细菌分类鉴定规程
细菌分类鉴定规程
杜艳、余翔、罗国升
新菌鉴定主要流程：
1、潜在新菌的确定
拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN (或EzTaxon server (进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。
2、选择标准菌株构建进化树
选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。
3、购买标准菌株
根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。具体信息可以在上查找。
标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重新分类。总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。
4、表型特征实验
培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。
细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。
特殊的细胞结构：鞭毛(着生位置、数量)，芽胞(形状、着生位置、是否膨大)，孢子(孢子形状、着生位置、数量、排列)，其它(荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连鞘体等)。
超微结构：细胞壁、细胞内膜系统、放线菌抱子表面特征等。
细胞内含物：异染颗粒、聚β-羟基丁酸等类脂颗粒、硫粒、气泡、伴胞晶体等。
染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色。
运动性：鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式，注意区别鞭毛泳动和滑动。
生长特征：生长温度、pH、盐耐受性范围。
5、生理生化试验
营养类型：光能自养、光能异养、化能自养、化能异养及兼性营养型；
等的利用；
对氮源的利用能力：对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N
2
对碳源的利用能力：对各种单糖、双糖、多糖以及醇类、有机酸等的利用；
对生长因子的需要：对特殊维生素、氨基酸等的依赖性；
需氧性：好氧、微好氧、厌氧、兼性厌氧；
对温度及pH的适应性：最适、最低及最高生长温度及致死温度；
对渗透压的适应性：对盐浓度的耐受性或嗜盐性；
对抗生素及抑菌剂的敏感性：对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、弧菌抑制剂或某些染料的敏感性；
代谢产物：各种特征性代谢产物；
与宿主的关系：共生、寄生、致病性等。
6、化学分类特征
目前经常使用的特异性细胞化学特性包括：细胞壁化学组分、枝菌酸、脂肪酸、磷酸类脂、甲基萘醌、全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析等。其分析技术涉及光谱、色谱、生物化学及分子遗传学的分析技术。
常用的化学分类指标
鉴定指标方法举例
细胞壁的化学成分薄板层析真细菌含壁酸和肽聚糖；古
菌类型变化，无壁酸
枝菌酸薄层层析，气质联用诺卡氏菌形放线菌
磷酸类脂硅胶薄板层析放线菌等
脂肪酸组分毛细管气相色谱芽胞杆菌等
全细胞蛋白SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳根瘤菌
核糖体蛋白双向凝胶电泳放线菌
同工酶多位点酶电泳热带根瘤菌
1) 细胞壁组分分析：
细胞壁氨基酸组分可用于属的区分，而糖组分则可用于种的区分。
2) 脂肪酸组分分析
脂类是细胞膜的主要组分。在原核生物中，细菌具有酰基脂(酯键连接)，最常见的是磷脂和甘油脂。在某些放线菌和棒杆菌中有特异的磷脂，即磷脂酸肌醇甘露糖苷。鞘磷脂则发现于某些革兰氏阴性菌，如拟杆菌。古菌具有醚脂(醚键连接)。某些特殊组分只在特定的细菌中存在，如多不饱和脂肪酸是蓝细菌的特征组分，甲基化的分枝脂肪酸为革兰氏阳性菌所特有，羟基化脂肪酸为革兰氏阴性菌的特征。
3) 异戊二烯醌型分析
三大类即泛醌(Q)、甲基萘醌(MK)和酰甲基萘醌，类异戊二烯的数目和侧链的双氢键表明了醌的种类。异戊二烯醌的分析方法有两种，色谱法和物理化学法。分类意义主要在于某类组分的有无。多数严格好氧的革兰氏阴性菌仅产泛醌，兼性厌氧的革兰氏阴性菌则不定，而多数好氧和兼性厌氧的革兰氏阳性菌仅产甲基萘醌。
7、基因型特征
1) 16S rRNA同源性分析
原核生物的rRNA分为3种，分别为5S rRNA (约120bp)、16S rRNA (约1540bp)、23S rRNA (约2900bp)，位于同一操纵子中。对16S rRNA基因序列的分析，适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系；而对23S rRNA基因序列的分析，则适合对临床常见致病微生物鉴别诊断；16S～23S rRNA基因序列(ITS)被认为是细菌分型探针合成的合适部位，所以更适合种内菌株间的鉴别。
大量证据表明，两个菌株16S rRNA基因序列相似性＜97%则不是同一个种。单靠16S rRNA基因序列是不能描绘一个新种的，但是它是分离出新种的首要标志。两个菌株16S rRNA基因序列相似性＞97%，则要用DNA-DNA杂交或更高分辨率的基因序列分析等方法进行进一步的研究。16S rRNA基因序列相似性＜95%，则要结合其他方法以便确定是否为新属。
如果是新种，作者要指出新种与其所属的属中的其他种的不同点。如果这个属包含很多不同的种，则要科学的选择一部分进行比较，但必须是模式种。如果是新属，则要区分新属和其相近的属。近年来发表的文章中属的描述没有和已存在的属进行区分，违反了分类学的基本原则。
这些界限在实践中不一定准确，化学分类的数据也是关键，还要结合其他方面的鉴定，不能单凭16SrRNA基因序列下结论。
2) G+C mol%测定
每一个微生物种的DNA中G+C mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中G+C mol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种
的G+C mol% 范围。DNA中G+C mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA中G+C mol%含量的变化范围一般在25％～75％；而放线菌DNA 中的G+C比例范围非常窄(37％～51%)。通常认为，种内菌株间相差不超过4%，属间菌株间相差不超过10%，相差低于2% 没有分类学意义。因此可利用
G+C mol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其G+C mol％含量相同或者近似，但G+C mol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA的G+C mol% 在37～51之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。
3) DNA-DNA杂交
DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100% 。如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100% 。由此；杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的DNA杂合率可高达100%，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA 杂合率较低，约有70%。G+C mol% 的测定和DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
菌株间16S rRNA基因序列相似性＞97%需要做DNA-DNA杂交，＜97% DNA-DNA杂交可做可不做。DNA-DNA杂交同源性与其亲缘性关系的判断标准：杂交同源性为70-100%，属于同一个种的细菌；同源性20-70%，属于属内紧密相关的种；同源性小于20%，则属于相关的不同属。目前DNA-DNA杂交的标准方法为固相膜杂交。
8、序列的提交
向NCBI提交16S rRNA gene序列。具体步骤见资料介绍部分。
9、菌株的保藏
向至少两个不同国家的世界公认的保藏机构保藏菌株，国内选择CGMCC、CCTCC等，国外的选择KCTC、KACC、DSMZ、NRRL、JCM、ATCC等。
菌种保藏要有菌株名称，所用培养基，菌株的生长特性(最适生长温度、pH等)，16S rRNA gene序列等信息。新菌鉴定相关资料：
一、菌种命名专家：Dr. Jean Euzeby (IJSEM List Editor，
Jean Euzéby,Laboratoire de Bactériologie,école Nationa le Vétérinaire,23 chemin des Capelles, 31076, Toulouse cedex 03, France；
Fax: + 33 (0)5 61 19 39 75; E-mail: @ 或者)。
二、菌种保藏：我们实验室保藏过菌的机构有：
1．CCTCC(China Center for Type Culture Collection) 中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。网址：。
2. CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Cen ter) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京微生物所)。网址。
3. KACC(Korean Agricultural Culture Collection) 韩国国家农业生物技术研究所——农业微生物菌种保藏。网址：。
4. KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型培养物保藏中心。网址：。
5. NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心。网址：。
6. DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)德国微生物菌种保藏中心。网址：。
三、购买菌种(我们实验室已从下列机构购买过菌种)
1、CCTCC(China Center for Type Culture Collection) 中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。网址：。
2、CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Cente r) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京微生物所)。网址。
3、KACC(Korean Agricultural Culture Collection) 韩国国家农业生物技术研究所——农业微生物菌种保藏。网址：该保藏中心可以免费提供标准菌株。
4、KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型培养物保藏中心。网址：是由政府科学技术部门支持的半政府性质的菌种保藏中心。主要从事应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏、发酵、分子生物学、分类学等的研究。
5、DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm bH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 德国微生物菌种保藏中心。网址：DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，该中心保藏的菌种可出售。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。
6、CCUG(Culture Collection, University of G?teborg, Sweden) 瑞典Geborg大学菌物保藏中心。网址：。
7、JCM (Japan Collection of Microorganisms)日本微生物保藏中心。网址：。
8、NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心。网址：。
四、化学成分测定
1、全细胞脂肪酸分析
上海市公共卫生临床中心(联系人：朱召芹联系电话：传真：0272电子邮箱：。
2、呼吸醌分析
中国典型培养物保藏中心(武汉大学及云南大学云南省微生物研究所(。
3、极性脂分析
中国典型培养物保藏中心(武汉大学及云南大学云南省微生物研究所(。
4、G + C mol%
中国典型培养物保藏中心(武汉大学及云南大学云南省微生物研究所(。
4、细胞壁肽聚糖及糖类分析
广东省微生物研究所(及云南大学云南省微生物研究所(。
5、DNA-DNA杂交广东省微生物研究所(。
五、向GenBank提交序列
向NCBI提交序列常用的程序有两个，一个是在线提交的BankIt，一个是用软件Sequin。用那种办法，根据不同的需要。
BankIt:(在线提交页面：、适合单个或少量几个的提交
2、喜欢用在线的方式提交，无需下载个软件
3、你的序列的注释不复杂
4、提交你的序列时不需要用到序列的分析
Sequin（下载页面：）
1、提交的是批量而且比较复杂的序列
2、
you are submitting mutation, phylogenetic, population, environm ental, or segmented sets
3、喜欢图形的界面，有更的选项和功能，可以批量修改
4、获得相关的分析工具
这里简单介绍一下在线提交序列程序BankIt，Sequin也是大同小异的。提交网址：进入网站，点击注册。
1、使用BankIt提交序列时需要先在NCBI上注册一个账号（改版后），获得你的账号和密码，登陆，进入GenBank Submissions页面，填写相关信息后，点击continue。如下：
2、填写序列的作者信息和所提交序列用到的参考文献（2-3篇），点击continue。
3、上传序列（text格式文件），可以直接粘贴也可以上传text文件，点击continue。
6、填写序列名称，点击continue。
6、Submission Category
7、Source Modifiers
8、填写引物信息PCR Prime rs
9、提交，检查确认无误后就可以点击continue提交序列。
10、Review Submission 确认信息，点击提交序列。
最后NCBI会给您发个邮件，大概过一个月后就能查到您的注册号了，如果有问题NCBI会邮件和您联系。如果是用Sequin，填好资料过程中可以随时保存，最后你只需把最后确认的文件向NCBI发封邮件就可以了。
六、分析时用的网站和软件
常用网站：
1、序列比对网站：
1) NCBI ( EzTaxon server （推荐使用）
此网站是韩国的，需要注册，是国际承认的。16S比对结果比NCBI上的结果好的是，它是相当于把NCBI过了筛，全部是模式菌株，而且更新很快。可以将最近的种属关系显示出来，同源性，以及碱基差异个数等等结果。在此网站比对时要注意序列方向的正确性，它不能自己识别正反向。一般我们在做新菌序列比对时可以先用EzTaxon server ，然后再用NCBI里的“Align two or more sequences”选项比一遍，最后综合看2个结果。
2、查找模式菌的网站LPSN：全名叫List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature 此网站有详细的模式种，原核生物的分类关系，具体的属，科，目，纲等所包括的东
西，但是它更新比较慢。所以我们要注意多查看IJSEM上的信息。网站，我们在此网站上的注册名是，密码是emicrobiology.
常用软件
16S 序列分析好了以后选取合适的序列构建进化树，序列选好以后首先用多序列比对工具Clustal X（本地的）或Clustal W（在线的）进行比对。比对后，可以对其进行掐头去尾，再保留结果。然后用MAGA软件将生成的aln格式的文件转化为mega格式，再用MEGA做进化树。现在做进化树一般都要求有3种，NJ,MP和ML.一般我们做NJ，MP树的时候用MEGA ,做ML树的时候用PhyML 或者PHYLIP.下表是构建进化树是可用的软件。
表1 构建分子进化树相关的软件
基于距离的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小进化法）和NJ （Neighbor-Joining，邻接法）等。其他的几种方法包括MP
（Maximum parsimony，最大简约法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及贝叶斯（Bayesian）推断等方法。其中UPGMA法已经较少使用。一般来讲，如果模型合适，ML的效果较好。对近缘序列，有人喜欢MP,因为用的假设最少。MP一般不用在远缘序列上，这时一般用NJ或ML.对相似度很低的序列，NJ 往往出现Long-branch attraction（LBA，长枝吸引现象），有时严重干扰进化树的构建。贝叶斯的方法则太慢。对于各种方法构建分子进化树的准确性，一篇综述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005，22（3）：792-802）认为贝叶斯的方法最好，其次是ML,然后是MP.其实如果序列的相似性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大。
对于NJ和ML，是需要选择模型的。对于各种模型之间的理论上的区别，这里不作深入的探讨，可以参看Nei的书。对于蛋白质序列以及DNA序列，两者模型的选择是不同的。以作者的经验来说，对于蛋白质的序列，一般选择
Poisson Correction（泊松修正）这一模型。而对于核酸序列，一般选择Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型。如果对各种模型的理解并不深入，作者并不推荐初学者使用其他复杂的模型。Bootstrap几乎是一个必须的选项。一般Bootstrap的值>70，则认为构建的进化树较为可靠。如果Bootstrap的值太低，则有可能进化树的拓扑结构有错误，进化树是不可靠的。
对于进化树的构建，如果对理论的了解并不深入，推荐使用缺省的参数。需要选择模型的时候（例如用NJ或者ML建树），对于蛋白序列使用
Poisson Correction模型，对于核酸序列使用Kimura-2参数模型。另外需要做Bootstrap检验，当Bootstrap值过低时，所构建的进化树其拓扑结构可能存在问题。并且，一般推荐用两种不同的方法构建进化树，如果所得到的进化树类似，则结果较为可靠。
细菌的分类与命名 细菌分类学 细菌分类学（taxonomy）是指对细菌进行分类、命名与鉴定的一门学科。它的任务是在全面了解细菌的生物学特征的基础上，研究它们的种类，探索其起源、演化以及与其他类群之间的亲缘关系，进而提出能反映自然发展的分类系统，并将细菌加以分门别类。它包括三个方面：分类（classification）、命名（nomenclature）和鉴定（identification）。 一、基本概念 1.细菌分类是根据每种细菌各自的特征，并按照它们的亲缘关系分门别 类，以不同等级编排成系统。分类有两种：①以细菌的形态和生理生化特性为依据的表型特征分类法，包括有传统分类法（classical classification）和数值分类法(numerical classification)；②用化学分析和核酸分析，以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源程度进行分类称种系分类（phylogenetic classification）或自然分类（natural classfication）。 2.细菌命名在分类基础上，给予每种细菌一个科学名称，使之在生产实践、临床实践和科学研究工作中相互交流成为可能。按照细菌命名的法规，能保证所有的科研工作者以同样方式给予细菌命名。 3.细菌鉴定将未知细菌按分类原则放入系统中某一适当位置和已知细菌比较其相似性，用对比分析方法确定细菌的分类地位。若与已知细菌相同即采用已知菌的名称，不同者则按命名原则确定一个新名称。 二、分类等级 细菌的分类等级和其他生物相同，依次为界（kingdom）、门（division）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）。细菌属于原核生物界（procaryotae），包括有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体。 分类等级拉丁字尾比较固定，表示方法如下：目-ales、亚目-ineae、科-aceae、亚科-oideaae、族-eae、亚族-inae。 种是细菌分类的基本单位，将生物学性状基本相同的细菌群体归成一个菌种；性状相近、关系密切的若干菌种组成一个菌属；相近的属归为一科；依次类推。在两个等级之间，可添加次要的分类单位，如亚门、亚纲、亚属和亚种等。群和组不是正式分类等级，是泛指具有某种共同特性的某个集体，任何等级都可借用。同一菌种的各个细菌，在某些方面仍有一定的差异，可再分成亚种（subspecies），亚种以下的分类等级为型（type），以区别某些特殊的特征。例如抗原结构不同而分的血清型（serotype）；对噬菌体敏感性不同的噬菌体型（phagetype）；对细菌素敏感性不同的细菌素型（bacteriocin-type），生化反应和某些生物学性状不同的生物型（biotype）。 由不同来源分离的同一种、同一亚种或同一型的细菌，称为株（strain）。株的建立是从一次单独分离物的单个原始菌落传代的纯培养物，例如从10个肺结核患者的痰液中分离出的10株结核分枝杆菌。具有某种细菌典型特征的菌株称为模式菌（typical strain）或标准菌株（standard strain
16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用* 刘文强1，贾玉萍2，赵宏坤3 (1.聊城大学农学院，山东聊城252059；2.山东大学生命科学学院，山东济南252100；3.山东农 业大学动物科技学院，山东泰安271018) 摘要：细菌的16 S 核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。其具体操作是，以聚合酶链式反应(PCR)分离细菌样本中的16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息，再与16 S rRNA 数据库中的序列数据进行比较，确定其在进化中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章综述了16 S rRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法，以及在细菌分类鉴定中的应用。 关键词：16 S rRNA；细菌；鉴定；分类 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。Cai H Y等[1]认为，rRNA基因序列己成为一个分子指标，可以广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。目前，大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[2]。 116 S rRNA作为细菌分子鉴定的依据
结课论文 题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的 应用 学生姓名：刘* 学号：2016304110*** 专业：生物化学及分子生物学 结业课程：系统细菌学 中国·武汉 2016 年12 月
16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用 刘* 2016304110*** 华中农业大学生命科学学院，武汉 [摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。 20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。特别是16S rRNA基因序列分析技术的出现，使细菌进化与否可以通过试验研究来证实。目前，关于PCR扩增16S rRNA基因用于细菌分类和鉴定的研究越来越多，大多数细菌的16S rRNA基因均已被测序。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 1.16S rRNA基因 16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。目前，细菌系统分类学研究中
天津科技大学 《微生物学》结课论文 题目：细菌的分类鉴定及进化地位分析 ） 学院：生物工程学院 专业：制药工程（生物制药） 姓名：牛天鸣 学号： 指导老师：李玉 '
【摘要】 细菌的分类鉴定与细菌的研究和应用有重要的影响。准确地鉴定细菌类别，根据其菌种种类不同，分别针对肠杆菌、阳性球菌、非发酵菌等菌种设计不同药敏板条的抗生素组合，可以指导临床应用用药。目前，细菌分类鉴定方法主要包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类。细菌的进化对于深入认识物种分化、生境适应、毒力进化、耐药性产生芡延等表型进化过程有着重要意义。 关键词：细菌；分类；鉴定；进化。 一、细菌的分类鉴定 目前，细菌分类鉴定的研究已经得到了长足的发展和进步，鉴定依据不再仅局限于形态、生理生化和生态学等表型特征，而是采用不同学科的现代技术和方法从细胞水平、分子水平寻找新的鉴定依据。现在，通常把细菌分类鉴定的方法有4种：传统分类法、2细菌的数值分类和自动化鉴定、化学分类法、分子遗传学分类鉴定法。 1传统分类法 传统分类法又称为经典分类法，是根据微生物的形态特征、培养特征及生理生化特征等表型分类学特征进行分类鉴定的方法[1]。一般传统分类指标常用于初步分类。现今存在于《伯杰氏细菌分类手册》的细菌分类单位名称大都建立在传统分类基础上[2]。由于细菌个体小而简单，仅依据简单的指标不足以区分它们，这就需要增加生理生化特征甚至其他非形态特征来进一步比较和区分。传统分类法中的形态特征常用作分类系统中科以上单元的划分，而形态结构特征结合生理生化特性可以用于科以下单元的分类。随着分子生物学技术的迅猛发展，传统分类方法受到了巨大的冲击，但仍是多相分类学的研究基础。 · 传统的分类鉴定方法主要依赖于表型分析、个体形态学观察，主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况: 细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘的生长状况; 在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况; 半固体上穿刺接种后，观察细菌生长状态。在鉴别培养基上培养，观察结果是否跟预期结果相同。形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义，生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异，表现出不同的生长特性[3]。通
16S r D N A鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪： AB3500、AB3130 3.2试剂 DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit； 3.3耗材 移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；
细菌分类鉴定方法的研究进展 目录 细菌分类鉴定方法的研究进展 (2) 摘要 (2) ABSTRATC (3) 1、引言 (4) 1.1细菌分类鉴定 (4) 1.1.1 细菌常规鉴定方法 (4) 1.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定 (4) 1.1.3化学分类鉴定法 (4) 1.1.4分子遗传学分类鉴定法 (4) 1.2细菌分类鉴定方法的前景 (5) 细菌的鉴定方法的介绍与总结 (5) 1、细菌常规鉴定方法 (5) 1. 1 免疫诊断技术 (5) 1. 1. 1 凝集试验 (5) 1. 1. 2 免疫酶技术 (5) 1.1. 3 免疫荧光技术 (5) 1. 1. 4 放射免疫测定技术 (6) 1. 1. 5 免疫胶体金标记技术 (6) 1. 2 蛋白质图谱分析 (6) 2、细菌的数值分类和自动化鉴定 (6) 3、化学分类鉴定法 (7) 3.1 磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6] (7) 3．2 高效液相色谱（HPLC）[7] (7) 3.3 气相色谱（GC）[7] (7) 4、分子遗传学分类鉴定法 (7) 4. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定 (7) 4. 2 核酸杂交技术 (7) 4. 3 限制性核酸内切酶分析法 (7) 4. 4 质粒图谱分析法 (7) 4. 5 脉冲场凝胶电泳分析法 (8) 4. 6 PCR技术 (8)
4. 7 16SrRNA 序列和16S～23SrRNA 间区序列分析法 (8) 4. 8 微生物全基因组测序 (8) 6、参考文献 (9) 细菌分类鉴定方法的研究进展 摘要 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法[1]是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA 进行分析,核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA 和16 ～23SrRNA 序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。 关键词：细菌分类鉴定表型鉴定分子遗传学鉴定
革兰氏阳性菌 革兰氏阳性菌 革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。 在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感），而对链霉素、氯霉素等敏感。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。 革兰氏阴性菌,大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病.常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感,可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。 革兰氏阳性菌，大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。可以选择青霉素族，头孢曲松钠等。 革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存于肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特征为有一层outer membrane 与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。 除了大肠杆菌外，变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌与阴性菌
一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。
菌种鉴定标准操作规程 目的：建立菌种鉴定标准操作规程 范围：适用于******鉴定标准操作 职责： 内容： 1 整体操作步骤 1.1 纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。 1.2 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 1.3 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则 选用API20NE 试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实 验后选用API20E 试剂条进行鉴定。 1.4 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则 选用API Strep 试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph 试剂条进行鉴定。 1.5 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB 试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne 或其他试剂条进行鉴定。 1.6 选定正确的试剂条以后，根据不同的API 试剂条的标准操作规程准备接种物， 进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API 鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 2 革兰氏染色 2.1 染色剂的配制 2.1.1 结晶紫染色液： 甲液：结晶紫 1.0g 95%的酒精20ml 乙液：草酸铵0.8g 水80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置48h 使用，置密闭棕色瓶中储存。
1.7 碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 水300ml 配制时先用3～5ml 水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再 加水稀释至300ml ，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 1.8 稀石碳酸红溶液: 碱性品红 1.0g 石碳酸 5.0ml 95%乙醇10.0ml 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml ，摇匀。 2.2 操作: 2.1.2 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则 先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 2.1.3 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～ 3 次，以固定涂片。 2.1.4 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色1 分钟。 2.1.5 水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接 冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。 2.1.6 滴加碘液冲去残水并媒染约 1 分钟，用纯化水冲去碘液吸干。 2.1.7 滴加95%的乙醇脱色约20～30 秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。 2.1.8 稀石碳酸红溶液染色 1 分钟后，用水洗净晾干或吸干。 2.1.9 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用 100 倍物镜观察细菌革兰氏属性。革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。 3 简单染色 3.1 用于真菌与细菌的鉴别。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 … 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
细菌分类鉴定规程 细菌分类鉴定规程 杜艳、余翔、罗国升 新菌鉴定主要流程： 1、潜在新菌的确定 拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN (或EzTaxon server (进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。 2、选择标准菌株构建进化树 选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。 3、购买标准菌株 根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。具体信息可以在上查找。 标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重新分类。总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。 4、表型特征实验 培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。 细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。
. 16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常
3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal . . AB3130AB3500、凝胶成像仪：Cycler；VersaDoc MP 4000；基因分析仪：试剂3.2 10×Taq 酶，试剂：TaqDNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR2+，；测序试剂：BigDye TerminatorExoSAP，ddHO等；-Buffer(MgIT)，dNTPs2；BigDye XTerminator Purification Kit5×Sequencing Buffer；耗材3.3TM Optical Micro Amp；离心管：1.5mL、200μL；1000μL移液器吸头：、200μL、10μL TM Well Reaction Plate96-；Micro Amp；Optical Adhesive Film引物3.4 扩增长度名称16SrDNA 序列 正向引物27F -3'5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 500 bp左右第1部分5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 反向引物519R 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 正向引物357F 部分750bp左右第25'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 1115R 反向引物 5'- AAA CTY AAA KGA A TT GAC GG-3' 926F 正向引物部分左右560 bp第35'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 1492R 反向引物 其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程 核酸提取
第十章微生物的分类与鉴定(参考答案) 一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年R.H.Whittaker 将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。 4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和L.Margulis“提出了一个崭新的三域学说。 13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为-196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为37℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为150～170℃；(5)E.coli的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为 2.5～10 X 4.5～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过3个/L；(9)细菌总数不得超过100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。
） 革兰氏阳性菌 革兰氏阳性菌 革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。 在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感），而对链霉素、氯霉素等敏感。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。 革兰氏阴性菌,大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病.常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感,可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。 革兰氏阳性菌，大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。可以选择青霉素族，头孢曲松钠等。 革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存于肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特征为有一层outer membrane 与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。 … 除了大肠杆菌外，变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌与阴性菌