第28卷第1期2007年2月西安交通大学学报(医学版)
Jo ur nal of X i p an Jiao to ng U niv ersity (M edical Scie nce s)V ol.28N o.1
Feb.2007
榄香烯联合三苯氧胺对乳腺癌MCF -7细胞株的抑制效应
周小娟,郑 棋,赵小丽,马海琳
(西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤内科,陕西西安 710061)
摘要:目的 观察榄香烯和三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应,尤其是两者联合应用有无协同增效作用。方法 将M CF -7细胞培养于RPM I1640培养基中,置入37e ,100%湿度,5%(体积分数)的CO 2培养箱内。接种细胞并加入实验药物,用CCK -8法检测三苯氧胺联合榄香烯对细胞的增殖抑制效应,用酶标仪在450nm 测量每孔吸光度值,计算每组细胞抑制率。结果 无毒剂量的榄香烯与治疗剂量的三苯氧胺联合应用,吸光度均值较单用三苯氧胺明显下降,并且相应的细胞抑制效应较单用组明显上升。结论 无毒剂量的榄香烯能够使三苯氧胺对乳腺癌细胞的抑制效应显著增强,提示榄香烯与三苯氧胺联合应用具有协同作用。关键词:乳腺癌;三苯氧胺;榄香烯;协同作用
中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:1671-8259(2007)01-0074-04
The inhibitory effect of elemene combined with tamoxifen
on the breast cancer MCF -7cell line
Zho u Xiaojuan,Zheng Q i,Zhao Xiao li,M a H ailin (Department of Oncolog y,the First Affiliated H ospital,M edical Scho ol o f Xi p an Jiaotong Univ er sity,Xi p an 710061,China)
ABSTRAC T:Objective T o e xplo r e if elemene ca n syner gize tam ox if en thr ough using non -cy toto x ic dose o f elem ene and tamo xifen in com bination o n M CF -7cell line o f br ea st cancer.Methods First,M CF
-7cell line w as cultur ed in R PM I1640.T hen,T A M p s inhibito ry e ff ect united with elemene o n M CF -7cell line w as analy zed by using
CCK -8test.
Results W hen adding no n
-cyt oto xic do se o f elemene and cur ative dose of t amo xifen into the tw o exper ime ntal g ro ups,the absor ptiv it y in the two g r oups r educed notably,co mpar ed w ith that o f the gr o ups using tamo xifen a lo ne;acc or dingly,the inhibitio n r ate in tw o m ix ing gr o ups incr eased obv io usly co mpare d w ith that in sing le -dr ug g ro ups.
C on clusion Elemene of innoc uo us dose can r emar kably enha nce the inhibito r y ef fect o f
tamo xifen,which indica tes that e leme ne may syner gize the ef fec t of tamo xife n on brea st cancer.
KEY WORDS:bre ast cancer ;t amo xifen;elem ene;syner gistic e ffe ct 收稿日期:2006-04-14 修回日期:2006-06-24
基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(No.20021210-G3(05))作者简介:周小娟(1954-),女(汉族),副教授,硕士生导师.主要从事
乳腺癌的综合治疗和研究.
乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤。它是一种全身性疾病,全身辅助治疗可降低复发和死亡的风
险[1]。乳腺癌内分泌治疗作为全身治疗的方法之一,在乳腺癌术后预防复发及转移后的治疗具有十分重要的作用[2]
。三苯氧胺(tamox ifen,TAM )作为内分泌治疗一线药物已经广泛应用于乳腺癌高危妇女的预防性治疗[3]以及乳腺癌雌激素受体阳性(ER+)患者的辅助内分泌治疗
[4]
。然而同类抗雌激素药物对
于TAM 治疗失败者却效果甚微;第3代芳香化酶抑
制剂作为绝经后TAM 治疗失败后的二线药物,虽具有高效、选择性、毒副作用少等特点,但仅对绝经后患
者有效,且价格较TAM 高。T AM 作为乳腺癌患者内分泌治疗的首选药物,长期应用有可能增加子宫内膜癌的危险性[5-6]。还会产生继发耐药或肿瘤的复发和转移,均影响其临床疗效。本研究采用中药莪术提取物榄香烯(elem ene,ELE )和T AM 联合应用于乳腺癌M CF -7细胞系,探索ELE 对TA M 有无协同增效作用,从而为ELE 参与乳腺癌的辅助治疗,提高内分泌药物的疗效开辟新的思路。1 材料与方法
1.1 主要试剂 乳腺癌M CF -7细胞株,由西安交通大学医学院病理学系提供;RPMI1640培养基和胰蛋白酶,购自美国Gibco 公司;胎牛血清(FBS)购自(中国)鼎国公司;胰岛素、EDTA 和三苯氧胺(TAM )系美国Sigm a 公司产品;CCK -8试剂由同仁化学研究
1期周小娟,郑棋,赵小丽,等.榄香烯联合三苯氧胺对乳腺癌M CF-7细胞株的抑制效应所中国(上海)代办处提供;榄香烯(ELE)4e冰箱保
存,系中国大连金港制药有限公司产品。
1.2常用工作液的配制①磷酸缓冲液(PBS)的配制:称取KCl0.2g,KH2PO40.2g,NaCl8.0g, Na2H PO4#12H2O
2.89g,混合溶解于1000mL的双蒸水中,并调定pH7.2-7.4。②消化液的配制:胰蛋白酶粉末0.25g,EDT A0.04g,加入PBS液100mL并用磁力搅拌器使其完全溶解,0.22L m微孔滤膜过滤除菌,分装,于-20e保存。
1.3细胞培养将M CF-7细胞培养于含100m L/L 胎牛血清的RPM I1640培养基中,37e,100%湿度,5%(体积分数)的CO2培养箱内。
1.4CCK-8法检测三苯氧胺联合榄香烯对细胞增殖的抑制效应将细胞接种于96孔培养板,培养24h。以8孔为一组分别加入4个不同浓度的T AM (T2-T5,即1.50@10-5、1.50@10-6、1.50@10-7、1.50@10-8m ol/L)和4个不同浓度的ELE(E1-E4,即6.15@10-1、6.15@10-2、6.15@10-3、6.15@ 10-4g/L)溶液,最后加入2种不同浓度的混合液,在培养箱内培养48h。然后每孔加入10L L CCK-8液,培养4h,用酶标仪在450nm测量每孔吸光度值,计算每组细胞抑制率。
1.5数据分析用SPSS11.5统计分析软件进行方差分析,采用LSD及Dunnett法两两比较进行描述性统计,方差齐性检验和绘制均数分布图(A:0.01)。
2结果
2.1TAM、ELE不同浓度组平均吸光度的变化规律随着TAM的浓度由T2组-T5组(1.50@ 10-5、1.50@10-6、1.50@10-7、1.50@10-8mo l/L)逐渐降低,平均A值逐渐升高;随着ELE的浓度由E1组-E4组(6.15@10-1、6.15@10-2、6.15@ 10-3、6.15@10-4g/L)逐渐降低,平均A值逐渐升高,将无毒剂量(6.15@10-3g/L)的ELE与中等有效剂量的T AM合用后,两联合用药组(T3E3组与T4E3组)的平均A值均较单用药组(T3、T4和E3组)的平均A值明显下降(图1)。
随着TAM的浓度由T2组-T5组逐渐降低,平均抑制率[存活率(%)=用药组吸光度/对照组吸光度@100%;抑制率(%)=1-存活率]逐渐下降;随着ELE的浓度由E1组-E4组逐渐降低,相应各组细胞的平均抑制率则逐渐下降。由此可见TAM和ELE对MCF-7细胞的抑制效应均具有剂量依赖性,其平均抑制率分别与其浓度呈正相关(图2)
。
图1各组吸光度均数分布图(CCK-8)
F ig.1T he scatter g ram o f each g ro up p s mean absor ptivit y by CCK-8method
T:TAM(m ol/L);T2:1.5@10-5;T3:1.5@10-6;T4:1.5@ 10-7;T5: 1.5@10-8;E:E LE(g/L);E1: 6.15@10-1;E2: 6.15@10-2;E3:6.15@10-3;E4:6.15@10-
4
图2TAM与ELE作用下各加药组细胞抑制率的变化曲线Fig.2T he changes of inhibitio n r ate wit h different concen-t ratio n of T A M and EL E
T:T AM(mol/L);T2: 1.5@10-5;T3: 1.5@10-6;T4: 1.5@ 10-7;T5:1.5@10-8;E:ELE(g/L);E1: 6.15@10-1;E2: 6.15 @10-2;E3: 6.15@10-3;E4: 6.15@10-4
2.2TAM、ELE不同浓度组吸光度变化的比较
结果见表1。
表1各组间A值均数的差异性的比较
T able1Comparison of the var iability amo ng the A means in all g ro ups
Gr oup?x?s
Contro l 1.5275?0.0244
T20.9062?0.1335a
T3 1.0863?0.0207a b
T4 1.2162?0.0725a bc
T5 1.4250?0.0316bcd
E1 1.0200?0.1061a de
E2 1.2062?0.0529a bce f
E3 1.4500?0.0307bcdfg
E4 1.4700?0.0283bcdfg
T3E30.8688?0.0164a cde fg hij
T4E3 1.0000?0.0131a dehij
a:P<0.01,compared w ith control;b:P<0.01,T3-T4E3v s. T2;c:P<0.01,T4-T4E3v s.T3;d:P<0.01,T5-T4E3v s. T4;e:P<0.01,E1-T4E3v s.T5;f:P<0.01,E2-T4E3v s. E1;g:P<0.01,E3-T4E3v s.E2;h:P<0.01,E4-T4E3v s. E3;i:P<0.01,T3E3,T4E3v s.E4;j:P<0.01,T4E3v s.T3E3
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西安交通大学学报(医学版)第28卷
2.3 各组细胞抑制率的变化规律 当TAM 的浓度从T2-T5下降时,实验组细胞抑制率逐渐下降(P <0.01,图3);当ELE 的浓度由E1-E4降低时,实验组细胞抑制率逐渐下降(P <0.01,图4);E3浓度的ELE 与T 3浓度的TAM 合用(T 3E3)后细胞抑制率较单用T3的细胞抑制率明显上升,也明显高于T3的细胞抑制率与E3的抑制率之和(P <0.01,图5);E3浓度的ELE 与T 4浓度的TAM 合用(T 4E3)后细胞抑制率较单用T AM 的T4组细胞抑制率明显上升,也明显高于T 4的细胞抑制率与E3的抑制率之和(P <0.01,图6)
。
图3 不同浓度的TAM 作用下各加药组细胞抑制率的变化Fig.3T he inhibition rate changes in the ex per iment al gr oups of differ ent concent ratio ns o f T A
M
图4 不同浓度的EL E 作用下各加药组细胞抑制率的变化Fig.4T he inhibitio n r ate chang es in the experimental g roups of differ ent co ncentrations of EL
E
图5 T 3浓度的T A M 与E3浓度的EL E 合用前后细胞抑制率的变化
Fig.5T he inhibition rate chang es w ith t he co ncentra -tions of T 3and
E3
图6 T 4浓度的T A M 与E3浓度的EL E 合用前后细胞抑制率的变化
F ig.6T he inhibit ion rate chang es w it h the concentr a -tions o f T 4and E3
3 讨 论
3.1 三苯氧胺对M CF -7细胞的抑制效应 本研究表明,TAM 对乳腺癌M CF -7细胞株的抑制作用具有剂量依赖性。当TAM 的浓度由1.50@10-5
mol/L 降至1.50@10
-8
mol/L(T 2-T5)时,细胞抑制率由
40.67%降至6.71%(CCK -8法)。T AM 对MCF -7
细胞的抑制作用由开始的明显逐渐降至基本丧失抑制作用。提示T AM 的抑制效应与其作用浓度呈正相关性。
经统计分析,T 5组与对照组之间的吸光度均值无显著性差异。说明T5浓度时T AM 对M CF -7细胞已经丧失抑制作用,而T2、T3、T4浓度是TAM 的有效抑制浓度,其对应组细胞吸光度均值与对照组有显著性差异(P <0.01)。
理论上讲,T AM 的浓度越高,对乳腺癌细胞的抑制作用越强,具有明显的剂量相关性。但是,临床
使用的TAM 在避免加重其毒副作用的前提下的标准口服剂量(20m g/d)只相当于体外培养中所加T AM 的中等浓度,即1.50@10-6mol/L 。此浓度下T AM 对M CF -7细胞仅具有30%左右的抑制率。因而,如果能够提高同样浓度下T AM 的抗癌活性,则对提高临床疗效具有一定参考价值。
3.2 榄香烯对M CF -7细胞的抑制效应 结果表明,ELE 对乳腺癌细胞M CF -7的抑制效应也具有剂量依赖性。在E1-E4(6.15@10-1
、6.15@10-2
、6.15@10-3、6.15@10-4g/L)四个不同浓度ELE 作用
下,乳腺癌细胞受到的抑制作用逐渐减弱,抑制率由33.22%降至3.76%(CCK -8法)。提示ELE 的抗肿瘤作用与其浓度呈正相关性。
统计分析表明,当ELE 的浓度下降至E3(6.15
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1期周小娟,郑棋,赵小丽,等.榄香烯联合三苯氧胺对乳腺癌M CF-7细胞株的抑制效应
@10-3g/L)时,ELE对M CF-7细胞的抑制效应基本消失,E3组与E4组吸光度均值与对照组之间无显著性差异。说明E3浓度为ELE的临界无毒剂量。而E1、E2浓度为ELE对乳腺癌细胞的有效抑制剂量,其对应组细胞吸光度均值与对照组有显著性差异(P<0.01)。
由于ELE本身对乳腺癌细胞具有抑制作用,因此本实验为了研究ELE对T AM是否具有抑制效应,必须选择无毒剂量的ELE与有效剂量的T AM 合用,以排除ELE本身的抗瘤作用带来的偏倚。本实验选用ELE的临界无毒剂量E3与T AM的有效浓度T3、T4联合应用。
3.3榄香烯对三苯氧胺的协同增效作用ELE除了具有直接的抗肿瘤作用外,还有对放疗增敏[7]、减轻化疗副作用、协同增效和逆转化疗药物耐药的作用。本实验将ELE与T AM联合应用正是为了探讨ELE在乳腺癌内分泌治疗中的作用。
文献报道[8]及实验证明的对MCF-7细胞株无毒剂量(E3:6.15@10-3g/L)的ELE,与实验中常用的TAM浓度T3和T4(1.50@10-6,1.50@10-7mol/L)联合应用于M CF-7细胞。结果发现,无毒剂量的ELE能够显著提高TAM对乳腺癌M CF-7细胞的抑制率;CCK-8法检测联合用药,T3E3组、T4E3组的细胞抑制率分别较T3、T4组提高了14.24%和14.15%。
统计分析表明,T3E3组吸光度均值与T2组之间无显著性差异,与T3组间有显著性差异;T4E3组吸光度均值与E1组间无显著性差异,与T4组间有显著性差异。CCK-8法结果提示,T3浓度的T AM 对细胞的抑制效果经E3浓度的ELE作用后与T2浓度的TAM无显著性差异,抑制效果相当;而T4浓度的TAM对细胞的抑制效果经E3浓度的ELE 作用后与E1组的ELE无显著性差异,抑制效果相当(原先的T4组吸光度均值与E1组有显著性差异,抑制效果小于E1组)。由此可见,经过无毒剂量的ELE作用后,治疗浓度的T AM对M CF-7细胞的抑制效应得到明显增强。
综上所述,ELE作为一种植物抗癌药对乳腺癌不但具有明显的抑制作用,而且由于ELE与TA M 的抗乳腺癌的机制的差异,二者的联合应用可能会使它们的抗肿瘤作用增强。
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(编辑韩维栋)
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如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR 的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。
乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2 雌激素调节蛋白PS2是由激素依赖细胞分泌的，可以通过自分泌和旁分泌起作用，是预测乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的另一项重要指标。通常ER阳性乳腺癌细胞，PS2也呈现高水平表达。PS2在乳腺癌表达的阳性率在43%～58%之间。PS2与ER表达的正相关性，在绝经前的妇女(50岁以下)表现更为明显。PS2(+)ER(+)病例大约占83%，很少ER(-)和PR(-)，而PS2(+)(约4%)。作为乳腺癌抗雌激素治疗预测指标，PS2可能优于ER、PR，若三者结合则可达到满意的预测效果。 乳腺癌常见免疫组化指标：预后指标PS2 PS2作为预后指标，对无淋巴结转移者的意义尤为重要。No(无淋巴结转移)的乳腺癌患者，在采取单纯手术治疗的情况下,约20%～30%的患者会复发。有研究发现，PS2阳性与阴性两组在N0患者复发率相差31%,死亡率相差13%。因此PS2成为确定N0组患者属于危险组或非危险组的参考指标之一。PS2检测对淋巴结阳性(N+)患者也同样可分成危险组和非危险组,两组预后差别非常明显。乳腺癌ER(-)、PR(-)、PS2(-)的患者预后差,治疗失败率为83%,5年存活率仅为41%。 乳腺癌常见免疫组化指标：标记细胞增殖状态的抗原Ki67 Ki67是一种标记细胞增殖状态的抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可少的，阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki67的监测多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。 乳腺癌常见免疫组化指标：细胞周期蛋白(CyclinD1)
形态生长方式类型培养条件 人乳腺癌细胞MCF7 上皮样贴壁生长常规该细胞是从一名69岁的白人女性 乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构( domes );该细胞表达WNT7B 癌基因；TNF- a可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的分泌。ER(+),PR(+),Her-2(-) 人乳腺癌细胞MDA-MB-231 上皮样贴壁生长三阴MDA-MB-231是从一名 51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7B癌基因。属于高转移性恶性乳腺癌细胞系，易成瘤，且常用 于肿瘤转移研究 人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435S 上皮样贴壁生长三阴，转移性乳腺导管腺 癌MDA-MB-435S 是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本(MDA-MB-435)中筛选得到。MDA-MB-435是从一名31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到的。但近来证明MDA-MB-435细胞被M14黑色素瘤细胞污染。 人乳腺癌细胞MDA-MB-453 上皮样；多角形贴壁生长三阴，转移性乳腺癌 该细胞系由Cailleau R在1976年从一名48岁的患有转移性乳腺癌的白人女性的心包渗出液中分离建立的。该细胞表达FGF的受体。 人乳腺癌细胞MDA-MB-157 上皮样贴壁生长髓样癌该细胞源自一位患有 乳腺髓样癌的44岁黑人女性，表达WNT7B癌基因，细胞与细胞边界处有细胞桥粒、微绒毛、张力细丝。 人乳腺癌细胞SK-BR-3 上皮样贴壁生长这株细胞是1970年由Trempe G和 Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达 ______________ HER2/c-erb-2 基因产物。 人乳腺导管癌细胞ZR-75-1 上皮样贴壁生长该细胞产生高水平的黏液素 MUC-1 mRNA，低水平的MUC-2 mRNA，但不表达MUC-3基因；表达雌激素受体。 人乳腺导管癌细胞HCC38 上皮样贴壁生长该细胞于1992年从一位50岁的白 人女性乳腺导管癌组织中分离建立，该患者曾有平滑肌肉瘤的病史，其母亲死于乳腺 癌；该细胞癌基因her2/neu- , p53+ ;上皮细胞特异性标志物EGP2 (上皮糖蛋白2) 和CK19
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基 +5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO
逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响 张 虹 季有波 1 （长春医学高等专科学校，吉林长春130031） 〔关键词〕逍遥散；乳腺癌；细胞周期〔中图分类号〕R737.9 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）24-5611-02；doi ：10.3969/j.issn.1005- 9202.2012.24.1381 吉林大学第二医院 通讯作者：季有波（1976-），男，主治医师，讲师，主要从事慢性疼痛性疾 病研究。 第一作者：张 虹（1977-），女，讲师，硕士，主要从事方剂学研究。 中医认为乳腺癌或癌前病变属于“乳岩”、“乳癖”范畴，乃由情志不畅、肝郁气滞、血瘀、脾气消沮等所致。而逍遥散行气疏肝，调畅神志，具有抗焦虑、抗抑郁作用，从而影响癌症的发生发展 〔1〕 。本课题组在前期研究中证实了逍遥散提取液对乳 腺癌细胞MCF-7有显著的生长抑制作用〔2〕 。本实验进一步探 讨逍遥散提取液对细胞周期的影响，为古方新用及乳腺癌的防 治进一步提供实验依据。 1材料与试剂1.1试剂DMEM 培养基（Invitrogen ）、RNase 、PI 购自Sigma 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。1.2 药物 逍遥散的药物组成及用量为：柴胡、当归、白术、茯 苓、 芍药各30g ，炙甘草15g ，煨姜、薄荷各1g ，购自市售药店，并经过严格鉴定。按上述组方和单品药当归取生药，加蒸馏水回流提取3次， 每次分别为60、30、30min ，浓缩药液，再加入DMEM 培养液稀释，配成浓度为1g /ml 药液，过滤除菌，4?保存备用。1.3 细胞培养 人乳腺癌细胞系（MCF-7）购自吉林省肿瘤研究所，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37?、5%CO 2空气及饱和湿度条件下培养。以每5?104 细胞/瓶接种，24h 换液1次并加入相应浓度的逍遥散提取液。1.4 FCM 检测细胞检测细胞周期 取对数生长期细胞用于 实验，随机分5组：对照组、逍遥散提取液低剂量组（2mg /ml ）、中剂量组（5mg /ml ）、高剂量组（10mg /ml ）、当归组（5mg /ml ）。 按照常规方法用PI 染色，流式细胞仪检测细胞周期 〔3〕 。 经低、中、高剂量的逍遥散提取液和当归分别作用48h ，收集MCF-7细胞，用PBS 冲洗两次， 70%冷乙醇固定过夜。PBS 冲洗2次，加RNase ，37?水浴30min 降解RNA ；再用PBS 洗2次后，加PI 染液，4?避光反应30min ，经PBS 洗涤后上机检测。用FACScan 流式细胞仪Cellfit 软件收取细胞测定DNA 含量的 变化，每个样品收集细胞数为1?104 个。 1.5统计学分析所有数据均采用SAS 统计软件进行检测， 数据用x ?s 表示，两组间比较采用t 检验。2 结 果 经流式细胞仪检测，不同剂量的逍遥散提取液和当归提取液对乳腺癌细胞MCF-7作用48h 后，各周期细胞比例见表1。 表1 逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响（x ?s ， %）组别G 0/G 1 S G 2/M 逍遥散低剂量组 63.813?0.78335.828?0.9551）0.480?0.1231）中剂量组55.615?1.4532）28.258?3.7201）0.207?0.1001）高剂量组54.463?2.6962） 25.430?4.2461）0.190?0.1471）对照组64.763?2.20236.238?1.1100.597?0.076当归组 68.250?3.990 31.500?4.210 0.250?0.250 与对照组比较：1）P ＜0.05， 2）P ＜0.013讨论 细胞周期是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期（M 期）两个阶段。分裂间期是物质准备和积累阶段，分裂期则是细胞增殖的实施过程。间期又分为休眠期（G 0期）、 DNA 合成前期（G 1期）、DNA 合成期（S 期）与DNA 合成后期（G 2期），在此期间主要完成染色质中的DNA 复制和相关蛋白质的合成。M 期为细胞分裂期， 在此期间进行细胞物质的平均分配，一个细胞经过分裂形成两个新的细胞。 在细胞周期中，S 期是细胞增殖的关键，其最主要的特征是
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151712.6 (22)申请日 2019.02.28 (71)申请人 贵州省人民医院 地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东 路83号 (72)发明人 侯净 倪青 魏娜 贾琦 刘欣 胡诗航 (74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务 所(普通合伙) 11670 代理人 潘卫锋 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构 建方法 (57)摘要 本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺 癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺 癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩 增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构 建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。本发明通 过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表 达情况，以证明细胞系构建成功。本发明构建的 乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合 效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2 基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中 提供基本且有力的研究工具。权利要求书2页 说明书7页CN 109694853 A 2019.04.30 C N 109694853 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109694853 A 1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞； S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒； S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/ Kan平板上37℃倒置培养10小时； S4：对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。 2.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L。 3.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L、硝酸铵15-20g。 4.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。 5.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。 6.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快 2
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标 很多乳腺癌患者和家属都苦于看不懂乳腺癌常见的免疫组化指标而无法对医生的治疗进行判断，今天海南亚洲制药集团的小编就这个问题为您详细阐述。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。近年来研究发现人参皂苷Rh2（最佳含量16.2%）抑制癌细胞增殖作用的能力最强，是人参皂苷中的最主要抗癌活性成分。人参皂苷Rh2通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞分化凋亡对多种肿瘤有效，也为应用于乳腺癌治疗提供了新的武器。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR） 临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2 雌激素调节蛋白PS2是由激素依赖细胞分泌的，可以通过自分泌和旁分泌起作用，是预测乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的另一项重要指标。通常ER阳性乳腺癌细胞，PS2也呈现高水平表达。PS2在乳腺癌表达的阳性率在43%～58%之间。PS2与ER表达的正相关性，在绝经前的妇女(50岁以下)表现更为明显。PS2(+)ER(+)病例大约占83%，很少ER(-)和PR(-)，而PS2(+)(约4%)。作为乳腺癌抗雌激素治疗预测指标，PS2可能优于ER、PR，若三者结合则可达到满意的预测效果。 乳腺癌常见免疫组化指标：预后指标PS2 PS2作为预后指标，对无淋巴结转移者的意义尤为重要。No(无淋巴结转移)的乳腺癌患者，在采取单纯手术治疗的情况下,约20%～30%的患者会复发。有研究发现，PS2阳性与阴性两组在N0患者复发率相差31%,死亡率相差13%。因此PS2成为确定N0组患者属于危险组或非危险组的参考指标之一。PS2检测对淋巴结阳性(N+)患者也同样可分成危险组和非危险组,两组预后差别非常明显。乳腺癌ER(-)、PR(-)、PS2(-)的患者预后差,治疗失败率为83%,5年存活率仅为41%。 乳腺癌常见免疫组化指标：标记细胞增殖状态的抗原Ki67 Ki67是一种标记细胞增殖状态的抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可少的，阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki67的监测多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。 乳腺癌常见免疫组化指标：细胞周期蛋白(CyclinD1) 细胞周期是由细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖蛋白激酶(CDK)和细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白(CKI)来进行调控的。不同时相(G1、S、G2、M)间存在关键的调控点。细胞周期蛋白(CyclinD1) 与特定的CDK结合构成复合体，可在G1/S 交界处将信号转导途径与细胞周期调控联系起来，完成各个时期的转换。其过度表达可缩短G1 期，并减少对生长因子的依赖
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小 牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该 细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS 细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次 细胞传代情况C5 细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37 C 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min 传代的比例：1 : 2~1: 4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入 2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC
三阴性乳腺癌的早期诊断治疗 病理特征 三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0%～20.8%，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型差。 临床表现 三阴性乳腺癌临床表现为一种侵袭性病程，其远处转移风险较高，内脏转移机会较骨转移高，脑转移几率也较高。三阴性乳腺癌的远处转移风险在3年时达到高峰，之后可能会有所下降。三阴性乳腺癌的中位肿瘤大小为2cm，50%有淋巴结转移。此类乳腺癌的组织学分级多为3级，细胞增殖比例较高。 症状
部分症状 三阴性乳腺癌的表现通常与其他类型的乳腺癌相同，包括： ①乳腺中出现肿块或者包块 ②乳腺疼痛或者发红 ③乳头变的内陷或者出现溢液 诊断 （1）病史 肿块常是乳腺癌患者首发症状，须问明出现的时间、部位、大小、生长快慢，是否疼痛，乳头糜烂、溢液的时间、性质，腋窝有无肿块。 （2）检查项目 ①乳腺钼靶摄片
对普查乳腺疾病特别是乳腺癌早期有着重要的意义。 ②活组织病理检查 1）肿块切除将乳房中肿块或可疑组织的整个切除，进行病理检查。 2）切取活检从肿块或可疑组织中切取部分组织进行检查。3）细针穿刺用一根很细的针从肿块、可疑组织或积液中抽取一些组织、细胞检查。其他，如乳头溢液者可做乳头溢液涂片细胞学检查，乳头糜烂部刮片或印片细胞学检查。 ③受体及基因测定 雌激素、孕激素和原癌基因Her-2均为阴性。 ④超声显像 ⑤乳腺导管内视镜检查 治疗 有些药物是针对影像刺激癌症的激素或者蛋白，其他类型的乳腺癌会对这些药物有反应，这种疗法称为靶向治疗。而对三阴性乳腺癌不存在靶向治疗，目前还没有特有的针对三阴性乳腺癌的治疗指南，因此其治疗一般按乳腺癌常规标准治疗进行。 （1）化疗 即使用可以杀死癌细胞的药物治疗癌症，这可能是医生会尝试的第一种疗法。这种疗法将通过静脉注射或者药片的方式提供给患
三阴性乳腺癌又添新方案 众所周知，大约15%～20%的乳腺癌为三阴性乳腺癌，雌激素、孕激素、HER2三大受体均为阴性。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）早期复发率高，内脏转移、脑转移率高，预后较差，治疗上对抗激素治疗和抗HER2治疗效果不佳，全身治疗主要依靠化疗以细胞毒药物治疗为主。以前，三阴性乳腺癌化疗方案金标准主要包括环磷酰胺＋氟尿嘧啶＋蒽环类→紫杉类。近年来，对于三阴性乳腺癌的晚期患者和早期术前患者，卡铂等铂类化疗方案的效果已被若干随机对照研究证实。不过，对于三阴性乳腺癌的早期术后患者，此前的铂类辅助化疗方案随机对照研究仅取得非劣效结果。 为使这一亚型患者实现更精准的治疗，复旦大学附属肿瘤医院邵志敏教授团队于2019年绘制出全球最大的三阴性乳癌基因图谱并在国际上首次提出“复旦分型”标准，使更多患者看到了治愈希望。2020年8月13日，邵志敏教授与余科达教授团队的PATTERN研究于JAMA Oncology杂志在线发表。
PATTERN研究探索了卡铂联合紫杉醇（PCb）对比当时指南推荐的CEF-T方案在早期TNBC 术后辅助治疗中的价值。与CEF-T方案相比，PCb方案将早期可手术TNBC 5年的DFS提高了6.2%（86.5% vs 80.3%，HR=0.65，95%CI：0.44～0.96，P=0.03），确认了铂类在TNBC辅助治疗中优效性地位。 该多中心非盲随机对照三期临床研究于2011年7月1日～2016年4月30日从全国9家医院入组三阴性乳腺癌尚未转移、非局部晚期、术前尚未接受抗癌治疗、术后经病理证实区域淋巴结阳性或淋巴结阴性但肿瘤直径大于1厘米、年龄18～70岁（中位51岁，四分位44～57岁，范围23～70岁）女性647例，按1∶1的比例随机分为两组：卡铂方案组325例：6轮紫杉醇＋卡铂（每28天的第1、8、15天紫杉醇80mg/m2＋卡铂AUC=2） 标准方案组322例：3轮环磷酰胺＋表柔比星＋氟尿嘧啶（每3周环磷酰胺500mg/m2＋表柔比星100mg/m2＋氟尿嘧啶500mg/m2）→3轮多西他赛（每3周多西他赛100mg/m 2） 数据分析于2019年12月1日～2020年1月31日，主要终点为无病生存，次要终点包括总生存、无远处病变生存、无复发生存、毒性反应。此外，对乳腺癌易感基因BRCA等12种DNA同源重组修复相关基因（ATM、ATR、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、FANCM、PALB2、RAD51C、RAD51D、RECQL）突变患者的无病生存进行亚组分析。BRCA是重要的抑癌基因，大约11.2%的三阴性乳腺癌患者存在BRCA致病突变，容易引起DNA同源重组修复异常和DNA不稳定，而铂类的主要作用机制即破坏细胞DNA。
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件:37℃ 5% CO2 消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min 传代的比例:1:2~1:4 换液时间:2~3天换液一次 冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。 产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点:细胞代数为4-5代左右 包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书 细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
如何看懂乳腺癌常见免疫 组化指标 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR） 临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2
细胞英文名称MDA-MB-231 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因。 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2~1:4传代；每周2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体58~61，有巨核 使用权限A类实物状态可用 细胞英文名称MDA-MB-468 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞是1977年由Cailleau R等从一位患有转移性乳腺癌的51岁黑人女性的胸腔积液中分离得到的。虽然供体组织的G6PD等位基因杂合，但此细胞株始终表现为G6PD A表型。P53基因273位密码子存在G→A突变，从而导致Arg→His替代。每个细胞上存在1×106个EGF 受体。 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2~1:4传代；每周换液2~3次。传代情况C4 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SK-BR-3 [SKBR-3；SKBR3] 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性这株细胞是1970年由Trempe G和Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达HER2/c-erb-2基因产物。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2传代；每周换液2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体69~80 细胞英文名称MCF7 [MCF-7] 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞是从一名69岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构（domes）；该细胞表达WNT7B癌基因；TNF-α可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的分泌。 培养基DMEM-H: Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DME H-21 4.5g/Liter Glucose) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3~1:6传代；每周2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体72~84 查询培养基,定制缺陷型培养基,规模培养用培养基订购(可参与实验) 培养用常用试剂各品牌评定\推荐(您用过好的产品也可以列出\说明理由,统计后的结果共享) 细胞培养条件查询.细胞订购,细胞规模培养技术交流,培养条件方案交流,
MDA-MB-231细胞系是从一名51岁的白种女性转移性乳腺癌的胸腔积液建立的人乳腺细胞系。该上皮细胞系是医学研究实验室中使用最广泛的乳腺癌细胞系之一，特别是涉及CRISPR/Cas9基因敲除的那些。 由于缺乏ER和PR表达以及HER2扩增，该细胞系最初被归类为“基础”乳腺癌细胞系。然而，由于它表现出claudin-3和claudinin-4的下调，Ki-67增殖标记物的低表达，与上皮-间质转化有关的标记物的富集，因此现在被认为属于claudin-低分子亚型。以及与乳腺癌干细胞（CSC）相关的特征的表达，例如CD44 + CD24- /低表型。这就是为什么许多研究一直专注于基因编辑 MDA-MB-231细胞系的原因。 应用：
1. CRISPR / Cas9诱变使靶向MDA-MB-231细胞的推定癌症依赖性无效。癌细胞需要表达某些基因的表达，这些基因编码肿瘤生长所必需的蛋白质。沉默这些基因的表达或阻断蛋白质的活性可以触发细胞死亡和持久的肿瘤消退。因此，识别和表征癌症依赖性是临床前癌症研究的关键目标。MELK被认为是多种癌症类型的癌症依赖性和推定药物靶标，其中之一是MDA-MB-231细胞系。MELK在乳腺癌细胞中过表达，与患者预后不良有关。此外，据报道，使用RNAi 敲低MDA-MB-231细胞中的MELK可阻止癌细胞增殖并触发细胞周期停滞或有丝分裂灾难。 研究人员设计了针对MELK的七个指导RNA（gRNA），并将每个指导RNA 克隆到一个表达GFP的载体中，并将该指南转导到了三个表达Cas9细胞系中：三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231据报道会上瘾。MELK表达。对过表达的MDA-MB-231细胞中MELK蛋白水平的蛋白质印迹分析证实，CRISPR系统可有效消除MELK表达。
三阴性乳腺癌的临床病理特征及治疗进展 三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种特殊类型，具有独特的临床病理特征，缺乏内分泌治疗及靶向治疗相应的靶点，对放疗和化疗敏感，但复发率高，治疗效果较差。本研究对近几年来三阴性乳腺癌的临床病理特征及治疗方面的研究进展进行综述。 [关键字] 三阴性乳腺癌；临床病理特征；新辅助化疗；大剂量化疗；分子靶向治疗 三阴性乳腺癌（TNBC）是近几年发现的预后较差的一类乳腺癌，其ER、PR、HER-2三者均为阴性表达，常表达CK5/6，过量表达表皮生长因子受体（EGFR）。Perou等[1]首先对其定义，其具有特殊的免疫表型，预后较差，有较高的内脏转移率、脑转移率及局部复发率[2]，好发于绝经前妇女，其在乳腺癌的比例，各文献报道略有不同，但总体约在10%～20%[3-8]之内，被认为是特殊类型的乳腺癌。 1 临床病理 三阴性乳腺癌是侵袭能力强的初级乳腺癌，分期较晚、恶性程度高、推挤性边缘、Nottingham分级较晚、远处转移常见、预后较差、总生存率和无病生存期低[7，10]，组织学分级较非三阴性乳腺癌所占的比例高，原发灶的体积大，还具有较高的淋巴结转移率，诊断为三阴性乳腺癌的患者腋窝淋巴结阳性者较多，有乳腺癌家族史者所占比例大，局部复发及远处转移发生率高，具有高增殖性特征，预后较非三阴性乳腺癌差，内分泌治疗和靶向治疗无效。 三阴性乳腺癌病理类型几乎均为导管癌，还有纯小叶癌、混合癌及髓样癌，以髓样癌预后较好，组织学分级较高；肿瘤细胞多表达basal细胞角蛋白（CK5/6、CK17）、P2cadherin、EGFR和P53，较少表达雄激素受体（AR）、E2cadherin、cyclinD；较非三阴性乳腺癌患者无瘤生存和总生存期均显著降低；与其他类型乳腺癌相比，较早发生局部复发和远处转移，内脏转移率高于骨转移，易发生脊髓、脑膜、脑、肝和肺转移，可能有独特的转移机制。相对于其他类型乳腺癌，其发病年龄低，并且缺乏有效的早期诊断手段，发现时TNM分期较其他乳腺癌分期晚。三阴性乳腺癌发现时一般Ⅰ期占23%～36%，Ⅱ期占46%，Ⅲ期占12%～29%，Ⅳ期则＜5%，而其他乳腺癌发现时有50%Ⅰ期，只有10%为Ⅲ+Ⅳ期。在确诊后的5年里，三阴性乳腺癌的无复发存活率和总体生存率与一般性乳腺癌的Ⅲ期的导管癌相似，但5年后的生存率又较好[3]。 赵晓辉等[6]研究表明，三阴性乳腺癌5年内内脏转移的风险较非三阴性乳腺癌高4倍（HR4.0；95%CI：2.7～5.9，P＜0.01）。三阴性乳腺癌不同部位远处转移的发生率存在差异，发生远处转移具有一定的器官倾向性。这种特定的靶器官转移与它的特定基因表达有关。三阴性乳腺癌患者5年无瘤生存率及总生存率均明显低于非三阴患者；对于淋巴结阴性患者，三阴组和非三阴组5年无瘤生
乳腺癌细胞培养
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS
支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 ×10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 ℃水浴中，震荡解冻2 min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入5 ml 37 ℃预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心（1000 rpm，5 min），弃去上清液，再加入2 ml培养基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC 货期：1-2周 运输方式：快递运输