生物技术制药试卷A
一、名词解释：（本题共10小题，每小题5分，共计50分）
1、生物药物：是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
2、抗生素：由微生物产生，在低浓度下能杀灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、杀虫剂和除草剂。
3、补料分批发酵：是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。
4、限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
5、载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。
6、转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。
7、微载体培养：将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。
8、毛状根：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。
9、气升式反应器：没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小，主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养。
10. 酶固定化：指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。
二、简答题（本题共5小题，每小题8分，共40分）
1. 简述生物药物新药的研发流程。
答：新药研究和开发的主要过程：
(1)确定研究计划；
(2) 准备候选菌株；
(3) 选择合适药理模型初筛（摇瓶）、复筛（小型发酵）体外试验、细胞试验；
(4) 提纯有效成分进行化学分析；
(5) 精制样品（中型发酵）；
(6) 临床前Ⅱ期(Preclinical Ⅱ) ；
(7) Ⅰ期临床 (Preclinical I)；
(8) Ⅱ期临床 (Preclinical Ⅱ)；
(9) Ⅲ期临床 (Preclinical Ⅲ)；
(10) 注册申请上市、试生产；
(11) 售后监测(Post－marketing surveillance)。
2.简述生物药物的优点和缺点。
答：生物药物是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
优点：
（1）用量少，药理活性高；
（2）特异性强，治疗的生理生化机制合理，疗效可靠；
（2）毒副作用小、价值高；
（3）缺点：
（1）成分复杂：大多数是混合物；
（2）不稳定：易变性，易失活，易降解。
（3）提取纯化工艺复杂、生产技术难度高；
（4）生理副作用常有发生。
3. 给出下列生物药物的中文名称: IFN；TNF；IL；G-CSF；EPO；GM-CSF；r-SK；r-SAK；GH；EGF；bFGF；rhTPO；t-PA；SRM
答：IFN （人α-干扰素）；TNF （肿瘤坏死因子）；IL （白细胞介素）；G-CSF （粒细胞集落刺激因子）；EPO （促红细胞生成素）；GM-CSF （粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子）；r-SK （重组链激酶）；r-SAK （重组葡激酶）；GH （生长激素）；EGF （表皮细胞生长因子）；bFGF （碱性成纤维细胞生长因子）；rhTPO （重组人血小板生成素）；t-PA（组织纤溶酶
（生长激素释放抑制素）。激活剂）；SRM
简述微生物发酵制药的基本流程。 4.
答：微生物发酵制药基本流程：菌种选育（自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程）培养基配制（根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方）灭菌（杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）
扩大培养和接种
发酵过程（检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等）
分离纯化（菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换）
5、简述基因工程操作流程
答：基因工程的操作流程：
（1）分：分离目的基因；
（2）切：对目的基因和载体适当切割；
（3）接：目的基因与载体连接；
（4）转：重组DNA转入受体细胞；
（5）筛：筛选出含有重组体的受体细胞；
（6）表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物。
三、设计题（本题共1题，共计10分）
请设计一个基因工程药物的生产工艺流程（应包括工程菌构建、扩大培养方法、产物分离纯化、质量检测等环节）。
答：干扰素a-2b 的制备
干扰素（INF）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等等作用,是人体防御系统的重要组成部分,干扰素（INF）最早被用于诱导人体产生白细胞。
（1）基因工程菌的组建
诱生的白细胞或者成纤维细胞提取核酸
↓
通过寡dT-纤维素柱提取mRNA pBR322质粒
↓↓
5%-23%蔗糖密度梯度离心提取12S-mRNA PstI内切酶切割
↓↓
由mRNA转录成cDNA 切割段位于β内酰胺基酶基因内
↓结果导致内酰胺基酶失活，不抗青霉素
双链cDNA用末端PstI酶切割↓
再用DNA转移酶接上dT或者dG 在pBR322质粒DNA的切割段加上dA或者dC
++++++++++++++++
退火获得杂交质粒
↓
转化大肠杆菌K-12扩增杂交质粒
↓
筛选能够抗四环素、但是对氨苄青霉素敏感的细菌克隆株
↓
采用杂交翻译法挑选含有干扰素cDNA的克隆
↓
将干扰素cDNA克隆进表达载体
↓
在大肠杆菌中进行高效表达
↓
（进入下游工艺）
（2）基因工程菌的发酵生产
人干扰素a-2b的基因工程菌为SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。
质粒使用PL启动子，含有四环素抗性基因。
种子培养液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl
↓
基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶之中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30℃摇床培养10小时，作为发酵罐的种子
↓
用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L
↓
搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50%
30℃发酵8小时，42℃诱导2-3小时
↓
鉴控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。（3）干扰素的制备
发酵物质4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌，从其中取100g。悬浮于20mmol/L
磷酸缓冲液（PH=7.0）500ml之中，冰浴条件下进行超声破碎。
↓
4000r/min离心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室温条件下，进行搅拌抽提2小时
↓
提取液15000r/min离心30min，下层不溶弃去。取上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）稀释至尿素浓度0.5mol/L
↓
加入0.1mmol/L二巯基苏糖醇，4℃搅拌15小时。15000r/min离心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩
↓
浓缩液采用Sephadex G50层析柱分离，层析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一缓冲液洗脱分离
↓
收集人干扰素a-2b部分，用SDS-PAGE检查。再经DE-52柱进行纯化
层析柱2cm*50cm、上柱之后，分别采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L 磷酸缓冲液（PH=7.0）洗涤。
↓
收集含有收集人干扰素a-2b部分。分装→冻干→成品鉴定→成品包装。
（4）质量控制标准和具体要求
（1）半成品检定--13项指标
1、干扰素效价测定；
2、蛋白质含量测定；
3、比活性测定；
4、纯度测定；
5、相对分子量测定；
6、残余外源性DNA含量测定；
7、残余抗生素活性测定；
8、紫外光谱扫描；
9、肽图测定；10、等电点测定；11、无菌试验；12、热原质试验。
（2）成品检定--7项指标
1、物理性状；
2、鉴别试验；
3、水分测定；
4、无菌试验；
5、热原质试验；
6、干扰素效价测定；
7、安全试验。