114)
24.Defined trypsin inhibitor (Invitrogen, cat. no. R-007-100)
25.TrypLE Select (1×; Gibco, cat. no. 12563-011)
26.Antibodies for urinary cell identification (补充表格 3a)
27.Quantitative RT-PCR primers for urinary cell identification (补充表格 3b)
28.Freezing medium for urinary cells (CELLBANKER, cat. no. CELLBANKER 2)
29.HEK 293T cells (ATCC, cat. no. CRL-11268)
30.HEK 293T medium (see Reagent Setup)
31.Trypsin-EDTA (0.05%; Gibco, cat. no. 25300120)
32.pMXs retroviral vectors producing human OCT4(official name: POU5F1),
33.SOX2, KLF4and c-Myc(offical name: MYC) (Addgene, cat. nos. 17217,
34.17218, 17219 and 17220)
36.Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat. no. 11668019)
37.Polybrene (Sigma, cat. no 107689)
38.Mitomycin C (MMC; Sigma, cat. no. M4287)
39.MMC-treated mouse embryonic fibroblasts (MEFs; see Reagent Setup)
40.CF-1 mice (Charles River Laboratories International, strain code 023)
41.MEF medium (see Reagent Setup)
42.Defined FBS (dFBS; Hyclone, cat. no. SH30070.03)
43.Human ESC medium (see Reagent Setup)
44.Human dFBS medium (see Reagent Setup)
45.Human ESC/dFBS medium (see Reagent Setup)
46.DMEM nutrient mix F12 (Gibco, cat. no. C11330500BT)
47.KnockOut serum replacement (KSR; Gibco, cat. no. 10828028)
48.β-Mercaptoethanol (Invitrogen, cat. no. 21985023) ! cautIonIt is toxic by inhalation and skin contact.
Handle with care.
49.mTeSR1 basal medium (Stemcell, cat. no. 05850)
50.mTeSR1 5× supplement (Stemcell, cat. no. 05850)
51.mTeSR1 medium (see Reagent Setup)
52.Valproic acid (VPA; Sigma, cat. no. 05194)
53.Dispase (Invitrogen, cat. no. 17105041)
54.Matrigel human ESC-qualified matrix (BD Biosciences, cat. no. 354277)
55.Cryostor cell cryopreservation medium CS10 (Sigma, cat. no. C2874)
56.Liquid nitrogen
实验设备
1.Forma Class II, A2 biological safety cabinet (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 1287)
2.Forma Series II, water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2 (Thermo Fisher Scientific, cat. no.
3111)
3.Inverted tissue culture microscope with phase-contrast, epifluorescence, ×5, ×10 and ×20 objectives (Zeiss,
model Axiovert 40 CFL)
4.Tissue culture centrifuge with swinging rotor and adaptors for 15- and 50-ml tubes (Zonkia, cat. no. SC-
2544)
5.Aspirator tube assembly (Thermo Scientific, cat. no. 92249)
6.Automatic pipette
7.Tissue culture dishes, 100 mm
8.Tissue culture plates, 24, 12 and 6 wells
https://www.doczj.com/doc/bb11857438.html,lex syringe-driven filter unit, 0.22 and 0.45 μm (Millipore, cat. nos. SLGP033RB and SLHV033RB)
11.Syringes, 10 and 50 ml (Double-Dove, cat. no. 101223)
12.Conical tubes, 15 and 50 ml (Corning, cat. nos. 430790 and 430828)
13.Cryovials (Nalgene, cat. no. 5000)
试剂制备：
1.尿液：尿液细胞的收集相比于其他细胞的收集方法要快很多。如果可行的话，可让提供者在收集之
前多喝些水即可，并建议在收集尿液前让其用湿巾清理生殖道周围。刚开始的尿液应该弃掉，将中间排除的尿液收集至制定容器中；
▲关键点：为提高存活率，应该收集第一次排出的尿液40。对于大部分人来讲，30ml尿液足以用于分离尿液细胞了，但是增加体积的话可以增加细胞产量。
2.洗涤液：DPBS中添加100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和500ng/ml的两性霉素 B。如果制
备500ml，只需将2.5ml的青霉素/链霉素和1ml的两性霉素B混合，用DPBS定容至500ml即可。两性霉素 B和青霉素/链霉素可用Primocin代替，4度可保存数周；
原代培养液：含有DMEM/高葡萄糖和Ham’S F12营养混合物(1:1),另添加10%(vol/vol)的FBS，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素,REGM sigleQuot试剂，以及2.5μg/ml两性霉素B。制备500ml的话，需要FBS 50ml,青霉素/链霉素2.5ml,两性霉素B 1ml,一支REGM singleQuot试剂，加一半DMEM/高糖和一半Ham’s 12营养液至500ml.
!注意：注意用原代培养液冲洗每一个容器确保试剂没有损失。
▲关键点：4度避光可保存2周。
3.RE增殖培养液：制备500ml为例，加入全部容量的REGM bulletKit至同一试剂盒中的RE细胞基本
培养液。
!注意：注意用RE增殖培养液冲洗每一个容器确保试剂没有损失。
▲关键点：4度避光可保存2周。
4.MC增殖培养液：含10%(vol/vol)FBS,1%(vol/vol)GlutaMAX，1%(vol/vol)NEAA,100U/ml青霉素，
100μg/ml的链霉素，5ng/ml的bFGF，5ng/ml的PDGF-AB和5ng/mlEGF的DMEM/高糖；以制备500ml为例，需FBS 50ml、GlutaMAX 5ml、NEAA 5ml、青霉素/链霉素2.5ml、bFGE 100μl、PDGF-AB 250μl，EGF 50μl。用22μm口径无菌过滤器过滤，用500ml DMEM/高糖培养液定容至500ml.
▲关键点：4度避光可保存2周。
5.RE/MC 增殖培养液:将RE培养液和MC培养液按1：1混合。以制备500ml为例，需RE增殖培养液
和MC增殖培养液各250ml。
▲关键点：4度避光可保存2周。
6.HEK 293T 培养液：含10%(vol/vol)FBS,1%(vol/vol)GlutaMAX的DMEM/高糖培养液。以制备500ml
为例，需要 FBS 50ml,GlutaMAX 5ml,再用DMEM/高糖培养液定容至500ml。4度可保存数周。
7.MEF培养液：含10%(vol/vol)FBS,1%(vol/vol)GlutaMAX，1%(vol/vol)NEAA,100U/ml青霉素，100
μg/ml的链霉素的DMEM/高糖培养液。以制备500ml为例，需FBS 50ml, GlutaMAX 5ml, NEAA 5ml、青霉素/链霉素2.5ml, 用DMEM/高糖培养液定容至500ml。4度可保存数周。
9.人类dFBS培养液：
10.人类ESC/dFBS培养液：
11.mTsSR1培养液：
12.分散酶（Dispase）：
13.VPA：
14.明胶包被的培养皿：
15.人工基底膜的制备与包被：
16.MEFs的MMC失活：
17.生长因子的构建：
实验方法：
1，将尿液收集到一个适当的容器中(补充图1)，方法如《实验方法》中所介绍；
▲关键点：容器必须灭菌，推荐用一次性塑料密封容器。
■暂停点：由于尿液异常的渗透压、低PH和有毒代谢物(如供体为烟民时)对细胞有害，而且在处理不充分时还有污染的风险。理想状态是在细胞被采集后迅速被分离出来，但是，如果延迟不可避免的话，将样本置于4度冰箱（冰上）中保存可在一定程度上保护细胞的活性。我们便从冰箱中保存了有4h的尿样中成功分离出了尿液细胞。
2，将尿样转至50ml的无菌试管中（补充图1）。
!注意：本步骤以及后续所有细胞操作步骤都应当在组织培养罩中进行以免污染；
3，400×g,室温离心10min；
5，用剩余的1ml 尿液柔和地重选沉淀，然后将之转至50ml 试管中；
6，加入10ml 的洗涤液(washing buffer)（补充图1）；
7，200×g,室温离心10min ；
8，小心弃去上清液，留0.2ml 上清；
9，加入1ml 原代培养液至沉淀重选液中，然后转至12孔板中(事先覆盖0.1%(wt/vol)的明胶，补
充图1)。此时细胞外形应该如图1a,b 所示。
▲关键点：培养板上覆盖明胶可以增加尿液细胞起始的粘合度，对后续的代数也有关。
▲关键点：女性尿液较之男性尿液，含有更多的沉淀物。这主要包括很不能粘附在培养板上的鳞状上皮细胞(可能来自尿道)(图1a)。有时候不论男女都会发现少量的血细胞(可能是红细胞)，尤其当供体年龄偏大时(图1a,b)。这些类型的细胞在随后的步骤12中，可随着培养液被逐渐吸走。
10，加入1ml 的原代培养液，37
度培养24小时；
11，在接下来的3d 再加入1ml 原代培养液(铺板后第24，48，72h)。这个体积和随后的其他步骤
的体积以12孔板为例。这个过程不用弃掉任何培养液；
12，大约铺板96h 后，吸出大部分的培养液(约4ml)，留约1ml ，再加1ml 的增殖培养液； 13，每天半量换液，保留一半液体不动；
!注意：如果实验的最初目的便是重编程实验(例如研究比较供体组织的表观遗传记忆等)，推荐在
细胞数达到约100000～200000时候进行分选实验，以获得同源的肾上皮细胞45，46。
▲关键步骤：铺板后稳定生长的第72～120h(3-5d)应该出现小的细胞克隆(大约2～4个细胞)(图1c,d)。不论供体性别如何，经常每孔可观察到3～10个克隆。不论克隆形状是规则的(I 型)还是细长形的(II 型)，一般都能观察到(图1c-h)。经过免疫荧光和基因表达分析得知，两种类型的主
要成份都是RE 细胞(见前言和补充表格2)。
我们实验室收集和产
生的UiPSC 细胞群。
F ：女性
M ：男性
SCN5A: 钠离子通道蛋
白类型5亚基α;
LMNA: Lamin A/C;
LAMP2: 溶酶体相关的
膜蛋白2;
LDLR: 低密度脂蛋白
受体.
15，当尿液细胞生长至适当密度(80%-90%汇合，大约铺板后9-12天左右)时，将所有细胞转
至新的12孔板继续扩增培养。此时细胞称作1代细胞，用0.25%(wt/vol)的胰蛋白酶-
EDTA ，但是停止反应时候我们不用含FBS 的培养液，而是用胰蛋白酶抑制剂，其实胰酶替代物同样同样可以。继续培养细胞，并每天换液。如果此时细胞数足够多的话(计数后约100000细胞)，可转到6孔板上，直接用于转染(步骤17)；
▲关键步骤：勿让培养密度过大，因为会导致传代后细胞数目减少。
16，当细胞有80～90汇合时，将所有细胞按1：4比率转到前面推荐的平板上或者6孔板中，
以备转染(步骤17)。此时细胞为第二代。如果有必要的话可以继续传代培养；
▲关键步骤：当细胞代数为1～3代细胞时，iPSC 细胞的产率最高，当供体年龄较大或者是疾病患者时更是如此。随后的步骤中II 型细胞可比I 型细胞更高效的纯化出来；
▲关键步骤：尿液细胞中这两种类型的克隆增殖周期不近相同。I 型细胞克隆一般会在5代时停止增殖，II 型克隆则可以成功传至10代。
■暂停点：如果必要时，可将尿液细胞暂时冻存在-80度冰箱中或者液氮中。之后再用时
17，从每个6孔板小孔中或者小瓶中分离出60000个1～4代的尿液细胞 ，37度培养24h 。要是
从小瓶中培养的话，推荐使用更多的细胞，因为会有部分细胞死掉；
18，接种24h 后观察确认是否有约30%的细胞汇合(图2a),然后抽走培养液，加每孔2ml 新鲜RE
增殖培养液；
19，每孔加入2ml 的每个转录因子的病毒上清液。然后，同Yamanaka 使用的四种因子相同的
话，总体积保持在8ml 左右。37
度培养，此时记作转染后第0
天(图
2a)。
21，重复第19步，进行第二次转染，37度培养12小时；
22，第二次转染12小时后，吸走培养液加入新鲜RE 增殖液。继续培养，注意每天换新鲜的RE
增殖培养液。同时，用荧光显微镜观察pMXs-GFP 病毒的荧光表达情况，评估转染效率。确保转染72小时后所有细胞都是GFP 阳性细胞。I 型和II
型细胞都可被高效的转染(图2b)。 23，每天在显微镜下检查转染的尿液细胞。转染了四种因子的尿液细胞形态应该有较大的变化
(细胞形态变小而紧密)，而且在第二次转染2～3d 后增殖率会增加(图2a)。
▲关键步骤：转染后细胞也可能会老化，所以形态变化不是特别明显的，这时候不宜进行下一步实验。用代数较小的细胞可增加克服细胞老化的几率。另外，由于II 型细胞增殖率稍高的缘故，一般转染效果好点；
24，如果转染引起较严重的细胞形态和增殖率的变化，可取4×106的辐射状的MEFs 细胞，用
MEF 培养液在100-mm 的明胶处理的培养板上共培养诱导UiPSC 。
▲关键步骤：补充步骤应该在转染尿液细胞分离前1～2d 进行。
25，当尿液细胞有80～90汇合时候(一般在转染后第3-5d)，如果此时细胞形态变化太严重，用
0.25(wt/vol)的胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，然后用10ml 的人ESC/dFBS 培养液重悬细胞； 26，200g 室温离心5min;
27，用4ml 人ESC/dFBS 培养液重悬细胞，再计数；
28，将24步骤制备的共培养层细胞上层的培养液吸走，加入约8ml 的人ESC/dFBS 培养液；接
着，每个100mm 培养皿中加入5×104至1×104的尿液细胞中，37度培养；
29，2d 后，吸出培养液，加入新鲜人ESC/dFBS 培养液和VPA(终浓度为1mM)。继续培养7d ，
每天换新鲜人类ESC/dFBS 培养液和VPA(终浓度1mM)。
▲关键步骤：诱导液中加VPA 是因为
30，转染16d 后，每天用新鲜mTesR1培养液换液；
31，大约在转染后第16d~25d 时候，会首次出现人ESC 样细胞克隆，然后挑取hESCS
样克隆至共培养细胞中或人工基膜覆盖的平板上(图3a,b)
。有的时候，克隆长的很慢，因此需要再晚点挑取才好。
现后一周才可以(图2a)。
中报道的那样对hESCS样克隆进行培养和鉴定47-49。
32，根据实验室情况或者像前面Protocols