上海交通大学
硕士学位论文
大肠癌发生发展不同阶段的差异蛋白质组学及代谢组学实验研
究
姓名：彭佳远
申请学位级别：硕士
专业：普外科
指导教师：秦环龙
20080508
大肠癌发生发展不同阶段的差异蛋白质组学
及代谢组学实验研究
摘要
目的：研究从正常大鼠大肠黏膜经大肠腺瘤发展到大肠腺癌，最终演变为大肠癌肝转移的发病过程中各个阶段黏膜或肿瘤组织间的差异表达蛋白及代谢产物，以发现有助于大肠癌早期诊断的标志物及进一步了解大肠癌发病的机制。
方法：90只雄性Wistar大鼠，80只腹腔注射1,2-二甲肼（1,2-DMH）每周1次，连续10周，余下10只作为对照组，腹腔注射生理盐水。自第12周开始，每隔2周处死4-6只大鼠，收集肿瘤标本，按照病理分为正常黏膜组、腺瘤组、腺癌组、肝转移组；分别留取各个阶段的组织标本，提取蛋白质，作二维凝胶电泳后选取4组间相对体积有显著差异的蛋白斑点进行质谱检验和生物信息学分析，对于有重要价值的蛋白transgelin进行Western blot和免疫组化验证以研究其表达的规律；同时在处死大鼠时，留取血清和尿液标本，利用质谱分析及核磁共振波谱技术分析其代谢小分子变化，进行代谢组学研究。
结果：8只大鼠在实验过程中死亡，72只大鼠有68只发生肿瘤，所有肿瘤中，腺瘤17只，主要发生于第14-18周（发生率：55%）；腺癌51只，主要发生于22周以后（发生率：92.3%），其中腺癌合并肝转移11只，主要发生于32周以后（发生率：36.3%）；对4组标本进行二维凝胶电泳图及质谱分析，最终鉴定出10个差异表达蛋白，包括α-烯醇化
酶（α-enolase）、心脏α-肌动蛋白（cardiac α-actin, CA）、transgelin蛋白，肌球蛋白调节性轻链-平滑肌型（Myosin regulatory light chain，smooth muscle isoform，MRLC），3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、结合珠蛋白(haptoglobin)，二硫异构酶（Disulfide Isomerase, DI），肌酸激酶（Creatine Kinase mitochonbrial，CK-m），热休克蛋白8（heat shock protein 8, HSP 8），角蛋白复合体2（Keratin complex-2, KC-2）。其中Western blot和免疫组化证实transgelin蛋白在大肠黏膜癌变过程中表达逐渐降低，提示其可能为一种重要的肿瘤标志物。对大鼠血清进行代谢组学分析显示：正常组、腺瘤组、腺癌组的分布有明显差异，腺癌组和肝转移组样本的分布无明显差异。与正常组相比，腺瘤组样本中L-threonine升高，5-oxo-L-Proline 下降；与腺瘤组相比，腺癌组样本中L-sarcosine、L-phenylalanine、cholesterol 显著升高，2-hydroxy-1,2,3-Propanetricarboxylic acid显著下降。而尿液中也存在差异表达的分子。
结论：由大肠正常黏膜经大肠腺瘤、大肠腺癌逐步发展为大肠癌肝转移各阶段的肿瘤组织、血清、尿液间存在差异表达蛋白和代谢分子，其中transgelin可能作为大肠癌发生发展的候选生物标志物。
关键词：大肠癌蛋白质组学代谢组学 Wistar大鼠
COMPARATIVE PROTEOMIC AND METABONOMIC STUDY ON THE EVOLUTION OF EXPERIMENTAL COLORECTAL
CARCINOMA
ABSTRACT
Objective: To research the proteins and metabolic products differently expressed during evolution of experimental colorectal carcinoma (normal mucosa→adenoma→carcinoma→liver metastasis) so as to find the early diagnostic biomarker of colorectal cancer as well as to understand its pathogenesis.
Methods: 90 male Wistar rats were selected, 80 were injected with 1, 2-dimethylhydrazine intraperitoneally once a week for consecutive 10 weeks and 4-6 rats were sacrificed every 2 weeks to establish the experimental colorectal tumor models (from normal mucosa to liver metastasis). The remaining 10 rats were injected with normal saline as control. Samples of these different stages were collected and divided into 4 groups (1. normal mucosa 2. adenoma 3. carcinoma 4. liver metastasis). The proteins of these 4 groups were extracted to conduct 2-dimensional gel electrophoresis and then screen the differential protein spots to perform mass spectrometry as well as bio-information analysis. Protein spot of special importance, transgelin, was
subjected to western blot and immunohistochemistry analysis so as to explore the rule of its expression alteration. Meanwhile, the serum and urea of rats were collected to undergo mass spectrometry or magnetic resonance spectroscop study.
Results: 8 rats died during the experiment. 68 out of 72 rats were found bearing colorectal tumor. Adenomas were found in 17rats mainly in 14th-18th week with an incidence of 55%; adenomas were found in 17rats mainly in 14th-18th week with an incidence of 55%; adenocarcinomas were observed in 51 rats mainly after 22nd week with an incidence of 92.3% and those with liver metastasis were detected in 11rats mainly after 32nd week with an incidence of 36.3%. 10 differential proteins were identified by 2-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry including α-enolase, cardiac α-actin (CA), transgelin, Myosin regulatory light chain smooth muscle isoform (MRLC), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), haptoglobin, Disulfide Isomerase (DI), Creatine Kinase mitochonbrial (CK-m), heat shock protein 8 (HSP 8) and Keratin complex-2 (KC-2). Among them, western blot and immunohistochemistry proved that transgelin sequentially down-regulated through the evolution of rat colorectal carcinoma. Metabonomic research revealed that compared with normal mucosa group, level of L-threonine increased while 5-oxo-L-Proline
decreased in adenoma group and compared with adenoma group, level of L-sarcosine, L-phenylalanine, cholesterol significantly increased and 2-hydroxy-1,2,3-Propanetricarboxylic acid dramatically decreased in adenoma group. Besides, some small metabolites also changed among 4 groups.
Conclusion: there are differential proteins and metabolites in tissues, serum and urine during the evolution of colorectal carcinoma. These proteins and metabolites may be the candidate biomarkers for the early diagnosis of colorectal carcinoma while transgelin was of most importance due to its sequentially reduced expression through the evolution of rat colorectal carcinoma.
KEY WORDS: colorectal carcinoma, proteomics, metabonomics, Wistar rats
上海交通大学硕士学位论文
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中英文缩略语对照
英文简称 英文名称 中文名称
1,2-DMH 1,2-dimethylhydrazine 1,2-二甲肼
CA cardiac α-actin 心脏α-肌动蛋白
MRLC Myosin regulatory light chain
肌球蛋白调节性轻链GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3-磷酸甘油醛脱氢酶
DI Disulfide Isomerase 二硫异构酶
HSP 8 heat shock protein 8 热休克蛋白8
KC-2 Keratin complex-2 角蛋白复合体2
N Normal mucosa 正常黏膜
Ad Adenoma
腺瘤 Ca adenocarcinoma
腺癌 LM Liver metastasis
肝转移 EDTA
Ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 PBS
phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲溶液 HE Hematoxylin and Eosin 苏木精-伊红
DAB diaminobenzidin 二氨基联苯胺
上海交通大学
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日期：年月日
上海交通大学
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引言
大肠癌是目前我国高发的肿瘤之一，其病因复杂。从正常粘膜到大肠癌形成是一个受多环节、多种因素影响的复杂转变过程，主要可能包含以下过程：正常上皮→早期腺瘤→中期腺瘤→晚期腺瘤→浸润癌→癌灶转移，整个经典过程伴随着多种癌基因的激活与抑癌基因的突变。研究表明，除了基因水平的变化，大肠癌的发生过程还涉及多种蛋白质表达的差异，这些蛋白质具有不同的功能，主要有以下几种：①细胞内的酶蛋白。如Cathepsin B[1]协助肿瘤水解基底膜，便于肿瘤的转移与浸润；
②细胞核内的蛋白质。其主要通过干扰细胞正常有丝分裂或抑制凋亡蛋白酶而引起肿瘤，如survivn蛋白[2]等；③信号蛋白分子，包括跨膜信号蛋白和胞浆内的信号分子。通过信号传导来扰乱细胞的正常增殖分化，例如KAI1[3]。④细胞骨架蛋白。其能够通过调控细胞运动、分化、细胞间黏附等引起肿瘤细胞发生、脱落和转移，例如β-catenin蛋白[4]。除了蛋白质的变化，一些研究也表明大肠癌存在一些代谢产物的改变：Capon C等[5]比较分析正常人降结肠中的粘蛋白mucin和大肠癌患者及大肠癌细胞株的mucin的多糖组成，发现正常结肠中的mucin糖链是以3型核心为主的即GlcNacβ1-3GalNAc-ol结构，末端糖链主要呈现Sda/Cad抗原样结构（Sda/Cad-antigen-like structure）；而大肠癌患者的mucin糖链以1型或2型核心为主,并且末端糖链并不以Sda/Cad抗原样结构为主。Bundy JG等[6]
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将大肠癌细胞株HCT116的p300基因进行敲除，发现p300敲除后的HCT116的许多代谢产物与野生型HCT116有很多差异，包括谷氨酸、谷氨酰胺、尼克酰胺相关复合物、磷酸甘油酯等等。同时在缺乏血清的野生型HCT116培养基中，磷酸胆碱浓度显著降低；而p300敲除后的HCT116培养基则无此现象，具体的机制及意义仍然不甚明确，有待深入的研究。
尽管以上这些蛋白和代谢产物被证明与大肠癌的发病有关，但是仅仅研究一种或几种分子与大肠癌的关系显然带有局限性，所以有必要从整体水平来研究大肠癌自然病程中包含的所有差异表达蛋白。此外，由于人体体液中的代谢物与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡，肿瘤组织必然会干扰正常人体的代谢，引起内源性生化物质在浓度、比例、代谢通量等方面的失调并且反应在各种体液代谢物的变化中。因此如果把大肠癌作为一种全身性疾病，在关注肿瘤本身的同时，更应该重视大肠癌患者组织和体液中的生化代谢物的变化，从而能够更深刻地揭示大肠癌的病理生理过程。
近几年来，蛋白质组和代谢组的概念被提出，蛋白质组指的是细胞、组织和基因组所表达的全部蛋白质总和。蛋白质组学研究具有观察由多基因事件引起的多蛋白组分整体变化的独特优势。代谢组指的是一个细胞，组织或器官中的所有小分子代谢组分的集合。代谢组学研究的目的是定量检测机体对病理生理刺激或基因改变引起的动态多参数代谢应答。大肠癌的发病是由于遗传因素和环境因素共同作用下的多基因事件，
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大肠癌不仅引起肠道局部的病理改变，更牵涉到全身代谢的变化。因此蛋白质组学和代谢组学有助于从整体水平来探索大肠癌发生发展过程中肿瘤诊断标志物，同时对于大肠癌的发病机制和病理生理过程也有深入了解。
本研究利用Wistar大鼠建立类似于人类大肠癌的经典发病过程，通过比较各个阶段组织蛋白质组和代谢组表达的差异来筛选出可能的肿瘤标志物。
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材料和方法
一、实验材料
1. 实验动物
Wistar大鼠90只，雄性，体重250g～350g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2004-000，大鼠饲养于清洁级环境，饲养温度22±2 ℃，相对湿度控制于44±5%标准饲料喂食，任意饮水。
2. 主要实验仪器
超声细胞破碎仪：JY92－2D，宁波新芝科仪研究所，中国
水平电泳系统：IPGphor, GE Amersham,美国
垂直电泳系统：Hoefer SE，GE Amersham,美国
第一相等电聚焦仪：Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System ，GE Amersham，美国
第二相聚焦仪：Hofer SE 600，GE Amersham，美国
凝胶图像扫描仪：UMax Powerlook 2110XL，GE Amersham，美国
质谱分析仪：Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT Mass Spectrometer，Bruker Daltonics，德国
2-D电泳图像分析软件：ImageMarster，GE Health care，美国
垂直电泳仪：GE Amersham，美国
半干转膜仪：，Bio-Rad，美国
柯达活体成像仪：，Kodak，美国
-80℃超低温冰箱：MDF-U32V, SANYO，日本
切片机：RM2145型，Leica
展片机：HI1210型，Leica
烤片机：HI1220型，Leica
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光学显微镜：Olypums
彩色图文病理报告分析系统：HPIAS 1000，远东蔡司
气相色谱-质谱联用仪Agilent 6890N/5973N ：Agilent公司，美国
Agilent 7683自动进样器：Agilent公司，美国
ZB-5MS毛细管柱(0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)：Agilent公司，美国
Agilent色谱工作站和NIST质谱数据库：Agilent 公司，美国
Waters ACQUITY UPLC/MS/MS (Waters，USA)
色谱柱：HSST3 C18 -1.7 μm column (Waters, Milford, USA)
3. 主要试剂和试剂盒
3.1 诱癌剂：
1,2-二甲肼（1,2-dimethylhydrazine，1,2-DMH ）规格10g，Sigma，美国
使用前用生理盐水配成400mg?100ml-1（0.4%）的母液，加入EDTA 37mg?100ml-1及10%的NaHCO3调节pH至6.5左右。
3.2 蛋白组学所需试剂
蛋白裂解液：9.5M Urea，4％CHAPS，65mM DTT，0.2% carrier ampholyte
蛋白酶抑制剂：cooktail酶抑制剂，Roche，瑞士
蛋白定量液：Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate 500-0006，Bio-Rad，美国
重泡涨液：(8 M Urea, 2%CHAPS, 18mM DTT, 0.5%IPG Buffer, Bromophenol blue trace)。
Urea ( Bio-Rad 161-0731, Pharmacia 17-1319-01) 19.2 g
CHAPS (Bio-Rad 161-0460, Pharmacia 17-1314-01) 0.8g
Trace Bromophenol blue
一次配40ml,分装成0.5ml一管。-20°C保存。
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使用前加DTT(Bio-Rad 161-0611, Pharmacia 17-1318-01)量如下表：
1条胶2条胶4条胶
7cm胶条DTT 125ulRHB
0.35mg
250ul RHB
0.7mg
500ul RHB
1.4mg
13cm胶条DTT 250ul RHB
0.7mg
500ul RHB
1.4mg
1000ul RHB
2.8mg
18cm胶条DTT 350ul RHB
0.98mg
700ul RHB
1.96mg
1400ul RHB
3.92mg
DTT分装好后－20°C冻存，临用前加上。
平衡缓冲液：50mM Tris-HCl pH8.8, 6M尿素，30%甘油，2％SDS，痕量溴酚蓝
Pharmacia IPG Buffer: pH 3-10L 17-6000-8；pH 3-10NL 17-6000-88; pH 4-7L 17-6000-86
1条胶2条胶4条胶
7cm胶条IPG 125ul RHB
0.625ul
250ul RHB
1.25ul
500ul RHB
2.5ul
13cm胶条IPG 250ul RHB
1.25ul
500ul RHB
2.5ul
1000ul RHB
5.0ul
18cm胶条IPG 350ul RHB
1.75ul
700ul RHB
3.5ul
1400ul RHB
7.0ul
3.3 代谢组学所需试剂
甲氧胺盐酸盐、吡啶、MSTFA和TMCS：色谱纯，Fluka公司，美国
正庚烷和乙腈：色谱纯，Merck公司，德国
氦气：高级纯，比欧西气体有限公司,英国
3.4 Western blot所需试剂
蛋白质裂解缓冲液：30mM Tris, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1% Nonidet P-40, and 10% glycerol
蛋白定量试剂盒：BCA 试剂盒，碧云天公司
上样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl pH6.8，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝，1mol/LDTT
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转移缓冲液：48mmol/L Tris-HCl pH8.3，39mmol/L甘氨酸，0.037%SDS
封闭液：含1%牛血清白蛋白的TBST （10mmol/L Tris-HCl PH7.5，150mmol/LNaCl，0.05%Tween-20）
一抗：山羊抗SM22-alpha(transgelin)抗体，多抗，1:1000稀释，abCAM，英国
二抗：兔抗羊IgG-HRP：Santa Cruz，美国
免疫组化所需试剂
一抗：山羊抗SM22-alpha(transgelin)抗体，多抗，1:50稀释，abCAM，英国
二抗：兔抗山羊IgG：Santa Cruz，美国
二抗Evision试剂（为即用型试剂），Dako，日本
二、实验方法
1. 动物模型
90只Wistar大鼠，其中对照组10只，每周腹腔注射生理盐水+EDTA；余下80只大鼠每周腹腔注射1,2-二甲肼，剂量为40mg/kg体重，连续注射10周。自第12周开始，每隔2周处死4-6只大鼠，处死前一天将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液，于－80℃冻存；处死采用心脏采血的方法，采血后立即置于离心机， 3000 rpm离心15分钟收集血清，助于EP管中保存，于－80℃冻存；取大鼠整段大肠，沿长轴纵行剪开肠壁，观察黏膜情况、肿瘤大小、部位、数目；肝脏有无转移结节；如果有肉眼可见的肿瘤或肝转移结节，留取2份，一份送病理检查，福尔马林液固定、石蜡包埋、连续切片、HE染色，病理明确诊断。另一份同样依据以PBS液冲洗干净后于－80℃保存，依据不同的病理结果归入正常组，腺瘤组，腺癌组和肝转移组，正常组共15个标本，腺瘤组15个、腺癌组15个，肝转移组10个，留作蛋白质组学研究用。
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图 1. 大鼠肿瘤建模流程图
Figure 1 flow chart of establishing rat tumor model
2. 蛋白质组学研究
2.1 蛋白提取: 样品化冻后，取1g左右，用生理盐水清洗干净后，剪成1mm3见方的小块，加入500ul lysis buffer（9.5M Urea，4％CHAPS，65mM DTT，0.2% carrier ampholyte(3-10NL),罗氏cooktail酶抑制剂），使用DOUNCE匀浆器进行匀浆，然后超声破碎（80w，10秒8次，间隔15秒，置于冰上）。整个过程在冰浴进行。离心14000rpm，1小时，收集上清.。
2.2 蛋白定量：使用Bio-Rad protein assay reagent定量，采用Bradford 法。每瓶溶液第一次使用必须做标准曲线。若两次使用间隔超过两个月，务必重新做标准曲线。如果自行配制定量溶液，需充分溶解，并No.1滤纸过滤。
溶液配制： 20 mg G250 10ml 95％乙醇。 20 ml 85% 磷酸，溶解后加水定量至200 ml.标准蛋白溶解于水中1mg/ml。－20° C保存。
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定量：定量用10ml 塑料试管，一次性使用。
(1) 取7个试管，加入5ml定量溶液。
(2) 分别在试管中加入0ul，10ul, 20ul, 40ul,60ul, 80ul,100ul标准蛋白溶液，
再分别加水至100ul。室温静置5分钟后，在1小时内测定吸光值。
(3) 分光光度计灯打开预热15分钟后读数。先读空白，定量管每管读数3次取平
均值。
(4) 作标准曲线，样品定量时样品总量在10 ug-100ug。根据标准曲线计算样品浓度。
然后将每组内10－15个样品等量合并，重新定量后分装成100ug一管，置于500ul 离心管中，低温环境保存。
2.3 双向电泳：
2.3.1等电聚焦
加样：取出重泡涨液解冻，将100ug样品和重泡涨液充分混合，总体积为250ul。低速离心后，加入持胶槽,取出胶条撕去表面膜，胶面朝下从一端小心放入持胶槽，使重泡涨液浸润整个胶条，注意不要有气泡，胶条尖端和持胶槽尖端匹配，用矿物油覆盖。(考马斯亮蓝显色样品量为100－300ug，制备型样品量为1~10mg)
等电聚焦：重泡涨12hr; 500V-1hr; 1000V-1hr;8000V 6hr。整个过程在20°C进行，电流上限为70mA。结束后记下总电压小时和电流。胶条可在-20°C中保存或立即平衡。
2.3.2 平衡第一向胶条
平衡缓冲液：(50 mM Tris-HCl pH6.8, 6 M Urea, 30%Glycerol, 2%SDS, trace bromophenol blue)。Double distilled water to 200ml
7cm(2 ml) 13cm(2 ml) 18cm(3 ml)
DTT 20mg/gel 20mg/gel 30mg/gel IAA 50mg/gel 50mg/gel 75mg/gel DTT、IAA的量根据胶条数称好分装，－20°C冻存。
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胶条取出后，先在DTT的平衡缓冲液中，置于摇床上平衡15分钟后，然后转入IAA 平衡缓冲液中, 置于摇床上平衡15分钟。
2.3.3 SDS－PAGE
凝胶制备：按下表配制，抽气15分钟后加入SDS、10%AP、TEMED。
Separating Gel
Monomer Concentration (%T, 2.67%C) 12.5% X%
Water
Arc/bis (30%T, 2.67%C) 1.5M Tris-HCl, pH8.8 10%SDS
10% ammonium persulfate TEMED
Total Volume(V) 31.78ml
41.67ml
25 ml
1.0ml
500ul
50ul
100ml
V-all the following
X*V/30 ml
V/4 ml
V/100 ml
V/200 ml
V/2000 ml
凝胶体积：
Separating Gel(one gel)
Spacer Thickness
7cm length 16cm length 20cm length
1.0mm 1.5mm 30ml
40ml
50ml
65ml
凝胶灌至离玻璃板顶端0.5cm处，然后用水封住，聚合约需1小时。聚合后吸去水，用电泳缓冲液冲洗2遍，吸干。IEF胶条转移至第二向：用镊子夹住IEF胶条的一端，小心将胶放到第二向胶的顶端，胶面朝外，勿接触玻璃板。特别注意胶条之间不要有气泡。然后用0.5%的琼脂糖封住。0.5%的琼脂糖用0.1g琼脂糖溶解在20ml1x电泳缓冲液，加入痕量溴酚蓝后，加热融化。
电泳条件设置
1.0mm Spacer 15mA/gel 走15 分钟 ,然后 30mA/gel 走至溴酚蓝离胶
下沿0.5cm。
1.5mm Spacer 20mA/gel 走15分钟，然后40mA/gel走至溴酚蓝离胶下
沿0.5cm。
2.4 染色: 银染，水洗5分钟，40％乙醇、10％乙酸重复固定15分钟，重复2遍。30％乙醇、0.2％硫代硫酸钠、6.8％乙酸钠30分钟。水洗5分钟，重复3遍。2.5
11
％碳酸钠，0.04％的福尔马林，显影至背景出现，1.46％EDTA溶液停显10分钟。水洗3分钟，重复3遍。
2.5扫描、凝胶图像分析及统计分析：凝胶通过UMax Powerlook 2110XL扫描获得12张2-D图谱（每组3张，共4组）。分别为正常黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌、腺癌肝转移。利用ImageMaster软件分析图谱，将以上4组图谱作比较，蛋白点按照它们的相对体积 (relative volume)进行定量分析，据此来比较4组2-D图谱上相同位置蛋白点的表达强度的差异。选取有至少1.5倍量变的蛋白斑点作为鉴定的差异候选蛋白。统计方法：计算每组中同一蛋白点在3张2-D图谱上相对体积(relative volume)的均值，统计分析的4组的均值，2组间的比较采用t检验，2组以上的比较采用单因素方差分析。相对体积的计算按照如下方法：每个点的体积 / 胶上所有点的体积
2.6 质谱及生物信息学分析：选取图像分析得到的差异蛋白点，切下差异点，做胶内酶解，通过MALDI-TOF分析，获得蛋白点的相应肽质量指纹图谱，将肽质量指纹数据通过因特网在蛋白质序列库中进行搜索，搜索软件为Mascot，数据库选择为NCBInr，物种为大鼠，以Mowse分值为基础的概率（P）评价数据库搜寻结果的质量，分值大小表示鉴定蛋白属于随机匹配的可能性，大于63表明具有显著性意义。
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