本科学生综合性实验报告
实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教师：
开课学期：2013 至2014 学年第二学期填报时间：2013 年 6 月日
）无菌操作流程：
二．实验报告
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮 1、本论文课题国内外概况和文献综述： 应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。 胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。 对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高 [1-3] 。 同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根 [1,3,4] 。此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏 根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果 [5] 。 在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基 [1] 。 不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等 [2,3,6] 。此外还 有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7] 。
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066 学号：20131070156座号：A2 开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 ( 云南大学生命科学学院,昆明650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表 明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型 愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培 养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高 峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh root s really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1 材料和方法 1. 1材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量 I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一 边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。 5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。 6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。 7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月 小组合作： 是○√ 否○ 一、实验预习 1、实验目的： 1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。 1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 2、实验准备： 2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。 药品： NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。 2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。 药品和试剂： MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH 2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器： 100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。
综合性实验报告 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导 及继代增殖培养 一、实验原理及目的 （一）实验目的 1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。 2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。 3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。 4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。 5、初步掌握外植体的消毒技术。 6、掌握组培室常用的化学试剂。 7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 （二）实验原理 1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。 2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的
根亦具有繁殖的功能。植物根生长快、代谢能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代谢的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。 依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。 3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D，IAA和
. 研究背景 1.1 胡萝卜 胡萝卜(Daucus carota L．)为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，占蔬菜生产总量的3％，达13．5百万吨(Hole，1996)。胡萝卜块根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪[1] 。由于其富含维生素A前体类胡萝b素和植物纤维，因而是一种重要的营养保健品。其适于生食、加工、烹调等多种用途。中国是农业大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。 因此继续深入研究胡萝卜细胞培养还是很有必要的。 1.2 组织培养 植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术[2]。其理论基础是植物细胞具有全能性，即一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有发育成完整植株的潜能，在适宜的条件下能够发育成一个完整的植株。进行离体培养时，植物的组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。 胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。
2. 材料与方法 2.1 材料 培养皿、锥形瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、烧杯、量筒、玻璃棒、酒精灯、无菌操作台、高压灭菌锅、微波炉、PH试纸。 MS培养基、2,4-D、6-BA、活性炭、无菌水、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、1% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液、胡萝卜块根（2012-2-21-怡购，2012-2-24-水果摊，2012-3-13-水果摊，2012-3-21-珠影，2012-3-29-荣一） 2.2 方法 2.2.1 MS培养基的配制200ml ◆用大烧杯取无菌水100-120ml ◆依次用移液管量取加入母液：20ml大量（10x）、2ml微量（100x）、 2ml铁盐（100x）、4ml有机（50x）、2mg/L2,4-D。 ◆称取6g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解。 ◆用量筒定容至20ml。 ◆用pH试纸调pH至6.0-6.2 ◆称取1.6g琼脂加入，搅拌。 ◆放入微波炉内加热直至清澈无沉淀。 ◆分装后高压灭菌3h。 探究实验1激素为1.0mg/L2,4-D，1.0mg/L6-BA[3] 探究实验2激素为2.2mg/L2,4-D[3 4]
胡萝卜组织培养教学设计 小组成员：何家会、宋亚伟、冯海艳、尹化、黄洁、牛伟坤 一、教学目标 1、知识目标： 说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行胡萝卜的组织培养。 2、能力目标： 掌握培养基制备、外植体消毒、接种、培养、移栽以及栽培等基本操作技术。 3、情感目标： 关注植物组织培养技术在实践生活中的运用，养成严谨的科学素养。 二、实验目的 1、掌握植物组织培养过程中的愈伤组织诱导和生根培养技术。 2、掌握植物组织培养过程中使用的无菌技术。 三、实验原理 植物组织培养： 指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 ?外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的那部分材料。 ?愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁 细胞，多在植物体切面上产生。 ?脱分化：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。或者说是由高度分化的植物组织或器官产生 愈伤组织的过程。
?再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过程。 ?植物体的任何一个细胞都具有全能性。分化了的植物根、茎、叶等组织器官在一定的条件下进行离体培养，给于一定的营养和激素，可以脱分化为愈伤组织。愈伤组织在不同的营养和激素的作用下，又可以再生出完整的小植株。植物的脱分化和再分化培养，证明分化了的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的全套基因。 四、实验材料与方法 实验材料 ?胡萝卜（新鲜幼嫩） ?MS培养基+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA ?70%酒精2.5%NaCLO无菌水超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 实验方法 ?培养基的配制。 ?小麦籽粒用无菌水浸泡10小时。 ?取材、消毒和接种。 五、实验过程 胡萝卜愈伤组织的诱导 1、外植体消毒 用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 2、外植体接种 把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，
植物组织培养在实际当中的应用 摘要：植物细胞要表现出全能性，须经过脱分化、再分化等一系列过程。在实际应用中可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。随着科学技术的不断进步，植物组织培养这门崭新的技术将日益普及和深入，成为现代农业生产中重要的技术手段 关键字：脱分化,愈伤组织,原生质体,脱毒苗,培养基 形成芽的培养基条件常有不同，可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。除营养芽之外，在组织培养中有时也有花芽的形成，如烟草、花生等。也有变态器官的形成，如百合鳞片切块分化出的芽，形成小鳞茎，唐菖蒲茎端可诱导形成小球茎，马铃薯的茎切段可以形成块茎。 在很多禾谷类作物的组织培养中发现，用较高浓度的生长素（2，4-D）诱导形成的愈伤组织，当培养在除去生长素，或适当浓度的活性较低的生长素中时，就可以诱导芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培养基附加10-5摩尔2，4-D 培养水稻愈伤组织可以生根，一旦转入无生长素的培养基时就能产生芽。Rangan 将小米愈伤组织从含生长素的培养基转移到无生长素的培养基，一个星期内就形成了芽。 但在另一些例子中激素比例控制器官分化的问题则出现完全相反的情况。苜蓿在有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可以形成愈伤组织，转入不加以上两种激素的培养基中能分化，但分化的情况与原来的激素比例有关。如果愈伤组织是在高细胞分裂素/生长素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/ 细胞分裂素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的愈伤组织，则易生芽。由此看来，分化与激素的关系同植物的
植物组织培养论文 摘要：在胡萝卜组培试验，用胡萝卜做外植体，在培养基上接种诱导形成愈伤组织，由于接种时对外植体消毒不彻底，接种操作不规范，导致培养基全部污染，实验失败 胡萝卜 胡萝卜（Daucus carrot），又称甘荀，是伞形科胡萝卜属二年生草本植物。以肉质根作蔬菜食用。原产亚洲西南部，阿富汗为最早演化中心，栽培历史在2000年以上。名为Daucus carota，通常为一年生，根可食。常见品种中，根呈球状或锥状，橘黄色、白色、黄色或紫色。原产阿富汗及邻近国家。野胡萝卜已成为分布于欧洲、美国和其他温带国家的杂草。地中海地区早在西元前就已栽培胡萝卜，在 中国和西北欧不迟于14世纪，现栽培于整个温带地区。 组织培养发展简史 Haberlandt(1902)首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。与rechinger不同，Haberlandt相信切块大小不会影响细胞增殖，但由于Haberlandt使用的培养液成分简单，培养的细胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验失败，培养的细胞虽然存活了几个月但没能分裂。Haberlandt 转而对损伤修复发生兴趣，提出激素作用的概念（leptohormone)，与维管组织特别是韧皮部有关；另一类是创伤激素(woundhomone)，与细胞损伤有关，为后来激素理论的建立和在组织培养中的广泛应用奠定了基础。但自Haberlandt的实验之后直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，其间的30多年里，植物组织培养技术几乎没有什么进展。分析其原因，主要就是培养基的成分和实验所选取的材料不够合适。 20世纪60年代，在植物组织培养方面的另外两项成就就是划分小孢子培养和原生质体培养的成功。Guha和Maheshwari（1966，1967），Rourgin和Nitsch（1967）先后利用烟草和胡萝卜的小孢子培养获得单倍体植株，并成功地实现了染色体的加倍，使这种同源二倍体植株在5个月内收获到种子。Cocking等用纯化的纤维素酶和果胶酶处理烟草细胞，获得原生质体，通过调节渗透压的方法控制原生质体膨胀，使培养获得成功，得到了再生植株。自20世纪60年代始，植物组织与细胞培养逐渐走向了工厂化和商品化阶段。 材料与方法
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导 一、实验目的； 通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了 解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备 方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二、实验原理： 根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容实验包括以下3部分内容: 实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌 实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导 实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存 1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制 做准备。 2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配 制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的 配制。 MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具 分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、 1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量 筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂 （1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分： ①大量元素（母液I ）: NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO; ②微量元素（母液口）: KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q；③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q； ④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、烟
南昌大学实验报告胡萝卜愈伤组织诱导 姓名： 学院： 专业： 班级： 学号：
胡萝卜愈伤组织诱导 实验一母液的配制与保存 一、实验目的 1.学习母夜的配制方法和母液的保存方式。 2.熟悉掌握制备母液的操作。 二、实验原理 培养基中提供植物生长所需的营养成分，才能满足植物正常的生长发育的需求。主要包括水分、有机物质、盐类，而配制母液时将其分为大量、微量、钙盐、镁盐、铁盐、有机和肌醇分别配制。配臵培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配臵，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液臵于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配臵即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1．试剂 NH4NO3,KNO3,KH2PO4,CaCl2〃2H2O,MgSO4〃7H2O,FeSO4〃7H2O Na2-EDTA, MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2O CuSO4〃5H2O,CoCl2〃6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水。 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。四、实验步骤 1 、计算：计算各化学成分所需要的量。大量、微量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。计算后制成配方表。2、制定标签：裁取7张适当大小的牛皮纸，用铅笔写上MS，种类，并标明此类母液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期。 3、大量元素母液的配制：先用量筒量取300ml蒸馏水放入500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml 容量瓶中，并用蒸馏水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml，而后用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并臵于冰箱中低温保存备用。 4、微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O，H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2O。CuSO4〃5H2O 和CoCl2〃6H2O先稀释后用移液管吸取,按制备母液I的方法逐个溶解，转移至容量瓶中，
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心 细胞工程实验实验报告 胡萝卜愈伤组织诱导培养实验 摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。 关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养 胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。 1.材料和方法 1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。 1.2方法： 1.2.1愈伤组织的诱导培养 （1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8 （2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤） （3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次； （4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块； （5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶 （6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况 1.2.2继代培养 从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）1.2.3愈伤组织再分化的诱导 （1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L （2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3
胡萝卜组织培养系统实 验 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 2013级生物技术（国家生命科学与技 年级专业： 术基地班） 姓名：杨梦梅选课号： 学号：座号：A2 开课日期：学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究 第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 (云南大学生命科学学院, 昆明 650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特 别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方 面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次 生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1材料和方法 1. 1 材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、 10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放 在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续
胡萝卜愈伤组织的培养 摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。针对这一问题我们反复实验。通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。 关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制 1.实验流程 （1）实验总流程： MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录 （2）无菌操作流程： 实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程： 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养 （4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程： 器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种 2.实验仪器及材料 胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 3.实验方法与步骤 3.1胡萝卜愈伤组织的诱导 ①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 ②外植体接种。把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。为了操作简便、快速，外植体美观，建议使用打孔器切取胡萝卜外植体。具体操作方法: 把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中(建议使用一次性塑料培养皿)，用小刀将其切成2~3cm的小段，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2~3cm的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L KT的固体培养基上，放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d后长出淡黄色愈伤。 3.2胡萝卜愈伤组织悬浮体系的建立 用镊子夹取在固体培养基上继代20d的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤用解剖刀切碎，接种在MS+0.3mg/L 2，4-D+3%蔗糖的液体培养基(pH5.8)中，每100mL的三角瓶中加入MS液体培养基50mL，摇床转速为110r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，
植物组织培养技术 教学目标 1.简述植物组织培养的过程 2.理解植物组织培养的原理 3.通过对植物组织培养条件的分析培养学生分析问题、解决问题的能力 教材分析 重点：植物组织培养的原理 难点：植物组织培养的过程 学法指导：在讨论基础上，引领学生分析影响组织培养的因素 自主学习： 通读P34—35 胡萝卜的组织培养实验，思考以下问题 一、实验原理和材料 1、该实验的结果是什么？ 2、培养基中应该含有哪些成分？（P36小知识） 3、什么是灭菌？为什么要对培养基灭菌？ 二、方法步骤 （一）取材 （外植体定义：由活体植物体上取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等） 1、培养的是胡萝卜的哪一部分? 2、前面提到培养基要严格灭菌，你认为外植体也要严格灭菌吗？ （二）接种 1、接种过程要不要严格的无菌操作？ 2、结合材料用具，想一想，接种应该在什么环境操作？ （三）培养 1、初步培养得到的是幼苗吗？ 2、愈伤组织细胞是具有什么特征的细胞？（P33第二段） 3、什么叫脱分化？（P33第二段） 4、培养过程需要更换培养基吗？ 5、什么叫再分化？ 6、培养初期需要控制怎样的条件？ 三、理论基础（P33—34正文部分）
1、为什么通过对组织块的培养能得到完整的小植株？ 2、什么是细胞的全能性？ 3、高度分化的植物体细胞为什么具有全能性？ 4、在生物体的生长发育过程中细胞会不会表现全能性？ 合作探究 1、从培养基的配制到外植体的处理，再到接种和最后的培养，你最大的感触是什么？ 2、脱分化过程中通常要避光培养是因为更容易诱导出愈伤组织。而再分化过程通常要给以周 期性的光照，这是为什么呢？ 3、你认为影响脱分化和再分化的关键因素有哪些？ 4.、在生物体的生长发育过程中细胞不会表现全能性，怎样才能让植物细胞表现出全能性？ 5、请概括出植物组织培养的流程简图。 当堂反馈 1、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织过程中，下列哪项是不需要的（） A．无菌的培养环境B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2、用高度分化的植物细胞组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是（） 该愈伤组织是细胞经过脱分化形成的 B．该愈伤组织的细胞没有全能性 C．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成 D．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状体 3、在下列选项中，没有利用植物组织培养技术的是（） A．利用花药离体培养得到单倍体植株 B．利用基因工程培育抗棉铃虫的棉花植株 C．利用胡萝卜形成层培养成胡萝卜幼苗 D．利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到多倍体植株 预习指导 1、植物体细胞杂交的目的是什么？ 2、植物体细胞杂交和有性杂家相比有何突破之处？ 3、植物体细胞杂交技术用到了植物组织培养技术吗？ 4、怎么处理得到原生质体？ 5、诱导原生质体融合的方法有哪些？
胡萝卜组织培养[教学] . 研究背景 1.1 胡萝卜 胡萝卜(Daucus carota L()为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，占蔬菜生产总量的3,，达13(5百万吨(Hole，1996)。胡萝卜块根营养丰富，约含有88,的水、6,,8,糖、1,,2,植物纤维，0(7,,1(2,蛋白质、1,灰 [1] 份及0,3,脂肪。由于其富含维生素A前体类胡萝b素和植物纤维，因而是一种重要的营养保健品。其适于生食、加工、烹调等多种用途。中国是农业大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。 因此继续深入研究胡萝卜细胞培养还是很有必要的。 1.2 组织培养 植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物 [2]组织(器官或细胞)并诱导使其长成完整植株的技术。其理论基础是植物细胞具有全能性，即一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有发育成完整植株的潜能，在适宜的条件下能够发育成一个完整的植株。进行离体培养时，植物的组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。 胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。 2. 材料与方法 2.1 材料 培养皿、锥形瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、烧杯、量筒、玻璃棒、酒精灯、无菌操作台、高压灭菌锅、微波炉、PH试纸。
MS培养基、2,4-D、6-BA、活性炭、无菌水、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、1% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液、胡萝卜块根(2012-2-21-怡购，2012-2-24-水果摊，2012-3-13-水果摊，2012-3-21-珠影，2012-3-29-荣一) 2.2 方法 2.2.1 MS培养基的配制200ml , 用大烧杯取无菌水100-120ml , 依次用移液管量取加入母液:20ml大量(10x)、2ml微量(100x)、 2ml铁盐(100x)、4ml有机(50x)、2mg/L2,4-D。 , 称取6g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解。 , 用量筒定容至20ml。 , 用pH试纸调pH至6.0-6.2 , 称取1.6g琼脂加入，搅拌。 , 放入微波炉内加热直至清澈无沉淀。 , 分装后高压灭菌3h。 [3]探究实验1激素为1.0mg/L2,4-D，1.0mg/L6-BA [3 4]探究实验2激素为2.2mg/L2,4-D 2.2.2 培养条件 , 接种环境 1先用75%酒精擦拭无菌操作台的内部6个面。 2将现配的75%的酒精、1%次氯酸钠、刀、镊子、无菌纸、无菌水、小烧杯、培养皿、废液缸、试管架、打火机等操作用的工具放置到相应位置。 3将酒精灯添加适当的酒精(不超过容积的2/3)，并检查是否可以点燃。 4先开紫外灯 40min，后再通风20min。 5进入操作台的物品都要经酒精消毒。