表达《我们的心声》
表达《梦的翅膀》
一、动画片导入
师：同学们喜欢看动画片吗？老师这里有一段动画片，让我们一起来欣赏一下，请同学们边看边思考：在动画片中你都看到卡通人物，它在干什么？
学生观看（课件；喜羊羊与灰太狼）
生：灰太狼在看电视。
生：灰太狼在想着捉到羊的情景。
生：灰太狼在做梦捉羊。
师：对，灰太狼在想象着捉羊的场景，可以说这是灰太狼做的一个梦，是他的幻想。正因为他心中有这样的愿望，才会在梦境中出现，才会产生无尽的想象。这节课，我们也来借助梦的翅膀，走进的世界。
（板书：梦的翅膀）
二、说梦
师：孩子们，从出生到现在做过的梦可以说是数不胜数，说说看，在梦中你都见到了什么？
学生思考汇报
生：我在梦中看见了爸爸妈妈陪我过生日。
师：有些现实中美好的场景总会在梦中出现，这是对现实的重现。
（板书：现实的重现）
生：我在梦中看到了长大后的自己。
师：每个人都有自己的愿望，这个愿望总会在梦中实现。
（板书：美好的愿望）
生：我在梦中梦见自己变成了一只小鸟，变成了一个超人，见到很多卡通人物，和他们成为朋友……
师：我们更的梦都是借助了丰富的想象能力，尽情地去创造。
（板书：丰富的想象）
师：同学们的梦可真多真美，把我也带入了想象的王国。
三、做梦
1、创设“梦”的情境
孩子们，身在童年，如果不会美美地做梦，真是枉费少年时！在座的同学有谁不会做梦呢？现在让我们闭上眼睛，随着“梦”这只会飞的鸟儿一起飞翔！
（课件：梦是一只会飞的鸟）
（我发现梦是一只会飞的鸟
飞到草丛中蟋蟀正拉着提琴舞蹈飞到小溪边溪水正亮起喉咙歌唱飞到夜空中星星在大街上悠闲漫步飞到海底下鱼儿在广场上自由嬉戏飞呀，飞呀我就成了一只——一只小小鸟
喝一杯露珠酿的可乐吃一支梨花做的雪糕戴一顶飞虫编的礼帽
枕一波月光织的涟漪啊，我发现梦是一只会飞的鸟）
2、进入“梦境”
醒醒，看看梦想的鸟儿将你带到了哪儿，想好的同学可以与组内的同学交流，描述一下你们都去了哪里，见到了谁，发生了什么事情，或看到哪些美景，看谁说的语句通顺，清楚具体。
汇报
生：我梦见长了翅膀，飞到太空，见到了……飞到大海，见到了……
师：你的梦很开阔，去了你想去的地方，谁来评议一下他描述的过程怎样？生：他描述的有一定顺序，而且看到的物体说的很详细。
师：这样的梦可能很多同学都有过，哪些同学也有过类似的梦。
生：我梦见自己成了一名老师，我在课堂上给同学们上课……
师：长大后的自己，谁也梦见了长大后的自己呢？你们认为这样的梦可以具体写些什么内容？把发生的故事写具体，详细。
生：我梦见来到动物王国，我和小动物们成为了好朋友……
师：你们也见到过自己喜欢的卡通人物吗？这样的梦都有哪些情节？
生：我与小动物们说了什么，做了什么都可以详写。
师：真是心有多高，梦就会有多远。
老师真羡慕大家，短短几分钟就有了种种神奇而美丽的“梦幻之旅”。有梦的孩子真是幸福的，有梦的童年真是精彩的！
四、写梦评梦
师：孩子们，知道吗？如果把你们刚才的“梦”记录下来，就可能是一篇美丽的童话故事，一篇精彩的幻想小说。
想写吗？快来看看梦想仙子给你哪些提示。（课件：友情提示）
（1、写梦,并不是非要去做梦，或者把夜里做的梦照实写出来。而是动用做梦的形式，写出自己的心中所想。
2、写梦，就是写事情，所以要把事情的经过写清楚，写具体，有人、有物、有事、有景，可以有趣，也可以有启发。）
师：要求明白了吗？就让我们拿起笔，跟着梦想这只大鸟翱翔吧！把梦中最精彩的一幕记录下来，不用写开头与结尾，写你梦中最难忘，有趣的那一段。
学生写梦，教师巡视
师：谁想与大家一起分享自己的美梦。倾听的同学我们注意，如果是你，你还想有什么补充的吗？
简单评梦
生：我的梦是列车历险记。我变成了一个列车长，在行驶的过程中，列车遇到了强盗，他们的用枪射击玻璃……
师：哪位同学们来说一说你听出了什么
生：语言在烦琐。
生：想象没有一个明确的主题。
师：针对这些问题你们能给他提一些意见吗？
生：可以把描述的重点放在你做为一名列车长是如何带领大家与强盗进行斗争的。
生：重点写一写你们是用什么方法，突出写你们的聪明及勇敢。
师：这位同学，同学们意见你不妨试一试，相信修改后的习作会更吸引大家。师：还有其他同学来汇报自己的习作吗？
……
师：这么美的梦，还欠缺一吸引读者眼球的题目，你认为怎样的题目能让读者在你的习作前驻足。
生：假如我是一名教师，梦游太空，我的梦……
师：同学们的梦真让我耳目一新。
五、总结
同学们，这节课快要结束了，但是我们的“梦想之旅”才刚刚开始。课后，请同学们将习作的开关与结尾在进行一下完善，你们的习作将更加完整，更加成功。老师很高兴认识你们，我也会将你们的习作带给我的学生，让他们也看到你们的优秀作品。让你们的想象在我们学校的上空继续翱翔。
GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点
3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.doczj.com/doc/b812133304.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s
原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
德语句子的语序 初学德语的人往往对德语句子的语序感到迷茫,为什么一会动词在前,一会动词在后,一会谓语在主语前,一会谓语又在主语后. 这就是德语学习中的语序问题. 语序是指一个句子中各个句子成分的次序关系,而不是各个单词的次序关系. 德语句子的语序一般有三种:正语序,反语序和尾语序. 正语序是指: 句子以主语部分开始,接着是谓语或谓语的变化部分,再其次是其他的句子成分. 大部分陈述句是正语序.对主语提问的特殊疑问句也是正语序. z.B. Ich komme aus China . 我来自中国. Wir lernen Deutsch . 我们学习德语. Das sch?ne Bild geh?rt zu mir . 这张美丽的图片是我的. 【geh?ren | geh?rend | geh?rt | er / sie / es geh?rt | ich / er / sie / es geh?rte | er / sie / es hat / hatte geh?rt 1 geh?ren (zu) ? to belong (to) geh?rend ? belonging geh?rt ? belonged er / sie / es geh?rt ? he / she / it belongs ich / er / sie / es geh?rte ? I / he / she / it belonged er / sie / es hat / hatte geh?rt ? he / she has / had it belonged 】 Wer lesen den Text ? 谁读课文? 反语序是指: 谓语或谓语的变化部分位于主语之前. 一般疑问句,祈使句一般为反语序.部分叙述句,特殊疑问句为反语序. z.B. Studierst du Germanistik ? 你学德语语言文学吗? Sprechen Sie bitte laut ! 请您说大声点! Um sechs Uhr stehe ich auf . 我6点钟起床. Heute fahre ich nach Berlin . 今天我去柏林. Wann frühstücken Sie ?您什么时候吃早餐? Was machst du in Bonn ? 你在波恩做什么? Den Lehre (宾语) kenne ich überhaupt nicht .我根本不认识这位老师. 尾语序是指: 从句的语序都是尾语序,即从句中的谓语和谓语的变化部分位于句子的末尾. z.B. Ich wei? nicht , ob sie morgen hier kommt . 我不知道她（或他们）明天来不来这里。 Sobald es klingelt , beginnt der Unterricht . 铃一响就上课 Wenn ich Zeit h?tte , k?me ich gern mit .
研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人 们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获 得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。 通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段 序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋 白(Trx)融合蛋白等。 由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功 能的影响，反之亦然。 进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。 裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些 酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。
红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达 生物学实验教学中心 报告题目 红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达 作者姓名 饶慧 班级学号 0802班/2008114010214 指导教师 王友如 完成时间 2011年02月
目录 引言 (1) 1实验材料及实验仪器 (4) 1.1实验材料 (4) 1.2实验仪器 (5) 2实验方法 (7) 2.1 重组质粒的构建 (7) 2.2工程菌株的活化 (7) 2.3诱导表达 (8) 2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8) 3 结果与分析 (9) 总结 (10) 参考文献 (11) 致谢 (13)
红色荧光蛋白的原核表达 饶慧 （指导老师：王友如） （湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002） 摘要实验目的：研究红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。实验方法：通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。 关键词红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达
分子生物学综合实验 Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ). Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression
德语常用表达法一周速成 Der erste Tag 第一天 Teil 1 Ich bin ... 我是 1．Ich bin Lu Yun. 我叫卢云。 2．Ich bin Chinese. 我是中国人。 3．Ich bin 165 cm gro?. 我身高1米65。 4．Ich bin krank. 我病了。 5．Ich bin allein hier. 我一个人在这里。 6．Ich bin berufst?tig. 我有工作。 7．Ich bin Nichtraucher. 我不抽烟。 8．Ich bin satt。我饱了。 说明：德国人很重视姓名，包括自己的和别人的。他们一般初次见面就报上自己的名字，如“Schmidt，guten Tag！（史密斯，早上好）”。他要是不知道你的名字，他就会问“Wie ist Ihr Name?”。回答时可说：Ich bin...。sein为“是动词”，bin是它的单数第一人称变位（见本书第五部分第8单元）。是动词后面可以跟名词、形容词等。用的范围比汉语广。 Teil 2 Ich bin für 我赞同 1．Ich bin für dich. 我赞同你。 2．Ich bin dafür. 我赞成。 3．Ich bin für den Ausflug. 我赞成去郊游。
4．Ich bin für Ihren Vorschlag. 我赞同您的建议。 5．Ich bin für deine Entscheidung. 我赞同你的决定。6．Ich bin für diese Partei. 我赞成这个党。 7．Ich bin dafür, dass wir jetzt gehen. 我赞成我们现在走。8．Ich bin dafür, dass er bleibt. 我赞成他留下来。 说明：动词sein和介词für搭配表示“赞同”。表示“反对”用介词gegen，如Ich bin gegen seinen Vorschlag（我反对他的建议）。德语里这样的搭配还很多，注意记忆。这两个介词后面跟第四格宾语。如果后面是从句，则要变成dafür这样的形式。 Teil 3 Ich bin sicher. 肯定 1．Ich bin sicher, er kommt noch. 我敢肯定他会来。 2．Ich bin sicher, dass Sie mir helfen. 我敢肯定您会帮我。3．Ich bin sicher, das Wetter wird besser. 肯定天气会好的。4．Ich bin nicht sicher, ob er schon da ist. 我不敢肯定他是否到了。 5．Ich bin mir nicht sicher, wann der Zug abf?hrt. 火车什么时候来，我不敢肯定。 6．Ich bin sicher, es war noch Geld da. 我肯定还有钱。7．Ich bin sicher, er lügt. 肯定他骗人。 8．Ich bin sicher, sie hei?t Susanne. 肯定她叫苏珊。 说明：德国人喜欢说sicher这个词，好像他们什么都知道，什么都敢作出肯定的回答。另外，他们也会经常通过这样的问题“Sind Sie
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
浅谈原核表达的技巧 摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。 关键词：原核表达表达载体限制性内切酶 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。 一、原核表达一般程序 表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。 二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。 （1）对表达载体的分析 载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。 在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。 （2）对目的片段的分析 基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论，
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
Uhrzeiten时间 1.基本表述 offizielle Uhrzeit（官方）inoffizielle Uhrzeit（非官方） 4:00 Es ist vier Uhr. Es ist vier. 4:07 Es ist vier Uhr sieben. Es ist sieben nach vier. 4:15 Es ist vier Uhr fünfzehn. Es ist Viertel nach vier. 4:20 Es ist vier Uhr zwanzig. Es ist zwanzig nach vier. oder: Es ist zehn vor halb fünf. 4:25 Es ist vier Uhr fünfundzwanzig. Es ist fünf vor halb fünf. 4:30 Es ist vier Uhr drei?ig. Es ist halb fünf. 4:35 Es ist vier Uhr fünfunddrei?ig. Es ist fünf nach halb fünf. 4:40 Es ist vier Uhr vierzig. Es ist zwanzig vor fünf. oder: Es ist zehn nach halb fünf. 4:45 Es ist vier Uhr fünfundvierzig. Es ist Viertel vor fünf. 4:50 Es ist vier Uhr fünfzig. Es ist zehn vor fünf. -Wann hast du Unterricht? -Punkt neun. 九点整 -Wann gehst du zum Unterricht? -Kurz vor neun. 差不多九点 -Wann bist du fertig? -Gegen halb acht. 大约7点半 2.常用时间用语 Meine Uhr geht zwei bis fünf Minuten vor (nach). 我的表通常快（慢）大约二分钟到五分钟。Meine Uhr geht immer ganz genau. 我的表总是很准。 Meine Uhr steht. 我的表停了。 Es ist ungef?hr zwei Uhr. 现在差不多2点。 Haben Sie genaue Zeit? 您的表准吗？ Geht diese Uhr richtig? 这个表走的准吗？
德语语法时间从句 als（当...时候） als从句表示过去发生的一次性动作，主句和从句一般都用过去式。如果从句动作发生在主句之前，则从句用过去完成时，这时als可与nachdem互换。从句可前可后。 Als ich 18 Jahre alt war, ging ich auf die Uni. Der Zug war schon abgefahren, als ich den Bahnhof erreichte. Als(Nachdem) er sein Examen abgeschlossen hatte, fuhr er zu seinen Eltern. wenn（当...时候） wenn从句通常表示现在或将来一次或多次发生的事情。如果动词是过去时，则指过去多次发生的事。也可用immer wenn（每当）引导从句。从句可前可后。 Wenn die Ferien kommen, so verreisen wir. 假期一到，我们就外出旅行。 Wenn(immer wenn) Peter nach Berlin kommt, besucht er mich. Wenn(immer wenn) ich das Foto ansehe, denke ich an den sch?nen Urlaub zurück. bis（直到） bis从句表示主句行为延续到从句行为发生为止。主、从句时态可以一致，也可以不一致。也可以用bis da?引导，通常后置。 Ich warte, bis bu kommst. Du bleibst bei uns, bis der Regen aufh?rt. 你留在我们这里，等到雨停吧！ nachdem（在...之后） nachdem：在……之后，nachdem 表示的动作时间先于主句，即在主句动作开始之前，从句动作已完成： 句型： Nachdem ich Mittagespause gemacht habe，mache ich die Hausaufgabe. 例子： Nachdem ich Mittagespause gemacht habe，mache ich die Hausaufgabe. 我午休完我就做作业。 对从句提问用“Wann……”。 如： Wann machen Sie die Hausaufgabe 你什么时候做作业 nachdem 已经发生的： Nachdem er angekommen war, ging er ins Hotel. 他到达之后，就去旅馆。 Nachdem er angekommen war, ist er ins Hotel gegangen. 他到达之后，就去了旅馆。 将要发生的： Nachdem er angekommen ist, geht er ins Hotel. 他到达之后，就去旅馆。 Nachdem er angekommen ist, wird er ins Hotel gehen. 他到达之后，就会去旅馆。 w?hrend（在...期间） w?hrend表示主句和从句的动作在同一个持续的时间段内进行。从句可前可后，主从句时态一致。
在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎
标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。