SN0169-92代替ZBX09002一88 Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2、设备和材料
2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3、培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7MR-VP培养基。
3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。
4、样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5、大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表[见附录B(补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6、粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7、大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm 试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4LST肉汤：于36±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴
性。7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8、大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×10-4/g(mL)＝6.0×105/g(mL)
附录A培养基和试剂(补充件)
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤
胰蛋白(胨)或胰酪胨(Trypticase) 20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 2.75g
磷酸二氢钾 2.75g
月桂基硫酸钠0.1g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL
0.1％煌绿水溶液13.3mL
蒸馏水
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5)，用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。
A3EC肉汤
胰蛋白(胨)或胰酪(胨)20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 4.0g
磷酸二氢钾 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
磷酸氢二钾 2.0g
琼脂15.0g
伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸馏水1000.0mL
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨10.0g
蒸馏水1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。
A7MR-VP培养基
(胨)胨7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾(K
2HPO
4
) 5.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH
4HPO
4
·4H
2
O) 1.5g
磷酸氢二钾(K
2HPO
4
)1.0g
硫酸镁(MgSO
4·7H
2
O) 0.2g
枸椽酸钠(含2H
2
O) 3.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。
A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
蛋白胨7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红0.03g
结晶紫0.002g
琼脂15～18g
蒸馏水1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±0.1。煮沸2min，将培养基冷至45～50℃倾注平板。临用时制备，不得超过3h。
A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液磷酸二氢钾(KH
2PO
4
)34.0g
蒸馏水500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。
稀释液取贮存液1.25mL，
用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。
A11生理盐水
氯化钠8.5g
蒸馏水1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A12革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇20.0mL
1％草酸铵水溶液80.0mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水300.0mL
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
沙黄复染液：
沙黄0.25g
95％乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法
a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
b. 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
c.滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
d. 滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
A13Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇75.0mL 盐酸(浓)25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。
A14甲基红指示剂
甲基红0.1g
95％乙醇300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。
A15Voges-Proskauer(V-P)试剂
甲液
α-萘酚 5.0g
无水乙醇100.0mL 乙液
氢氧化钾40.0g 用蒸馏水加至100.0mL
附录B1g检样中最近似值(MPN)表
(补充件)使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.001g。
注：①本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。
本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。
中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准1993-05-01实施
粪大肠菌群测定复习试题 一、填空题 1.地表水环境质量标准(GHZB1—1999)中，对环境质量卫生指标粪大肠菌群项目作出明确规定：Ⅰ类水质标准值为；Ⅱ类水质标准值为；Ⅲ类水质标准值为；Ⅳ类水质标准值为，Ⅴ类水质标准值为。 答：≤200个/L；≤1000个/L；≤2000个/L；≤5000个/L；≤10000个/L。 2.粪大肠菌群是一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用 更有。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的。 答：总大肠菌群；总大肠菌群；代表性；指示菌。 3.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由、、 、等配制而成的，调节pH为，应在 灭菌。 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；氯化钠；7.2-7.4；115℃；20min。 4.农田灌溉水质标准(GB5084—92)中，根据农作物的需求状况，将灌溉水质按灌溉作物分为三类：水作、旱作和蔬菜。其生物指标粪大肠菌群标准值定为 。 答：≤10000个/L。 5.为了区别存在于中的大肠菌群和存在于的大肠菌群,可将培养_ __ _____，在此种条件下仍能_____ 并使____________ _，则称为粪大肠菌群。 答：自然环境；温血动物肠道内；温度提高到44℃；生长；发酵乳糖产酸产气。 6.进行复发酵试验时，用3mm 或灭菌棒将转接到 培养液中。在培养。培养后观察发酵管 表明确信。
答：接种环；培养物；EC；44±0.5℃水浴下，24±2h；产气；试验阳性。 7.在污水综合排放标准(GB8978—1996)中，把医院、兽医院及医疗机构含病原体污水的粪大肠菌群分为三级标准：一级标准值；二级标准值；三级标准值。而传染病、结核病医院污水的粪大肠菌群三级标准值分别为：、、。 答：500个/L；1000个/L；5000个/L；100个/L；500个/L；1000个/L。8.EC培养液的配比是：胰胨，乳糖，氯化钠，磷酸二氢钾，胆盐三号，磷酸氢二钾，溶解于蒸馏水中。在 15min，灭菌后应为。 答：20g；5g；5g；1.5g；1.5g；4g；1000mL；121℃灭菌；pH；6.9。 二、问答题 1.粪大肠菌群的涵义是什么？ 答：指一群需氧及兼性厌氧在44.5℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.控制粪大肠菌群指标值的意义是什么？ 答：为了人体健康卫生的要求。 3.粪大肠菌群测定有几种方法？通常用哪种方法？ 答：有三种：多管发酵法、滤膜法、延迟培养法。用多管发酵法。 4.简诉测定粪大肠菌群多管发酵法的操作步骤？ 答：测定分二个步骤进行：量取若干经稀释的水样，接种乳糖蛋白胨培养液，进行初发酵试验：在37±0.5℃下培养24±2h，产酸和产气的发酵管表明试验阳性，再将表明试验阳性的发酵管中的培养物转接到EC培养液中，进行复发酵试验，在44±0.5℃水浴下培养24±2h，发酵管产气表明确信试验阳性。 5.在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 6.什么叫兼性厌氧细菌？ 答：氧存在或不存在的条件下均能繁殖的细菌。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定 1 范围 本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。 2 定义 粪大肠菌群 fecal coliforms 系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。 3 设备和材料（内容略） 4 培养基和试剂 培养基：遵照附录A的规定。 革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。 5 检验步骤 样品稀释 在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。 用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。 乳糖发酵试验 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。 分离培养 从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。 证实试验 从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。 结果 证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。 附录 A （规范性附录） 培养基 乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨g 猪胆盐g 乳糖g %溴甲酚紫水溶液m L 蒸馏水1000m L
粪大肠菌群的测定 1 卫生学意义 粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。 2 检验方法 2.1 术语与定义 一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢 二钾（K 2HPO 4 ）：2.75g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g； 蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2 2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 （2）EC肉汤（E.coli，BGLB）： 1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖： 5.0g；磷酸氢二钾（K 2HPO 4 ）：4.0g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：1.5g；氯化钠：5.0g；
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备 一次性帽子、口罩、脚套 1， 移液管10ml 量筒100ml ｝ 玻璃珠 三角瓶 培养皿 2， 乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵） 乳糖发酵培养基（用于复发酵） 伊红美蓝培养基（用于分离培养） } 121℃，15min 无菌水 } 121℃，15min 二：实验过程 无菌条件下进行： 10.0g 固体样品/10ml 液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml 无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min 振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml 加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培 养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：从平板上挑取可以菌落，进行革兰氏染色。 结果：染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 证实为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN 检索表，得出每克（毫 升）肥料样品中的粪大肠菌群数 ｝160℃，4h ｝115℃，15min
粪大肠菌群多管发酵法 1、培养基、试剂与仪器 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。 单倍乳糖蛋白胨培养液： 称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 EC 培养液： 称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。 验所需仪器 超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤 前期准备 器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。 广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。 采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过 2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 4.2 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。) 表1 接种用水量参考表 如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 4.3 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.4 复发酵试验
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》练习题 1 《粪大肠菌群的测定》练习题 备注：每题后面的简单、一般、困难是指题目的难易程度。 一、选择题 1.EC 培养液的配比是：胰胨20g ，乳糖5g ，氯化钠5g ，磷酸二氢钾1.5g ，胆盐三号1.5g ，磷酸氢二钾4g ，溶解于1000mL 蒸馏水中。在( C )℃灭菌15min ，灭菌后pH 为6.9。（一般） A 、37 B 、115 C 、121 D 、165 2.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠等配制而成的，调节pH 为( B )，应在115℃灭菌20min 。（一般） A 、5.2-5.4 B 、7.2-7.4 C 、9.2-9.4 D 、12.2-12.4 二、判断题 1.粪大肠菌群是总大肠菌群一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的指示菌。（√）（一般） 2.为了区别存在于自然环境中的大肠菌群和存在于温血动物肠道内的大肠菌群,可将培养温度提高到44℃，在此种条件下仍能生长并使发酵乳糖产酸产气，则称为粪大肠菌群。（√）（一般） 3.进行复发酵试验时，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44±0.5℃水浴下培养24±2h 。培养后观察发酵管产气表明确信试验阴性。（×）（困难） 三、问答题 1.简述粪大肠菌群指标的含义及常用测定方法。（一般） 答案：（1）粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便，在44.5℃温度下能生长并发酵乳酸产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。（2）粪大肠菌群指标常用的测定方法为多管发酵法，它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater ? Copyright 1999 by American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation presence-absence (P-A) procedure.Can. J. Microbiol. 15:771. CLARK, J.A. & L.T. VLASSOFF . 1973. Relationships among pollution indicator bacteria isolated from raw water and distribution systems by the presence-absence (P-A) test. Health Lab. Sci.10:163. CLARK, J.A. 1980. The influence of increasing numbers of nonindicator organisms upon the detection of indicator organisms by the membrane filter and presence-absence tests. Can. J.Microbiol. 26: 827. CLARK, J.A., C.A. BURGER & L.E. SABATINOS . 1982. Characterization of indicator bacteria in municipal raw water, drinking water and new main water samples. Can. J. Microbiol.28:1002. JACOBS, N.J., W.L. ZEIGLER, F.C. REED, T.A. STUKEL & E.W. RICE . 1986. Comparison of membrane filter, multiple-fermentation-tube, and presence-absence techniques for detecting total coliforms in small community water systems. Appl. Environ. Microbiol. 51:1007. RICE, E.W., E.E. GELDREICH & E.J. READ . 1989. The presence-absence coliform test for monitoring drinking water quality. Pub. Health Rep. 104:54. 9221 E. Fecal Coliform Procedure Elevated-temperature tests for distinguishing organisms of the total coliform group that also belong to the fecal coliform group are described herein. Modifications in technical procedures,standardization of methods, and detailed studies of the fecal coliform group have established the value of this procedure. The test can be performed by one of the multiple-tube procedures described here or by membrane filter methods as described in Section 9222. The procedure using A-1 broth is a single-step method. The fecal coliform test (using EC medium) is applicable to investigations of drinking water,stream pollution, raw water sources, wastewater treatment systems, bathing waters, seawaters,and general water-quality monitoring. Prior enrichment in presumptive media is required for optimum recovery of fecal coliforms when using EC medium. The test using A-1 medium is applicable to source water, seawater, and treated wastewater. 1. Fecal Coliform Test (EC Medium) The fecal coliform test is used to distinguish those total coliform organisms that are fecal coliforms. Use EC medium or, for a more rapid test of the quality of shellfish waters, treated wastewaters, or source waters, use A-1 medium in a direct test. a. EC medium: Tryptose or trypticase 20.0g Lactose 5.0g Bile salts mixture or bile salts No. 3 1.5g Dipotassium hydrogen phosphate, K 2HPO 4 4.0g
粪大肠菌群的测定 1、半个月前配好初、复发酵所需培养液 2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口 3、操作 （1） 培养液 初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 调节PH 为7.2—7.4（NaOH ） 6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。 双月10个地表水，2个创业。共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。 创业的水一个月采两次水样 复发酵 EC 培养液 胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml
（2）做样 初发酵： 地表水15根管为一个水样。5根为一组。第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。 （10、1、0.1的取样量） 创业，每个水样15根单倍。同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、 0.001ml。 将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。 观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。 复发酵： 呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。将阳性的试管中溶液接种（接种环）到EC培养液中，放在45℃±0.5℃的水浴锅中培养24h±2h。水浴锅液面应高于管中液面。 观察：产气（有气泡）则证实为阳性。记录阳性试管数，查表可得MPN值。 结果表示单位为：个/L
BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水 平法--菌落计数技术 序 ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。 国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。 起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。 这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。主要的修改内容如下： ——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）； ——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。 考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。 绪论 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。 当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。 同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。 本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。此外，
一．填空题 1.总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为____________、_____________和______________。 2.粪大肠菌群多管发酵法的初发酵试验，是将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在____℃培养____h，产酸产气则为阳性。 二、判断题 1.总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。（） 2.对受污染严重的水体样品，如果在初发酵中未发现产气，则应将其培养到48h，然后再进一步证实有无大肠菌类细菌。( ) 3．如果粪大肠菌群测定的接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液10m1，如接种量为1m1，则接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10m1中。( ) 4．粪大肠菌群多管发酵法的复发酵试验，是将培养物转接到EC培养液中，在35℃下培养24h。( ) 5．水中总大肠菌群和粪大肠杆菌的快速测定法，适用于医院污水、生活污水、垃圾渗滤液以及其他行业(如餐饮业、食品加工等)排入地表水中的污水。( ) 三、选择题 1．我国目前以为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘即为该体积水样中的总大肠菌群数。( ) A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10 四．简答题 1.简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。 2.如果总大肠菌群和粪大肠菌群测定水样接种量不是10ml、1m1和0.1ml而是较低或较高三个浓度的水样，应如何计算总大肠菌群数或粪大肠菌群数?试写出计算公式。
答案 一．1.初发酵试验 平板分离 复发酵试验 2. 37 24 二．1.正确 2.正确 3.错误 4.错误 5.正确 三.1.C 四. 1.答案：(1)将水样做1∶10稀释。(2)在各装有5m1三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入10ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1m1 1∶10的稀释的水样。(3)将各管充分混匀，置37℃恒温箱培养24h 。 2.答案：如果接种的水样量不是10m1、1m1和0.1m1，而是较低或较高的三个浓度的水样，可先查MPN 表求出MPN 指数，再经过下面的公式换算成每100m1的MPN 值。MPN 值乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数(或粪大肠菌群数)。 ()()ml ml MPN MPN 接种量最大的一管 指数值10?=
总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌的从属关系及介绍 相互关系 总大肠菌群> 耐热大肠菌群> 大肠埃希氏菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群 所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备一次性帽子、口罩、脚套 1，移液管{10ml 量筒100ml｝160℃，4h 玻璃珠160℃，4h 三角瓶160℃，4h 培养皿160℃，4h 2，乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵）115℃，15min 乳糖发酵培养基（用于复发酵）115℃，15min 伊红美蓝培养基（用于分离培养）121℃，15min 无菌水121℃，15min 二：实验过程无菌条件下进行： 10.0g固体样品/10ml液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：无菌落→实验终止→<3 有菌落，进行革兰氏染色。 染色反应阳性者（紫色）→实验终止→<3 染色反应阴性者（红色）为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3 产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数
滤膜法-粪大肠菌群的测定 1、适用范围 本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。 2、原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。 3仪器： 滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹 3、培养基和试剂 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。 M-FC培养基： 胰胨 10g 蛋白胨 5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 12.5g 胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶10ml 1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml 蒸馏水 1000ml 制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 4、步骤 水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。 滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。
粪大肠菌群检测 一、室所用设备、器皿 1、无菌区工作台 2、恒温培养箱 3、高压蒸汽灭菌器 4、冰箱 5、酒精灯 6、天平 7、电炉 8、采样广口瓶 9、烧杯、玻璃棒 10 、玻璃发酵管 11、试管架 12、移液管 13、锥形瓶 二、药品：乳糖胆盐培养基 三、前期准备 1、玻璃器皿灭菌（高压蒸汽灭菌） 所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、锥形瓶等玻璃器皿均需放入高压锅灭菌。 广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 玻璃试管、移液管、玻璃棒：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 2、采样 采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。 采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 四、实验步骤（多管发酵法） 1、配制乳糖胆盐培养基试制 （注：做15管的话，10ml的要配双料的，如：30g配1000ml，就应称取60g配1000ml，其他1ml、0.1ml的配制成单料的）,配制试剂时不用定容，只需大概体积即可。 2、称取12g乳糖胆盐培养基溶于200ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。（5管10ml） 3、称取6g乳糖胆盐培养基溶于100ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。（10管10ml） 5、所有发酵管盖好盖子，包裹好置于高压锅灭菌15 分钟（第一次曝气开始计时） 6、分别加入5管10ml、5管1ml、5管0.1ml的水样于已冷却至室温的发酵管中，并置于恒温培养箱里培养24小时（温度为44.5℃） 五、结果 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从MPN表中查得相应的MPN指数，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值。
粪大肠菌群的测定（多管发酵法） 一、检测限 二、试剂(均为分析纯) 1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考) 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫） 碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠） 将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花) 2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。 3、EC培养液（1份量） 将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。（>1L烧杯1只） 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。 三、耗材和仪器 1、仪器：高压蒸汽灭菌器、生化培养箱（恒温箱）（25-44℃）、无菌操作台、天平 2耗材：倒置的小玻璃管的试管70套（小试管(12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）；与小试管配套的棉塞或纱布和棉花；药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸（1盒）、、1mL及10mL移液管各2支 三、实验步骤 1、水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管（平行）。 （如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1ml或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中） 2、初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管（含有玻璃倒管的试管）中（取原水样1mL，加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL，
精心整理 检测报告 B&C（2017）字054号 标准名称水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法 标准号HJ/T 347-2007 编制日期2017年9月5日 编制人：校核人： 审核人：签发人：
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一、检测依据及设备 表1 检测方法标准及设备一览表 检测类别检测项目方法名称及编号仪器设备名称及型号仪器设备编号 水质粪大肠菌群水质粪大肠菌群的测定多 管发酵法和滤膜法 HJ/T 347-2007 超净台（） 恒温培养箱（） 水浴锅（） / 二、试剂和材料 （1）检测试剂：同HJ/T 347-2007中多管发酵法“试剂和材料”配制。 （2）检测样品：2009年9月1日取自遗爱湖1L水样。 三、检测步骤 同HJ/T 347-2007中多管发酵法“检测步骤”测定。 四、实验结果 4.1 样品测定 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果数目，从表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。 4.2 实验结果 表2 多管发酵法测定粪大肠菌群的结果 初发酵实验2017年9月1日 至 2017年9月2日 将0.1mL、0.01mL和0.001mL水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的5个10mL 发酵管中。在恒温培养箱中 37℃±0.5℃下培养 24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 接种量0.1mL 0.01mL 0.001mL 阳性试管数量 4 3 3 复发酵实验2017年9月2日 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用 3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC 培养液中。在 44.5℃±0.5℃温度下培养 24h±2h（水浴锅的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在 30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。