献给初学者：手把手教你做免疫共沉淀实验
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。
工作液配制配制100 ml 的modified RIPA buffe：
1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
2. 加10 ml 10% 的NP-40；
3. 加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
4. 加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保存；
5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，30 分钟就会降解一半，所以PMSF本人系天天论文网就职11年的资深论文编辑；工作中与各大医学期刊杂志社进行学术交流过程中建立了稳定的编辑朋友圈，系多家医学杂志社的特约编辑，常年为医学期刊杂志供稿，负责天天论文网医学论文·分检·编校·推送·指导等工作！工作企鹅1:1550116010工作企鹅2：766085044 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5 天。各种成分在工作液中的终浓度1.Tris-HCl：50 mM，pH 7.4 2.NP-40：1% 3. 去氧胆酸钠：0.25% 4.NaCl：150 mM 5.EDTA：1 mM
6.PMSF：1 mM
7. 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1 μg/ml
8.Na3VO4：1 mM
9.NaF：1 mM
实验步骤
1. 转染后24～48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，细胞裂解液于4 ℃，最大转速离心30 min 后取上清；
2. 取少量裂解液以备Western blot 分析，剩余裂解液加1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜；
3. 取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm，离心3 min；
4. 将预处理过的10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4 ℃缓慢摇晃孵育2～4 h，使抗体与protein A 琼脂糖珠偶连；
5. 免疫沉淀反应后，在4 ℃以3 000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗3～4 次；最后加入15 μl 的 2 × SDS 上样缓冲液，沸水煮5 分钟；
6.SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1. 用磷酸盐缓冲液洗30 块10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml 冰冷的EBC 裂解缓冲液中。
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃以最大速度离心15 min。
3. 收集上清（约30 ml）并加入30 μg 的适当抗体，4 ℃摇动免疫沉淀物1 h。
4. 加入0.9 ml 的蛋白质A-Sepharose 悬液，4 ℃摇动免疫沉淀物30 min。
5. 用含900 mmol/L NaCl 的NETN 洗蛋白A-Sepharose 混合物，再重复洗5 次。最后，用NETN 洗一次。
6. 吸出混合物的液体部分。加入800 μl 的1 × SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7. 将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE 梯度胶中，在10 mA 的恒定电流下电泳过夜。
8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50% 乙腈洗两次，每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A 或494A 机器上进行自动Edman 降解测序。
注意事项
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2% SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
3. 使用对照抗体：①单克隆抗体：正常小鼠的IgG 或另一类单抗；②兔多克隆抗体：正常兔IgG。
4. 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：①确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；②要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；③确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
演讲常用手势有哪些 演讲,差不多同时存在两种语言:一是口头的有声语言, 一是身体的态势语言,是无声的。手势则是态势语之一,演讲时其使用频率之高仅次于面部表情。下面我为你整理演讲常用手势，希望能帮到你。 1仰手式 即掌心向上，拇指张开，其余几指微曲。手部抬高表示欢欣、赞美、申请祈求;手部放平是表示诚恳地征求听众的意见，取得支持;手部降低表示无可奈何。 2覆手式 即掌心向下，手指状态同上，这是审慎的提醒手势，演讲者有必要抑制听众的情绪，进而达到控制场面的目的，也可表示否认、反对等。 3切手式 即手掌挺直全部展开，手指并拢，像一把斧子迅速地劈下，表示果断、坚决、快刀斩乱麻等。 4啄手式 即手指并拢呈簸箕形，指尖向着听众。这种手势具有强烈的针对性、指示性，但也容易形成挑衅性、威胁性，一般是对相识的听众或是与演讲者有某种关联时才使用。 小学生演讲手势
一、手势的分类 演讲的手势是多种多样的，但是也有一定的规律可循，按它的运用方式、意思大致可以分为以下几种： A ：情意手势。这种手势主要是表达演讲者喜、怒、乐的强烈情感，使具体化。比如：讲到胜利成功时，演讲者拍手称快;讲到非常气愤的事情时，演讲者双手握拳，不断颤抖;讲到着急、担心时，演讲者双手互搓。情意手势既能渲染气氛，又助于情感的传达，在演讲中使用的频率最高。 B：指示手势。这种手势有具体指示对象的作用。它可以使听众看到真实的事物。比如讲到"你"、"我"、"他"或"这边"、"那边"、"上头"、"下头"时，都可以用手指一下，给听众更清楚的印象。这种手势的特点是动作简单、表达专一，基本上不带感情色彩。这种手势只能指示听众的视觉可以感知的事物和方向，视觉不及的，不能运用这种手势。 C ：形象手势。这种手势主要用来摹仿事物，给听众一种形象的感觉。比如演讲者到"袖珍电子计算机只有这么大"的同时，用手比划一下，听众就具体知道它的大小了。在讲到"微型的照相机只有现在的进口打火机那么大"时，用手势配合一下，既具体又形象。 D：象征手势。这种手势可以表示抽象的意念，用得准确恰当能引起听众的联想，例如讲到"让我们扬起理想的风帆，向着光辉有未来前进!""同志们，冲啊!"用右手向前上方有力地伸
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
手把手教你做演讲手势 不管是在演讲中，还是在现实生活与工作的交流沟通中，手掌的运用是最普及、最常见、最频繁的，它是手势语的主角和态势语的重头戏。下面学习啦小编分享了手把手教你做演讲手势，希望你喜欢。 手掌手势的基本要领：拇指张开，其余四指自然并拢微曲，手臂(手臂分为三段：上臂、前臂与手)根据手掌的位置而灵活变化。 套常用的手掌动作(1)伸手(手心向上，前臂略直，手掌向前平伸)表示请求、交流、许诺、谦逊、承认、赞美、希望、欢迎、诚实等意思。 伸手训练：人活在世上，谁不希望自己的一生过得有意义、有价值一些呢?自己活着，就是为了使别人生 活得更美好! (2)抬手(手心向上，手臂微曲，手掌与肩齐高)表示号召、唤起、祈求、激动、愤怒、强调等。 抬手训练：尊敬的各位领导、各位来宾，亲爱的同学们，大家早上好!给人民当牛做马的人，人民把他抬 得很高很高! (3)举手(五指朝天，前臂垂直，手掌举至头部)表示
行动、肯定、激昂、动情、歌颂等 举手训练：人生的价值在于奉献，生命的真谛在于创造!经验证明，能使大多数人得到幸福的人，他本身 也是幸福的。 (4)挥手(手臂向前，手掌向上挥动)表示激励、鼓动、号召、呼吁、前进、致意等。 挥手训练：努力吧!奋斗吧!我们的明天一定会更加美好!同志们，朋友们：让我们在爱国主义的旗帜指引 下奋勇前进吧! (5)推手(手心向前，前臂直伸)表示坚决、制止，果断、拒绝、排斥、势不可挡等意。 推手训练：不!不能这样!这不是我们的逻辑!谁不属于自己的祖国，那么他也就不属于人类。 (6)压手(手心向下，前臂下压至下区)表示要安静、停止、反对、压抑、悲观或气愤等。 压手训练：时间就是生命，无端地浪费别人的时间，其实是无异于谋财害命的。谁若把金钱看得比荣誉还尊贵，谁就会从高贵降到低贱。 (7)摆手(手心对外，前臂上举至中区上部)表示反感、蔑视、否认、失望、不屑一顾等。
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告 步骤一：样品准备 试剂和仪器： Biopulverizer(biospec) 37% formaldehyde 甘氨酸(Glycine) PBS protease inhibitors 步骤二：细胞交联 1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。 2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。 3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。 4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。 5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。800Xg，4°C离心 5min，小心去掉上清。 步骤三：细胞裂解 试剂: 裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%; Tritonx -100 0.25%。 裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。 步骤: 1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。 2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。 3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。 步骤四：超声破碎ＤＮＡ 仪器: Bioruptor(Diagenode) 步骤: (1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。 (2)、在超声池中注入一定量的冰水。 (3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。 (4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。(30 seconds “ON” & 30 seconds “OFF”。) (5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。超声后电泳图附件1。
https://www.doczj.com/doc/b88845861.html, 染色质免疫共沉淀全套解决方案——ChIP试剂盒 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 当前国内科研情况而言，研究分化，转录，发育，iPS，肿瘤干细胞，表观遗传学等等领域的老师都会做ChIP实验，还有部分老师会自己买抗体，手工配置试剂。但由于这个实验本身实验步骤比较繁琐而且其中很多步骤都非常关键，所需的试剂较多，容易造成配置间的误差，实验周期较长，若未设置阴性和阳性对照，更会导致结果无法分析，从而进入无休的困惑。 经典染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002)：提供了对细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且本试剂盒中含有一种阳性对照抗体(RNA聚合酶II抗体)、一种阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作为阳性对照来保证试剂盒中试剂和操作步骤没出现问题)。在大多数生长期的哺乳动物细胞中，RNA聚合酶II会在GAPDH基因启动子上富集，准备起始转录，因此该启动子能与RNA聚合酶II发生免疫沉淀反应，而不能与正常小鼠IgG发生。在本染色质免疫沉淀反应中，细胞耦合了甲醛，提取出其中的染色质。染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过本公司专门设计的高速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可直接用于随后的各种分析。本试剂盒是基于96孔板的，市场上同类产品中最快捷的试剂盒，对CHIP过程进行了彻底的简化，操作简捷，方便易学整个处理过程不到5小时，同时可拆卸式的96孔板模式使研究人员能根据自己需要选择手工或是高通量分析。
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
演讲的手势和站姿 演讲是指在公众场所，以有声语言为主要手段，以体态语言为辅助手段，针对某个具体问题，鲜明、完整地发表自己的见解和主张，下面是我分享的演讲的手势和站姿，一起来看看吧。 演讲的手势和站姿介绍 一、演讲者站姿规范 (1)脊椎、后背挺直，胸略向前上方挺起。 (2)两肩放松，重心主要支撑脚掌脚弓上。 (3)挺胸，收腹，精神饱满，气息下沉。 (4)脚应绷直，稳定重心位置。 二、演讲站姿分类 (1)前进式 这种姿势是演讲者用得最多，使用最灵活的一种站姿。右脚在前，左脚在后，前脚脚尖指向正前方或稍向外侧斜，两脚延长线的夹角成45 度左右，脚跟距离在15厘米左右。这种姿势重心没有固定，可以随着上身前倾与后移的变化而分别定在前脚跟与后脚上，不会因时间长而身体无变化不美观。另外，前进式能使手势动作灵活多变，由于上身可前可后，可左可右，还可转动，这样能保证手做出不同的姿势，表达出不同的感情。 (2)稍息式 一脚自然站立，另一只脚向前迈出半步，两脚跟之间相距约厘米左右，两脚之间形成75度夹角。运用这种姿势，形象比较单一，重心总是
落在后脚上。一般适应于长时间站着穿叮扁顾壮该憋双铂晶演讲中的短期更换姿势，使身体在短时间里松弛，得到休息，一般不长时间单独使用，因为它给人一种不严肃之感。 (3)自然式 两脚自然分开，平行相距与肩同宽，约20厘米为宜，太平会影响呼吸声音的表达，太迂则显得拘束。 演讲手的摆放位置 在演讲中，手放哪里很让我们头疼。 1.如果你在讲台后面，你可以双手自然放在讲台两侧。 2.如果没有的话，双手自然垂在身体两侧，也可以用手来操作媒体、握住提示卡、笔或是做手势等。 3.无论在什么情况下，都不该把双手置于裤子口袋内，或是不自然地手臂交叉。 演讲中常用的11种手势介绍 (1)伸手(手心向上，前臂略直，手掌向前平伸)——表示请求、交流、许诺、谦逊、承认、赞美、希望、欢迎、诚实等意思。 伸手训练："人活在世上，谁不希望自己的一生过得有意义、有价值一些呢?" "自己活着，就是为了使别人生活得更美好!" (2)抬手(手心向上，手臂微曲，手掌与肩齐高)——表示号召、唤起、祈求、激动、愤怒、强调等。 抬手训练："尊敬的各位领导、各位来宾，亲爱的同学们，大家早
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减 掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插 冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白 在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 EDTA RIPA 激活的 NaF（ 2. 配制 1) 直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)； 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
演讲手势30种 演讲的手势可以说是“词汇”丰富，千变万化，没有一个固定的模式。作为一个出色的演讲者平时要认真观察生活，刻苦训练，积极付出实践，今天WTT小雅给大家分享一些演讲中的30种手势，希望对大家有所帮助。 演讲手势30种 1.拇指式，竖起大拇指，其余四指弯曲，表示强大，肯定，赞美，第一等意。 5.小指式，竖起小指，其余四指弯曲，合拢表示精细，微不足道或藐视对方，这一手势演讲中用得不多。 63食指式，食指伸出，其余四指弯曲并拢，这一手势在演讲中被大量采用，用来指称人物，事物，方向，或者表示观点甚至表示肯定，胳膊向上伸直，食指向空中则表示强调，也可以表示数字“一”“十”“百”“千”“万”--演讲中右手比左手使用的频率大，手指不要太直，因为面对听众手指太直，针对性太强。 4.食指弯曲或钩形表示9、90、--齐肩划线表示直线，在空中划弧线表示弧形、 5.食指，中指，并用式，食指、中指分开伸直，其余三指弯曲，这一手势在一些欧美国际与非洲国家表示省略的意思，由前
英国首相丘吉尔在演讲中大量推广。我们在演讲中运用时一般表示21、20、200-- 6.中指，无名指，小指三指并用式，表示3、30、300-- 7.食指，中指，无名指，小指四指并用式。表示4、40、400-- 8.五指并用式。如果是五指平伸且分开，表示5、50、500--如果指尖向上并拢，掌心向外推出，有向前，希望等意思，显示出坚定于力量，又叫手推式。 9.母子，小指并用式。拇指与小指同事伸出，其余三指并拢弯曲，表示6、60、600-- 10.拇指食指并用式。拇指，食指分开伸出，其余三指弯曲表示8、80、800--如果并拢表示肯定，赞赏之意，如果二者弯曲靠拢但未接触，则表示“微小”“精细”之意。 11.拇指，食指，中指并用式，三指相捏向前表示“这”“这些”。用力点表示强调，也表示数字7、70、700-- 12.O型手势，又叫圆形手势，曾风行欧美，表示 “好”“行”的意思，也表示“零” 13.仰手式，掌心向上，拇指自然张开，其余弯曲，这一手势包容量很大。区域不同意义有别：手部抬高表示“赞美”“欢欣”“希望”;平放是“乞求”“请施舍”;手部放低表示无可奈何，很坦诚。
免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。 2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。 3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。 4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下： 1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用； 2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时； 3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。 4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。 5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。 6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。
染色质免疫共沉淀技术的发展 姚汪劲松发育生物学2013级2013110046 摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。 关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。 目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。 真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。 ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免
演讲时的30种手势 演讲的手势可以说是“词汇”丰富，千变万化，没有一个固定的模式。作为一个出色的演讲者平时要认真观察生活，刻苦训练，积极付出实践。下面介绍演讲中常用的手势三十式。 拇指式，竖起大拇指，其余四指弯曲，表示强大，肯定，赞美，第一等意。 小指式，竖起小指，其余四指弯曲，合拢表示精细，微不足道或藐视对方，这一手势演讲中用得不多。 食指式，食指伸出，其余四指弯曲并拢，这一手势在演讲中被大量采用，用来指称人物，事物，方向，或者表示观点甚至表示肯定，胳膊向上伸直，食指向空中则表示强调，也可以表示数字“一”“十”“百”“千”“万”……演讲中右手比左手使用的频率大，手指不要太直，因为面对听众手指太直，针对性太强。 食指弯曲或钩形表示9、90、……齐肩划线表示直线，在空中划弧线表示弧形、 食指，中指，并用式，食指、中指分开伸直，其余三指弯曲，这一手势在一些欧美国际与非洲国家表示省略的意思，由前英国首相丘吉尔在演讲中大量推广。我们在演讲中运用时一般表示21、20、200…… 中指，无名指，小指三指并用式，表示3、30、300…… 食指，中指，无名指，小指四指并用式。表示4、40、400…… 五指并用式。如果是五指平伸且分开，表示5、50、500……如果指尖向上并拢，掌心向外推出，有向前，希望等意思，显示出坚定于力量，又叫手推式。 母子，小指并用式。拇指与小指同事伸出，其余三指并拢弯曲，表示6、60、600……
拇指食指并用式。拇指，食指分开伸出，其余三指弯曲表示8、80、800……如果并拢表示肯定，赞赏之意，如果二者弯曲靠拢但未接触，则表示“微 小”“精细”之意。 拇指，食指，中指并用式，三指相捏向前表示“这”“这些”。用力点表示强调，也表示数字7、70、700…… o型手势，又叫圆形手势，曾风行欧美，表示“好”“行”的意思，也表示“零” 仰手式，掌心向上，拇指自然张开，其余弯曲，这一手势包容量很大。区域不同意义有别：手部抬高表示“赞美”“欢欣”“希望”；平放是“乞 求”“请施舍”；手部放低表示无可奈何，很坦诚。 俯手式。掌心向下，其余状态同仰手式。这是审慎的提醒手势，演讲者有必要抑制听众的情绪，进而达到控场的目的，同时表示表示反对、否定之意；有时表示安慰、许可之意；有时又用以指示方向。 手切式。手剪式的一种变式。五指并拢，手掌挺直，像一把斧子用力皮下，表示果断，坚决、排除之意。 手啄式。五指并拢相夹相触。，指尖向上，就像一个收紧了开口的钱包，用于强调主题和重点，也表示探讨之意。 手剪式。五指并拢，手掌挺直，掌心向下，左右两手同时运用，随着有声语言左右分开，表示强烈拒绝。 手抓式。五指稍弯，分开、开口向上。这种手势主要用来吸引听众，控制大厅气氛。 手压式，手臂自然伸直，掌心向下，手掌一下一下向下压去。当听众情绪激动时，可用这手势平息。 手推式，见“五指并用式”
演讲手势：演讲手势的规范技巧 在演讲中使用最多、动作最大的要算手势了。它可以随着内容的需要向上、下、左、右、前、侧各个方向挥动。手势可单手，可双手。这些都没有机械的规定。以下是小编整理的关于演讲手势的规范技巧，欢迎大家参阅。 6种基本演讲手势技巧： 1、切菜 将右手掌放于胸前，大拇指与食指之间角度大约为60-75度。然后向前切出，切出幅度分为三个幅度，小、中、大(左手同理)。 将手掌置于胸前是单手势练习的标准式，待您熟悉后可以自然运用，不用每个手势都把手置于胸前。 2、拍菜 将右手掌放于胸前，大拇指与食指之间角度大约为60-75度。然后手掌从胸前向前拍出。幅度分为小、中、大三个幅度。 3、扔菜
将右手掌放于胸前，大拇指与食指之间角度大约为60-75度。然后手掌从胸前向右划弧。幅度分为小、中、大三个幅度。 4、上菜 将右手掌放于胸前，大拇指与食指之间角度大约为60-75度。然后手掌从胸前向前翻出，掌心向上，掌背向下。幅度分为小、中、大三个幅度。 5、点菜 将右手握拳放胸前。然后向前伸出手臂，同时伸出食指。幅度分为小、中、大三个幅度。 6、锤菜 将右手握拳放于胸前。然后向前伸出手臂。幅度分为小、中、大三个幅度。 巧用手势增添演讲气势 第一，上中下三区的运用。 上区，就是手势在肩以上，表示积极向上，一般用在号召鼓动、赞美、表扬的时候。 下区，就是手势在腰以下，表示消极的、不好的，一般用在批评指责的时候。
中区，就是手势在肩与腰之间，表示一般的描述表达。 一般演讲过程中，大部分手势都在中区。 第二，场面大，手势大;场面小，手势小。 当会场大、人数多的时候，我们的手势做得要大气，要做出来让听众都能看见。 当会场小、人数少的时候，我们的手势做得要小一些，做太大了，反而会让听众感觉有点张牙舞爪，和现场不协调。 在这里还要分年龄，在对年龄大的人演讲时，手势要尽量小一些;相反在对年龄小的人演讲，手势要尽量大一些。 另外还有男女之分，对于男士，手势可以大气一些，对于女士，手势可以做小一些。 第三，肩发力，表示力量;肘发力，表示亲切。 第四，手势应该停留足够长的时间。 手势一做出去，马上就收回来，则会使听众对你立刻失去信赖感。 如歌星在现场唱歌时，他的手势会指着一群人好长时间才放下来，然后再去调动另外一群人的情绪。 第五，自己的思维“仓库”里要存储3到5个手势。
演讲手势技巧视频教程 篇一：演讲中常用的演讲手势(图) 手是人体的表情器官之一。手势是使用频率最高的体态语言形式。由于双手活动幅度较大，活动最方便、最灵巧，形态变化也最多，因而手势的表现力、吸引力和感染力也最强，最能表达出丰富多彩的思想感情。寓意深刻、优美得体的手势，能产生极大的魅力，激发听众的热情，加深听众对演讲内容的理解，使演讲获得成功。 演讲中，自然而安稳的手势，可以帮助演讲者平静地说明问题；急剧而有力的手势，可以帮助演讲者升华感情；稳妥而含蓄的手势，可以帮助演讲者表明心迹。演讲的手势分为四类： 一是指示手势。这种手势是用来指示具体真实形象，又可分为实指和虚指两大类。实指是指演讲者手势确指在场的人或事或方向，且均在听众的视线内。如“我”或“你们”、“这边”或“上面”、“这些”或“这一个”等。虚指是指演讲者和听众不能看到的。比如“在很久很久以前”、“在遥远的地方”。常用虚指可伴“他的”、“那时”、“后面”等词。指示手势比较明了，不带感情色彩，比较容易做。 二是模拟手势。用手势描述形状物，其特点是“求神似，不求形似”。比如用双手合抱，把梨子虚拟成一个大球形，表达出人们的真情实意。模拟手势信息含量大，升华了感情，
有一定的夸张色彩。 三是抒情手势。此手势在演讲中运用频率最多。比如：兴奋时拍手称快；恼怒时挥舞拳头；急躁时双手相搓；果断时猛力砍下。抒情手势是一种抽象感情很强的手势。 四是习惯手势。任何一位演讲者都有一些只有他自己才有而别人没有的习惯性手势，且手势的含义不明确不固定，随着演讲内容的不同而体现不同的含义。演讲手势贵在自然，切忌做作；贵在协调，切忌脱接；贵在精简，切忌泛滥；贵在变化，切忌死板；贵在通盘考虑，切忌前紧后松或前松后紧。 下面介绍几种常用且通用的演讲手势 大仰手式，掌心向上，拇指自然张开，手部抬高，表示“赞美”、“欢欣”、 望”之意，一般用在情绪高昂和抒情的时候。 小仰手式，掌心向上，拇指自然张开，其余弯曲，表示包容量很大。 “希 伸手式，手心向上，前臂略直，手掌向前平伸，表示请求、交流、许诺、谦逊、 承认、赞美、希望、欢迎、诚实等意思。 举手，五指朝天，前臂垂直，手掌举至头部，表示行动、肯定、激昂、动情、歌
免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验试剂 1. RIPA Buffer配制：
基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的储存液，室温保存）