第一章植物脂氧合酶的研究进展
缩写
LOX lipoxygenase 脂氧合酶; 9-H(P)OD (10E,12Z)-9-hydro(pero)xy-10,12-octadecadienoic acid
AOS allene oxide synthase 氧化丙二烯合酶; (10E,12Z)-9-(过氧)羟基-10,12-十八碳二烯酸;
AOC allene oxide cyclase 氧化丙二烯环化酶; 9-H(P)OT (10E,12Z,15Z)-9-hydro(pero)xy-10,12,15-octadecatrienoic acid HPL hydroperoxide lyase 过氧化氢裂解酶; (10E,12Z,15Z)-9-(过氧)羟基-10,12,15-十八碳三烯酸;
DES divinyl ether synthase 联乙烯醚合酶; 13-H(P)OD (9Z,11E)-13-hydro(pero)xy-9,11-octadecadienoic acid
POX peroxygenase 过氧酶; (9Z,11E)-13- (过氧)羟基-9,11-十八碳二烯酸;
HPLC high performance liquid chromatography 13-H(P)OT (9Z,11E,15Z)-13-hydro(pero)xy-9,11,15-octadecatrienoic acid 高效液相; (9Z,11E,15Z)-13- (过氧)羟基-9,11,15-十八碳三烯酸;
CP-HPLC chiral-phase HPLC 手性-HPLC 13-HPOT(γ) (6Z,9Z,11E)-13- hydroperoxy-6,9,11- octadecatrienoic acid
RP-HPLC reversed-phase HPLC 反相-HPLC (6Z,9Z,11E)-13-过氧基-6,9,11-十八碳三烯酸;
SP-HPLC straight-phase HPLC 正相-HPLC 9,16-diH(P)OT
LC/MS liquid chromatography mass spectrometry (10E,12Z,14E)-9,16-dihydro(pero)xy-10,12,14-octadecatrienoic acid 液相色谱质谱联用计(10E,12Z,14E)-9,16-二(过氧)羟基-10,12,14-十八碳三烯酸;
GC/MS gas chromatography mass spectrometry 15-HPETE
气相色谱质谱联用计 (5Z,8Z,11Z,13E)-15-hydroperoxy-5,8,11,13-eicosatetraenoic acid
12-oxo-PDA 12-oxo-10,15-phytodienoic acid (5Z,8Z,11Z,13E)-15-过氧基-5,8,11,13-二十碳四烯酸;
12-氧-10,15-植二烯酸; 8,15-diHPETE
12,13(S)-EOD (5Z,9E,11Z,13E)-8,15-dihydroperoxy-5,9,11,13-eicosatetraenoic acid (9Z,13S)-12,13-epoxy-9,11-octadecadienoic acid (5Z,9E,11Z,13E)-8,15-二过氧基-5,9,11,13-二十碳四烯酸.
(9Z,13S)-12,13-环氧-9,11-十八碳二烯酸;
12,13(S)-EOT
(9Z,13S,15Z)-12,13-epoxy-9,11,15-octadecatrienoic acid
(9Z,13S,15Z)-12,13-环氧-9,11,15-十八碳三烯酸;
一前言
脂氧合酶(LOX；EC 1.13.11.12)是含有非血红素离子的双加氧酶，广泛存在于需氧生物中，包括植物、动物和低等水生生物（Hartmut Kühn & Astrid Borchert，2002）。最近发现，在真菌(Bisakowski et al，1997；Su & Oliw，1998)-和细菌(Porta & Rocha-Sosa，2001)中也存在脂氧合酶。根据酶学分类，将LOX 定义为亚油酸根：氧氧化还原酶，它催化含（Z,Z）-1,4戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸的加氧反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物（Alexander Grechkin，1998）。LOX启动合成的一系列环状或脂肪族化合物，统称为氧脂（oxylipins），它们在植物的生长发育过程中以及在植物对环境胁迫反应中起着重要的作用（Helena Porta & Mario Rocha-Sosa，2002），一般将此代谢过程称之谓LOX途
径或十八碳酸途径。
每个LOX蛋白分子含有一个非血红素铁原子(Fe-LOX)。对大豆（soybean）LOX-1的研究发现，只有含三价铁离子（Ⅲ）的LOX有催化活性，化合价由无活性的二价铁离子（Ⅱ）变为有活性的三价铁离子（Ⅲ）的过程是过氧化物依赖的（Alexander Grechkin，1998）。最近发现，一种小麦根的病原真菌（Gaeumannomyces graminis）分泌Mn-LOX。与Fe-LOX相比, Mn-LOX具有以下特征：糖基化的Mn-LOX结合于凝集素；具有广泛的pH值范围；对热稳定；相对于Fe2+而言，Mn2+在化学反应中更加稳定；Mn-LOX可将亚油酸和亚麻酸氧化为两种产物——11S-和13R-过氧基脂肪酸(Su & Oliw，1998)。
在植物中，亚油酸和亚麻酸是LOX最常见的底物（siedow，1991）。氧可加在亚油酸碳氢链的第九位碳原子上，也可加在第十三位碳原子上，因此将植物LOX分为9-LOX和13-LOX（Brash，1999）。后来，又提出了一种更为全面的分类方法，即根据它们的一级结构将其分为两类：?类LOX总序列相似性为～70％，其编码的酶缺少一段叶绿体运输肽。大多数的植物LOX可归为这一类。Ⅱ类LOX 总序列相似性为～40％，一般认为在其N端带有一段叶绿体运输肽。Shibata等（1994)从拟南芥、水稻、小麦、大麦、土豆、番茄和烟草中分离了此种类型LOX 的cDNAs。
植物脂氧合酶是一个多基因家族,存在着同工酶，不同的发育阶段及不同的胁迫作用可诱导相应基因的表达。例如，在土豆中，LOX多基因家族编码9-和13-LOX，根据它们的序列同源性可分为不同的类型(Cornelia G?bel et al ,2002):类型?包括编码块茎和根特异性表达的9-LOX基因(Geerts et al，1994；Casey，1995；Royo et al，1996)，在受病原菌感染的叶片中也检测到了9-LOX基因的转录(Fidantsef & Bostock，1998)；类型Ⅱ和Ⅲ为伤、茉莉酮酸酯和脱落酸诱导的在叶片中特异表达的13-LOX(Royo et al，1996)；另外，有报道从红皮土豆块茎中克隆了5-LOX基因(Xiaoyan Chen et al，1998)。
近年来，由于众多研究群体的努力，我们对LOX和氧脂的作用了解的越来越多。许多植物的LOX基因已被克隆，这为研究它们之间的系统进化关系，阐明基因序列、结构以及位置特异性和活性之间的关系提供了可能。同时，在过去的二十年中，有关LOX途径的生化研究也取得了很大进展。本文将对脂氧合酶基因的
表达调节及其参与的代谢途径作一简单概括。
二植物脂氧合酶基因的表达调控
可以说，LOX基因的表达贯穿于植物生活史的整个过程。一方面，在植物生长发育的各个阶段，包括种子的萌发、块茎的形成、结节的发育、果实的成熟以及植物体的衰老，都存在着相应LOX基因的表达(Helena Porta & Mario Rocha-Sosa ，2002)；另一方面，在自然生长环境中，植物体要面临许多环境胁迫因素，如机械刺激、虫咬、缺水、病原感染、高温或低温、氧胁迫和紫外辐射等都可诱导单个或多个LOX基因的表达（Alexander Grechkin，1998）。其次，外源诱导子，如几丁质、水杨酸、茉莉酸甲酯等也可诱导LOX基因的表达，这些诱导子，多为病原体的组成成分或者是LOX代谢途径的组分。
植物具有感知特异信号的能力，对外界信号的特异识别可引发植物产生“免疫反应”。那么，这种信号是如何“传递”到植物体，又如何诱导特异LOX基因表达的呢？现在已经初步了解，细胞中确实存在一些机制，能将不同的信号传导分子有机的组织起来，使之参与不同的刺激反应。这些机制一方面将信号分子限定在特定的胞质区域以形成特定的信号网络来有效、精确的对刺激作出反应；另一方面靠各个信号在转导途径中的相互衔接，发生级联反应的信号分子之间的相互作用来特异激活下游的转录因子，进而调控特异基因的表达(孙大业等，2001)。
下面以病原体诱发的植物防御反应为例，来说明植物是如何识别外界信号并保持信号转导途径的特异性的。对于高等植物而言，病原包括真菌、细菌和病毒。当病原侵染宿主植物体时会分泌一些水解酶来消化植物细胞壁，这样病原菌就可以进入植物组织中，从而引发植物细胞的防御反应(Salmond，1994；Walton，1994)。这些降解细胞的酶和来源于宿主或病原菌的细胞壁成分也可诱发抗病基因的表达，抵抗病原的侵袭(Davis & Hahlbrock，1987)。病原菌诱导的特异的防御反应，可用基因对基因假说进行解释(Flor，1971)。一般认为是宿主植物的R 基因（resistance gene）编码的受体与病原体对应的avr基因（avirulcent gene）直接或间接编码的配体作用的结果(孙大业等，2001)。植物识别病毒、细菌病原体和真菌病原体存在基本机制上的不同：病毒通过植物伤口侵入，并通过胞间连丝运输有毒组分；细菌通过第三种类型的分泌途径把avr产物直接运输到植物细胞内，并同胞内R基因产物作用；而真菌avr基因编码的激发子却是和宿主细胞
表面的受体样结构相互作用，再引起胞内的信号转导，诱发防御反应(Baker,1997)。
同时，植物脂氧合酶基因的表达也受到发育信号的调节。特异的LOX基因在大麦、黄瓜和大豆种子萌发的早期阶段被诱导（Alexander Grechkin，1998）。在豆类植物的结节中，也有关于LOX蛋白和mRNA的报道。在P. Vulgaris结节中，主要在生长阶段检测到LOX的 mRNA和蛋白质，而当结节达到最大后，mRNA和蛋白水平降低。在结节的软组织及中央组织的未感染细胞中发现了LOX抗原，推测这种方式的积累可能同结节的发育有关（Porta et al.,1999）。在番茄中存在与果实成熟相关的三种LOX mRNA，对应于核基因编码的TomloxA，TomloxB，TomloxC。在果实成熟过程中，这些基因受不同的调节，它们的表达受乙烯及一些未知的发育因子的影响（Griffiths et al.,1999）。
脂氧合酶基因的表达属于信号转导途径中的早期事件，能对外界以及胞内信号迅速作出反应。在番茄叶片中，伤诱导的LOX mRNA 在0.5小时可以检测到，在诱导后2-4小时达到最大，然后开始降低(Clarence，2000)。
三 LOX途径的初级代谢
一直以来,都认为脂质的过氧化作用是一个有害的过程,可破坏生物膜的结构,导致细胞功能紊乱。事实上,脂质的氧化对生物体来说,具有双重的影响。一方面,由于过氧基的存在,扰乱了疏水性脂质之间以及脂质与蛋白质之间的相互作用,导致生物膜和脂蛋白结构的改变；同时过氧基脂容易产生自由基,可诱导对其它生物膜和脂蛋白的修饰。当生物膜的脂双层被氧化,就丧失了它的屏障作用,使得亚细胞结构甚至整个细胞处于一种危险的状态。另一方面当脂质的氧化在一定的调控作用下行,并且被限制在特定的细胞空间,那么它可能对细胞甚至整个生物体产生有利的影响。例如脂质的氧化可促进类二十烷酸的合成,同时它参与了细胞的分化、成熟以及脂质的动员（Hartmut Kühn & Astrid Borchert，2002）。下面将从以下三个方面详细介绍脂氧合酶参与的脂代谢反应。
（一）自由多烯脂肪酸的氧化
植物LOX可将自由多不饱和脂肪酸氧化成不饱和脂肪酸的过氧化物。一般认为是在脂酶的作用下，水解膜脂和贮存脂中的三酰甘油，释放出自由脂肪酸作为
LOX的底物。LOX的催化主要包括三个步骤：⑴具立体专一性的脱氢过程，即对两个双键之间的亚甲基进行脱氢；⑵异丙烯基重排；⑶氧结合到2（E），4（Z）－戊二烯基上。第一步被认为是LOX反应的限速步骤。几乎所有植物的LOX都作用于亚油酸和亚麻酸的前手性中心C-11，形成的双-烯丙位基经过（n+2）或（n －2）异构化变成丙烯基，异构化过程依赖于LOX的特异性。大多数报道的LOX 表现出很强的位置特异性，专一性的将亚油酸和亚麻酸转化为13－或9－过氧化物（Alexander Grechkin，1998）。总的来说，绿色植物主要具有13－LOX活性，合成(S)－过氧化物作为主要的差向异构体。
LOX作用的位置特异性随pH和氧浓度的改变而改变。在pH 6.0,大豆LOX－1氧化亚油酸产生12％的9(S)-HPOD,但在pH 9.0时，只产生13(S)-HPOD(Gardner，1989)。由此，可得出以下结论：⑴ 9(S)-过氧化物由未解离的羧酸形成；⑵羧酸形式的底物可从任何一个方向进入活性部位，但是羧酸根阴离子仅在甲基端被识别。目前研究表明：在低氧浓度下大豆LOX丧失了位置特异性，产生相等量的9(S)-HPOD和13(S)-HPOD混合物，而在正常情况下，产生95％的13(S)-HPOD(Berry，1998)。
（二）LOX介导的膜脂及贮存脂的氧化
越来越多的实验数据表明：LOX具有氧化生物膜的能力，包括不同的细胞内膜和质膜。大豆的LOX-2在氧化膜脂中的脂酰基时比氧化非膜脂肪酸表现出更强的位置特异性。据此推测大豆LOX-2可能在体内膜重建过程中起着重要的作用(Maccarrone et al,1994)。
LOX同时参与了种子萌发过程中贮存脂的动员。各种植物种子的贮存脂中存在着酯化形式的脂肪酸氧化产物(Smith,1979；Gunstone et al,1986)。而且，LOX对贮存脂的氧化作用在种子萌发的早期被启动(Feussner & Kindl,1992)。在各种油料种子的幼苗（如黄瓜幼苗）的脂质体磷脂单层中，可检测到一种亚油酸盐特异的13-LOX(Feussner et al,1996)，可氧化亚油酸酯，而不需要脂酶的提前作用(Feussner et al,1997a)。在萌发的早期阶段，这种反应导致贮存脂中过氧化物含量的大幅度增加。氧化的脂肪酸主要含有(13S,9Z,11E)-13-(过氧)羟基-9,11-十八烷二烯酸[(13S)-H(P)OD]，这个化合物从脂质体上释放后进入
β-氧化。因此推测贮存脂的动员是由特异的13-LOX而不是由脂酶起始的(Feussner et al,1995)。因此一种新的贮存脂降解机制被提出(Feussner et al,1997b)，在这种新的模式中，LOX催化的贮存脂的氧化先于三酰甘油的水解。脂质体膜裂解后，13-LOX将贮存的甘油三酸酯氧化成相应的过氧基衍生物，然后在脂酶的作用下形成自由过氧基多烯脂肪酸，随即被还原为羟基化合物。
脂质体中这种特异的13-LOX的分子量（～100kD）高于?类LOX，可将甘油三亚油酸酯氧化为单--、双--或三--氧化的三酰甘油衍生物。萌发的含油种子中的这种新的脂质代谢方式表明13-LOX具有特殊的生理作用，这种酶似乎用来“标记”贮存脂，使得它们更容易被特异的三酰甘油脂酶降解。植物可通过这种方式区分在幼苗发育过程中脂质的稳定转化和萌发过程中成熟脂质的降解。
（三）厌氧性的脂氧合酶反应
在缺氧的条件下，LOX产生一系列自由基转化物，而不是产生正常条件下的过氧化物。这些产物，即脂肪酸二聚体、氧二烯、环氧乙醇，是由脂肪酸自由基或烷氧自由基形成的(Vick,1993；Gardner,1991)。一些LOX在有氧的条件下也产生这些化合物，例如，土豆块茎LOX产生9,10-环氧-11-羟基-12,15-十八碳二烯酸和9,10-环氧-11-羟基-12-十八碳单烯酸(Galliard et al,1975；Grechkin et al,1995)。
四脂肪酸过氧化物的代谢
LOX反应产生的脂肪酸过氧化物在酶的作用下通过至少6条途径转化成不同的化合物,统称为氧脂（oxylipins），植物oxylipins对生物体来说,不只是产生负面的影响,许多实验数据表明,它们是有效的生物调节剂,在信号转导、植物的生长发育、衰老、器官的形成、体内平衡的保持等方面都具有重要的作用。参与代谢的酶包括过氧化氢裂解酶、氧化丙二烯合酶、联乙烯醚合酶、过氧酶以及还原酶等等。这里主要介绍脂肪酸过氧化物的三条主要代谢途径、代谢产物的生理作用及代谢途径的组织器官特异性。
(一) 三条主要代谢途径
1．过氧化氢裂解酶(hydroperoxide lyase, HPL)途径
过氧化氢裂解酶是植物脂肪酸过氧化物代谢中最重要的一个酶，它在植物中的含量非常丰富。它催化过氧基脂肪酸链在过氧化物碳原子和相邻的双键次甲基间断裂。通过这种方式，13－过氧化物被转化成六碳醛和十二碳酮脂酸；9－羟基过氧化物被转化成九碳醛和九碳酮脂酸。
Crombie等(1991)提出了该酶的作用机制,包含了环氧烯丙基碳正离子中间体，包括以下三步:⑴过氧化物的质子化-脱水作用,生成环氧烯丙基碳正离子中间体；⑵环氧烯丙基碳正离子经重排生成水合氢离子；⑶水合氢离子经羟基化,形成半缩醛；⑷半缩醛中间体降解成两个醛片段。
2．氧化丙二烯合酶(allene oxide synthase, AOS)途径
氧化丙二烯合酶将脂肪酸过氧化物转化为不稳定的丙二烯氧化物，在无酶的条件下，形成12-氧-植二烯酸的外消旋衍生物或水解形成α-和γ-酮。在氧化丙二烯环化酶（allene oxide cyclase，AOC）的作用下，生成(9S,13S)-12-氧-植二烯酸(Ziegler et al,2000)。
纯化的亚麻种子AOS产生丙二烯氧化物的同时,产生环氧乙醇。为了解释这种现象,Song等提出了AOS催化形成环氧乙醇的裂解机制,包括三个步骤:⑴氢过氧化物O-O键的同裂作用；⑵生成的烷氧自由基重排为环氧烯丙自由基；⑶羟自由基结合到环氧烯丙自由基上。作者推测,在AOS活性中心, 环氧烯丙自由基经过一次电子氧化生成环氧烯丙基正离子,然后脱质子生成丙二烯氧化物(Song et al ,1993)。
3．联乙烯醚合酶(divinyl ether synthase, DES)途径
联乙烯醚合酶将脂肪酸过氧化物转化为具有细胞毒性的联乙烯醚(Weber, et al, 1999)。联乙烯醚与一般的oxylipins不同,在它的碳氢链上具有醚氧。Crombie等(1991)提出了联乙烯醚的合成机制,包含了一个环氧烯丙碳正离子中间体。包括以下两个步骤:⑴ 9(S)-HPOD经质子化-脱水作用,生成环氧烯丙基碳
位脱质子,并且伴正离子中间体；⑵在酶的作用下, 环氧烯丙基碳正离子的C
14
随着环氧乙烷C-C键的断裂,生成colneleic acid。
除了上述三条主要代谢途径外，还存在着其它的过氧化物的代谢途径。第一条途径是过氧酶(peroxygenase, POX)途径,分子内发生氧转移，将脂肪酸的过氧
化物转化为环氧-或过氧基多不饱和脂肪酸(Blee,1998; Hamberg,1995)。第二条是环氧乙醇合酶(epoxy alcohol synthase, EAS)途径(Hamberg,1999)。在EAS的催化下，脂肪酸过氧化物经分子内重排形成多羟基脂肪酸。最后一条是还原酶途径。在还原酶作用下生成羟基脂肪酸(Feussner et al,2002)。
(二) 代谢途径的组织器官特异性
在不同的植物组织中,有着其特异的LOX代谢途径,主要由两个方面决定:1、存在于植物组织中的LOX的位置特异性；2、参与脂肪酸过氧化物代谢的酶。从表一（Alexander Grechkin，1998）中可以看出:LOX代谢在叶片和非绿色组织中存在明显的差异。例如,在玉米和小麦叶片及种子中有着明显不同的LOX代谢途径。在豌豆的幼叶中,其产物具有很大的多样性,但随着年龄的增长而简化(Grechkin & Tarchevsky,1988)。大多数的植物叶片具有13-LOX活性，也存在着
表一 LOX途径中的酶在一些高等植物器官中的分布
Table 1 Distribution of LOX pathway enzymes between organs of some higher plant species
(other than LOX)
Seed Leaf 9
13
AOS
HPL
Seed Leaf 9
13
AOS and AOC
AOS and AOC
Seed Leaf 9
9 and 13
No detected
AOS
Bulb Leaf 9
9
AOS and AOC
AOC
Cotyledons Root
leaf 13
9
13
AOS
DES and AOS
AOS
例外,如小麦叶片同时具有9-LOX和13-LOX活性，郁金香叶片,主要具有9-LOX 活性,这是到目前为止,已知的两个例外。
LOX代谢途径的方向可随着植物的生长发育而改变。例如,LOX参与种子的萌发和果实的成熟过程,特异的LOX同工酶基因在萌发的种子和成熟的果实中表达。在不同的组织和器官中具有不同方向的LOX代谢途径,表明每一种路径有着
其自身的生理作用。例如,一直以来,都认为AOS途径的唯一作用就是合成茉莉酮酸酯,但是,从表一（Alexander Grechkin，1998）中我们可以看到:在一些组织中存在AOS活性,如玉米种子和郁金香鳞茎,而这些组织中的LOX只具有9-LOX 活性,而不具有13-LOX活性,在这些组织中,通过LOX途径合成的oxylipins主要是酮。这个例子以及LOX途径的总体多样性表明许多oxylipins的生理作用还有待于被揭示。
五脂氧合酶初产物的色谱分析
脂肪酸过氧化物是脂氧合酶作用的初产物，它们是高反应活性的分子，能被迅速转化为具有生理活性的物质，即oxylipins。如上所述，在植物中，这些过氧化物在一系列酶的作用下，生成多样的具生物学功能的产物。尽管大多数的植物和动物的LOX催化生成的过氧化物具有S绝对构型，但是R构型的产物也是普遍存在的，尤其是在水生无脊椎动物和植物中(Gerwick,1994)。
LOX产物结构的阐明对于确立该酶的生理作用具有重要的意义。因为产生的过氧化物的生理活性与它们的位置特异性和立体选择性有关。例如，有一段序列参与了海星卵母细胞发育为成熟的卵，其转化过程是由8R-HETE起始的，它的对映体8S-HETE就没有这种活性(Meijers,1986)。
在七十年代早期，就已经提出了各种检测LOX产物位置特异性的方法。这里主要讨论利用层析方法(RP-,SP-,CP-HPLC,LC/MS和GC/MS)分析LOX初产物的位置特异性和立体专一性。
（一） HPLC
在分析LOX产物中，高效液相(HPLC)是最常用的一种技术，包括反相（RP-HPLC）和正相（SP-HPLC）。这种技术的普适性部分归功于大多数的LOX 产物带有生色团，不需要经过衍生化就可通过光度测定法(包括光电二极管矩阵检测器)直接检测（Borgeat et al,1990）。RP-HPLC主要用于分离HPETEs和HETEs，SP-HPLC主要用于分析HPODs和HPOTs，对于用RP-HPLC不能分离的化合物，可用SP-HPLC做进一步的分离(Manuela Pérez Gilabert & Francisco Garc′ya Carmona, 2002)。
（二）LC/MS
HPLC和质谱仪的联用为分离和分析完整LOX产物提供了新的可能。这些化合物通常是热不稳定、不挥发的，必须在温和的条件下将其转化为气相才能进行分析，而且，这些不稳定的分子需要在一定的条件下进行离子化，以防止大量内能的聚集，离子片断化和分子质量信息的丢失。几种LC/MS界面如热喷射（TSP），快原子轰击（FAB），电喷射（ES）以及气压流化学电离（APCI）已经用于分析LOX产物(Manuela Pérez Gilabert & Francisco Garc′ya Carmona, 2002)。其中，ES离子化串联质谱联用计是报道最多的一种分析LOX产物的仪器，但是很多实验室还不能提供这种设备。
（三）GC/MS
气相色谱和质谱仪的联用在阐明LOX产物的结构方面起着重要的作用。现代分析型的气相色谱通常在一个长的毛细管中进行，柱子的内壁覆盖一层不挥发的液体，在分析不同的LOX产物时选用不同的柱子。许多化合物所具备的挥发性不足以使其在室温蒸发，因此大多数的气相色谱在高温下进行。但是，过氧化物通常热不稳定，这就限制了GC/MS的使用（Terao & Matsushita,1975）。为了避免这个问题，通常将过氧化物还原为相应的羟基类似物，再用于GC/MS分析。还原后产生的羟酸转化为挥发性的醚或酯衍生物。GC/MS包括阴离子电子俘获(CI)- GC/MS和电子碰撞(EI)- GC/MS。
CI- GC/MS是一种很灵敏的确定分子量的方法，用于分析脂肪酸过氧化物醚酯衍生物的分子量(Min et al,1980;Blair,1990)。但是这种方法不能鉴别出羟基脂肪酸位置异构体。EI- GC/MS虽然灵敏性不及CI- GC/MS，但是能产生结构特异的离子碎片，因此通常用于确定羟基取代基的位置(Johnstone & Rose,1996; Murphy et al,1994)。
六脂氧合酶研究现状与展望
自从1932年首次在大豆(soybean)中发现脂氧合酶以来，对脂氧合酶的研究已有七十多年的历史,取得了很大的成绩。到目前为止，至少有35种植物的LOX 基因被分离鉴定，有三种生物的LOX（大豆的LOX-1,LOX-3，兔网织红血球
LOX-1）晶体结构被弄清(Daisuke Shibata et al, 1987)。同时，许多分子生物学及分子遗传学方法的运用，如利用基因沉默、基因删除等手段开展转基因植物的研究，同时结合化学方法对LOX产物进行分析，大大推动了LOX途径及代谢产物生理作用的研究。现在我们对LOX途径，特别是JA信号途径已有了较清楚的认识，一些oxylipins生物合成途径、合成机制以及生理作用也得到了阐明。
同时，我们也应该注意到，由于对JA的研究几乎集中了所有研究LOX途径生物重要性的学者的注意力。对植物氧脂（oxylipins）的认识，除茉莉酸外，还知之甚少（Alexander Grechkin，1998）。毫无疑问, 茉莉酮酸酯是重要的生物调节剂,但是,它们不能代表目前已知的所有的植物LOX途径的产物。同时由于LOX是一个多基因家族，存在同工酶，这就为研究各种LOX具体的生理作用、作用机理及在信号途径中扮演的角色增添了难度。量变引起质变，相信随着对LOX越来越广泛和深入的研究，这些问题最终会得到阐明。当然，我们的最终目的是希望通过遗传工程获得抗病、抗虫及抗逆植株，更好的为工农业生产服务。
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ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８—９６３２，２００９．０４．０５４ 赖草属植物的抗逆性研究进展与应用前景 叶煜辉，江明锋，陈艳，杨满业 （西南民族大学生命科学与技术学院四川省草原研究院，成都６１００４１） 摘要：赖草属是多年生禾本科植物，在中国的分布地域较为广泛。该属内植物对逆境具有较强的抗性，尤其是对于干旱、盐碱、高寒和病虫害等有较强的抵抗能力。综述了近年来赖草属植物抗逆性方面的研究进展，从赖草的耐旱性、耐盐性、耐寒性以及抗病虫害等方面对赖草属植物的抗逆性机理进行了探讨，并对其未来应用做出了展望。 关键字：赖草属；抗逆性；耐受机制；生理变化 中图分类号：Ｑ９４５．７文献标识码：Ａ文章编号：１００８—９６３２（２００９）０４—００５４—０４ 赖草属（ｋ”ｚ瑚Ｈｏｃｈｓｔ）在中国又称滨麦属，是禾本科早熟禾亚科（Ｐｏｏｉｄｅａｅ）小麦族（ＴｒｉｔＤｕｍｏｒｔ，也称大麦族Ｈｏｒｄｅａｅ）大麦亚族（Ｈｏｒｄｅｉｎａｅ）中的多年生植物类群，全世界约有３０余种，分布于北半球温寒地带，多数产于亚洲中部，少数分布于欧洲和北美。中国区域有赖草属植物约２０种，２变种，划分为３个组，即多穗组、少穗组和单穗组，主要分布于新疆、甘肃、宁夏、内蒙、东北三省、四川、陕西、河北、山西。１。。它们的生境极其多样，在海拔５００～４７００米的范围均有分布。从湿润的盐碱滩地和海滨滩地到干旱高温的沙土草原、荒漠化草原皆有生长，具有广泛的适应性和较高的抗逆性。 禾本科抗逆品种选育是一项世界性的重大课题，也是急迫解决的难题。赖草作为禾本科小麦等农作物的近缘属种具有无性繁殖能力强、品质优良、营养丰富等特点，而且还具有抗旱、抗寒、抗病虫害、适应性强等优良特性。在研究其耐受性状和耐受性的生理生化机制的基础上，克隆赖草抗逆基因并进行功能鉴定，通过转基因把克隆到的抗逆基因直接导入其他植物，可以解决传统杂交方式存在的花期不遇、杂交不亲和、周期长等问题。通过对赖草属植物抗旱机制的研究，还可以加快抗逆新品种的开发，对提高干旱和半干旱地区的植被盖度、提高农作物产量、改良退化及沙化草地、改善西部生态环境、促进干旱地区草地畜牧业的发展具有重要意义。 １抗逆性研究进展 １．１耐旱性分析 ５４１．１．１植物抗旱性研究的主要指标植物适应干旱环境的方式是多种多样的，有的以不同方式减少蒸腾失水，有的以特化组织大量贮存水分，有的以降低叶水势增强其吸水能力，有的以大量累积脯氨酸等有机质进行渗透调节，有的细胞液浓度大，有的原生质粘滞度高等。由于耐旱机制的复杂性和植物对干旱适应的多样性，要寻找一个通用的耐旱性指标是不现实的。现在中国对植物抗旱指标的选择和研究方法主要采用以下几种：（１）叶片旱生结构；（２）水分生理；（３）苗木生长；（４）叶绿素含量；（５）脯氨酸。易津等人对赖草属牧草幼苗耐旱性进行了研究。２。，采用不连续干旱胁迫处理３个月后，对幼苗存活率（％）、苗高（ｃｍ）、苗鲜重（ｇ）、根冠比、茎叶干鲜数量比、叶绿素含量和过氧化物酶活性测定，结果发现赖草属内羊草（Ｌｅｙｍｕｓｃｈｉｎｅｎ—ｓｉｓ）、赖草（Ｌｅｙｍｕｓｄａｓｙｔａｃｈｙｓ，内蒙古）和毛穗赖草（Ｌｅｙｍｕｓｐａｂｏａｎｕｓ）与属内其它植物相比为耐旱性较强的物种。 １．１．２赖草属的抗旱生理赖草属植物在干旱胁迫下发生许多生理变化，如：光合作用减弱，细胞膜透性平衡被破坏，丙二醛（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｃｈｅｈｙｃｈｅ，ＭＤＡ）含量增加，超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性增加等。 １．１．２．１干旱胁迫下光合作用减弱干旱胁迫对光合作用的影响比较复杂，不仅会使光合速率降低，而且还会抑制光合作用反应中原初光能转换、电子传递、光合磷酸化和光合作用暗反应进程，最终导致光合作用下降。干旱胁迫时，叶表面气孔关闭，阻止ＣＯ，扩散， 收发日期：２００８—０９—０１；修回日期：２００８—１０—２０ 作者简介：叶煜辉（１９８２一），男，汉族，硕士，主要从事分子生物学与基因工程方向研究，Ｅ－ｍａｉｌ：２５５２３９３ｙｙｈ＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者：江明锋（１９７１一），男，羌族，博士，副教授，主研分子生物学与基因工程，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｍｉｎｇｆｅｎｇｊｉａｎｇｖｉｐ＠ｓｉｎａ．ＣＯＩｌｌ。项目基金：四川省科技厅应用基础研究项目（项目编号：２００６Ｊ１３—１３４） 万方数据
大豆脂肪氧合酶对食品品质的的影响 卜凡琼 (班级：食研5班学号：2016309120048) 摘要:大豆脂肪氧合酶是存在于大豆中的脂肪氧合酶，其活性很高，在食品行业中有很广泛的应用，大豆脂肪氧合酶催化底物产生的一些物质能很好的改善食品质量。能增加食品香气，形成二硫键，增强面筋蛋白强度。其分离纯化方法有水浸提法，酸铵沉淀、葡聚糖凝胶柱G200分离沉淀法，缓冲液提取等方法。 关键词：大豆脂肪氧合酶，分离纯化，食品品质 1. 大豆脂肪氧合酶简介 脂肪氧合酶(Lipoxygenase, EC1.13.11.12, LOX),广泛存在于动植物体内，在豆类中具有较高的活力，其中尤以大豆中的活力为最高⑴ 属氧化还原酶，通称脂氧酶(LOX) o LOX中含有非血红素铁，专一催化具有顺，顺-1, 4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，通过对其分子加氧，形成过氧化氢衍生物，是非常重要的风味前体物［2］。近年来研究表明，LOX产生的风味和香味是很多食品所必需的不饱和脂肪酸，经LOX作用形成氢过氧化物并进一步裂解成不饱和的醛类、酮类和醇类化合物而形成类似苹果、香瓜、芒果等水果风味以及鲜鱼味、牡砺味、文蛤味和海藻香、青草香［3］等挥发性风味物质。据脂肪氧合酶氧化花生四烯酸位置特异性，将脂肪氧合酶(LOX)分为5-L OX ,8-LOX ,12-LOX 和15-LOX。大豆LOX -I 属于15-LOX ,它已被广泛用于研究同类脂肪氧合酶功能和结构性质模型⑷大豆植物组
织中含有多种脂肪氧合酶同工酶，其中LOX-I和L0X-2是主要的同工酶。 2. 大豆脂肪氧合酶结构及其生化特性 研究表明，大豆脂肪氧合酶（LOX ）含839个氨基酸，是一个单 链肤蛋白，整体结构分为2个部分:一个是N末端的B与1条a螺旋组成的部分；另一个是包含22条a螺旋和8条B折叠股的主要区域。在空间结构上，LOX的主要区域以一条长的a螺旋为中心，其他结构环绕在其周围。非血红素铁原子靠近酶中心位置，其附近有一个特殊的三圈n螺旋，并以配位键与3个组氨酸侧链和梭基末端的C00- 结合，从而形成酶活力中心的主要组成部分⑸。 通过对分离得到的大豆子叶LOX的研究，发现每个LOX是一条M:为96000左右的多肤，每个多肤中含一个铁原子。有实验证明，大豆子叶的LOX处于静止、无活性状态时，铁以Fe态存在;当加入底物后，LOX中的Fe处于Fe （A）态，使LOX具有催化活性。大豆种子中的LOX都是球形、水溶性蛋白。LOX i, LOX2, LOX3的等电点分别为5.65, 5.85,6.150 3种同工酶的生化特性是丄0X1的反应最适pH值在9.0处，LOX:在pH6. 5处，LOX:在pH7. 0处。除催化原初反应外，LOX还催化次级反应而形成脂肪酸的二聚苯和淡基二烯酸，类胡萝卜素的漂白即是由LOX次级反应实现的⑹。 3. 大豆脂肪氧合酶的分离纯化及其性质 王辉，周培根⑺以大豆为原料，经硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶柱 G200分离沉淀，得到2种脂肪氧合酶（LOX）: LOX-1 , LOX-2。对
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2012年 第37卷 第4期 食品开发· 40 ·脂肪氧合酶是一种加双氧酶[1]，广泛存在于需氧的机体中，包括植物[2-3]。它是一种在植物和动物界都有广泛研究的酶[3-4]，含非血红素铁的蛋白质，能专一催化氧化具有顺，顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸[5]，生成具有共轭双键的多元不饱和脂肪酸的氢过氧化物[6]。近年来研究表明，LOX产生的风味和香味是很多食品所必需的不饱和脂肪酸，经LOX作用形成氢过氧化物并进一步裂解成不饱和的醛类、酮类和醇类化合物而形成 类似苹果、香瓜、芒果等水果风味以及鲜鱼味、牡蛎味、文蛤味和海藻香、青草香[7]等挥发性风味物质。茶树叶片中，LOX位于叶绿体的片层结构中，它能将不饱和脂肪酸氧化为不饱和脂肪酸过氧化物。茶叶的加工过程是塑造茶叶优良品质的关键，在此过程中，鲜叶中的多种酶类作用于鲜收稿日期：2011-08-01 *通讯作者 基金项目：十二五农村领域国家科技计划项目(2011BAD01B02)；苏州市科技支撑计划项目(农业部分)(SN201033)。作者简介：马惠民(1953—)，男，高级农艺师。 叶内含物，对绿茶的香气、滋味、汤色、外形等品质均可产生重要的影响。在制茶过程中，人们通过控制茶鲜叶中酶的活性和催化方向的变化，制造出不同种类的茶叶。例如在绿茶制造过程中可较早钝化酶的活性，以形成绿茶“清汤绿叶”的品质特征。这些主要是利用和控制茶叶中的各种内源酶的作用来形成各类茶叶特有的品质特征。 1 LOX的催化机理 1.1 LOX的活性中心结构LOX的来源不同，其氨基酸的组成不同。虽 然植物脂肪氧合酶的氨基酸残基数目和动物脂肪氧合酶的有所不同，但它们的氨基酸序列在某些区域内有很大的相似性，因而其催化反应的机理基本相同。 马惠民，王 雪，钱 和*，汪何雅 (江南大学食品学院，无锡 214122) 摘要：综合叙述了脂肪氧合酶及其在茶叶加工过程中的作用，并据此展望了酶在茶叶加工工艺中的发展前景。 关键词：茶叶；脂肪氧合酶；茶叶加工 中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码： A 文章编号：1005-9989(2012)04-0040-04 The effection of lipoxygenase in the tea MA Hui-min, WANG Xue, QIAN He *, WANG He-ya (School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)Abstract: This article describes that the function of the lipoxygenase in the tea during the tea processing, and according to it, the prospects of lipoxygenase in the tea manufacture were stated.Key words: tea; lipoxygenase; tea processing 脂肪氧合酶在茶叶中的作用
期末考核 课程：Glycobiology 植物糖基转移酶研究进展 ：*** 学号：*** 班级：*** 时间：****
植物糖基转移酶研究进展 摘要:糖基转移酶一类是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶，在生物体中普遍存在并形成了超基因家族。糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程。本文综述了近年来的研究报道，综述了糖基转移酶的分类、分离鉴定方法及在生物学功能方面的研究进展，期望为相关研究工作提供参考。 关键词:植物糖基转移酶，分类，分离鉴定，生物学功能 糖基转移酶（Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y）是一类催化糖基转移的酶，通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移至特异的受体上。糖基转移酶几乎存在于所有的生物体中，其所催化的糖基化反应是最重要的生物学反应之一，直接参与二糖、单糖苷、聚糖苷等的生物合成。糖基供体分子包括双糖、多糖、1-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，植物中最常见的供体为UDP-Glc。受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸。糖基转移酶催化供体-受体形成α、β两种糖苷键，产物为多糖、糖蛋白、糖脂以及糖苷化合物等。全基因组测序发现真核生物中约1%的基因编码糖基转酶。 1糖基转移酶的分类 目前，对糖基转移酶的分类主要根据Campbell等提出的GT Family 分类系统（数据收录在CAZy数据库中）。糖基转移酶作为高度分歧的多源基因家族，根据蛋白氨基酸序列的一致性、催化特性以及保守序列对其进行分类。因此，一特定的糖基转移酶既可以通过生物化学的方法鉴定其底物，也可以通过生物信息学方法研究其与已知酶基因或酶蛋白氨基酸序列的同源性对其进行分类。目前，依据这种分类方法，糖基转移酶被分为94个家族。根据其的折叠方式可将绝大多数酶分为两个超家族，GT-A超家族和GT-B超家族（图1）。根据催化反应机制、产物的立体化学异构性，在这两个超家族中糖基转移酶又分为反向型和保留型两大类（图2）。 GT-A型折叠的空间结构有两个紧密相连的β/α/β类Rossmann折叠区域。GT-A家族成员需要一个D-X-D基序用来结合二价金金属离子（多为Mn2+），这有助于UDP-糖供体的PPi在酶活性位点上的固定，对于催化反应是不可或缺的。GT-A难以识别UDP-糖供体以外的供体，所以受体的多样性较低。GT-B型折叠的空间含有两个正对的β/α/β类Rossmann折叠区域，连接方式灵活。GT-B成员无需二价金属离子维持活性，这是GT-B与GT-A家族成员的一个显著区别。此外，通过结构分析和PSI-BLAST发现了由跨膜GT组成GT-C超家族，其折叠方式全为反向型，活性位点位于长环部，一般含有8-13个跨膜螺旋。
货号：MS1108 规格：100管/96样脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）活性试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。 测定原理： FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。 自备实验用品及仪器： 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解冻后混匀。 试剂二：粉剂×1瓶。临用前加入440μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入440μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：液体20mL×1瓶, 4℃保存。 试剂五：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入840μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心40min，取上清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心40min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 FAS测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min。 3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A1-A2。 FAS活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按照蛋白浓度计算 第1页，共2页
高等植物中维生素C合成及其相关酶研究进展1 尚增振，马锋旺*，李威 西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌（712100） E-mail：fwm64@https://www.doczj.com/doc/b7174865.html, 摘要：维生素C即抗坏血酸（AsA），是一种重要的抗氧化物质，在植物和动物的代谢方面发挥着重要作用。自1998年拟南芥AsA缺乏突变体VTC1的鉴定和L-半乳糖途径的提出，高等植物中AsA代谢研究发展较快。合成相关新基因的鉴定与克隆，检测到其他的合成途径，表达动物AsA合成基因后，不可预知的生物表型观察等表明植物AsA合成的复杂性。本文根据相关文献对植物中维生素C的合成途径和相关酶基因的研究进行了综述。 关键词：高等植物，维生素C，生物合成途径，合成相关酶 维生素C（Vc）,又称抗坏血酸（ascorbic acid, AsA），是普遍存在于植物组织中的高丰度小分子抗氧化物质。某些动物如人类由于缺乏其合成关键酶L-古洛糖内酯氧化酶不能自身合成维生素C，并且其在人体内不能长久贮存，只能不断从食物中获取AsA，而作为主要Vc 来源的水果和蔬菜其AsA水平差异较大。因此AsA 含量已成为衡量农产品品质的重要指标。此外，植物中的AsA 还在抗氧化和清除自由基、光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及参与某些次生代谢物和乙烯的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。同时有关AsA生物合成和调控的研究也取得重要进展。本文综述了近来年人们在AsA生物合成及其相关酶方面的研究进展。 1．植物AsA合成途径 1.1 与动物合成途径类似的古洛糖途径 Isherwood 等[2]最早提出的类似于动物合成途径的高等植物AsA生物合成途径，该途径认为植物由D-半乳糖经D-半乳糖醛酸和L-半乳糖内酯(L-GalL)等重要中间物质最终形成AsA，其间发生了类似动物的碳链倒位。支持该途径的证据为在植物体内确实存在天然 L-GalL并可通过半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)氧化生成AsA，同时D-半乳糖醛酸(甲酯)也可作为AsA合成的底物。但随后的同位素放射性示踪证明植物合成AsA的过程并未发生碳链的倒位[3]。虽然有证据显示L-GalL是植物合成AsA的底物，但D-半乳糖醛酸并不是植物合成AsA 的主要物质[10,12]。 1.2 邻酮醛糖途径 为符合同位素放射性示踪实验结果，Loewus等[28]提出的一条非倒位途径即临酮醛糖途径。在该途径中D-葡萄糖首先在C-2位上被氧化生成D-葡萄糖醛酮然后在C-5位经表异构酶催化形成L-山梨糖醛酮，并进一步在山梨糖醛酮脱氢酶作用下被氧化为AsA。此途径虽然没有碳骨架的倒位，但至今还没有明确的实验证据支持这一途径[29]。因为尚未发现催化前两步反应的酶。Conklin 等[30]对拟南芥AsA缺乏的突变体vtc1的研究表明增加D-葡萄糖醛酮和L-山梨糖醛酮并不能导致AsA的积累。L-山梨糖醛酮也未能明显增加拟南芥悬浮细胞内源AsA含量. Saito et al 利用14C标记实验发现，前体培养的24h后，D-(14C)-葡糖醛酮有4.1%的转化成AsA；D-(14C)-葡萄糖有0.6 %转化成AsA，而且没标记的D-葡糖醛酮抑制了D-(14C)- 1本课题得到西北农林科技大学“拔尖人才支持计划”和西北农林科技大学国家生命科学与技术人才培养基地科技创新基金的资助。
生物工程学报Chin J Biotech2009, January 25; 25(1): 1-9 https://www.doczj.com/doc/b7174865.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.doczj.com/doc/b7174865.html,? 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 植物脂肪氧化酶的研究进展 胡廷章1,2, 胡宗利1, 屈霄霄1, 任彦荣1, 陈国平1 1 重庆大学生物工程学院, 重庆 400044 2 重庆三峡学院生物系, 重庆 404000 摘要:植物脂肪氧化酶(LOX)是一个多基因家族, 是由单一的多肽链组成的含有非血红素铁、不含硫的过氧化物酶。 LOX催化具有顺, 顺-1, 4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应。植物中, 不同脂肪氧化酶的最适pH、pI、底 物和产物特异性、时空表达特性、亚细胞定位等存在差异。LOX参与的生理过程涉及损伤、病原攻击、种子萌芽、果 实熟化、植物衰老、脱落酸和茉莉酸合成, LOX也在正常的植物生长和生殖生长过程中作为营养储藏蛋白, 参与脂类迁 移、响应营养胁迫、调节“源”与“库”的分配。对LOX家族的深入理解，将有助于LOX在作物新品种的选育、新 型植保素的开发、食品加工等方面得到广泛的应用。 关键词:脂肪氧化酶, 结构, 催化反应, 功能, 基因表达, 亚细胞定位 Advances in plant lipoxygenases research Tingzhang Hu1, 2, Zongli Hu1, Xiaoxiao Qü1, Yanrong Ren1, and Guoping Chen1 1 Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044, China 2 Department of Biology, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404000, China Abstract:Lipoxygenases (linoleate: oxygen oxidoreductase, EC 1.13.11.12; LOXs) are encoded by a multi-gene family in plants. The LOXs are monomeric non-heme, non-sulfur iron dioxygenases, which catalyze the incorporation of molecular oxygen into polyunsaturated fatty acids containing a cis, cis-1, 4-pentadiene moiety. The LOX isoforms are distinguished by differences in optimum pH of the reaction, pI, substrate and product specificity, spatial and temporal expression, and subcellular localization. The function of various LOXs in plants has been suggested. Some of the physiological processes in which lipoxygenases have been implicated include wounding, pathogen attack, seed germination, fruit ripening, plant senescence, and synthesis of Abscisic acid (ABA) and Jasmonic acid (JA). During normal vegetative and reproductive growth, lipoxygenases have also been suggested to act as vegetative storage proteins, participate in transference of lipoid, and response to nutrient stress and source/sink relationships. Significant progress in understanding LOX families will be beneficial to the application of the LOX in crop breeding, research on new-type phytoalexin and food industry. Keywords: lipoxygenases, structure, catalysis, function, gene expression, subcellular localization Received: June 10, 2008; Accepted: October 8, 2008 Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30771464), the Chunhui Project of Education Ministry (No. Z2007-1-63006), the Natural Science Foundation Project of Chongqing Science and Technology Committee (No. 2007BB1196) and the Natural Science Foundation Project of Chongqing Three Gorges University (No. 2007-Sxxyyb-04). Corresponding author: Guoping Chen. Tel: +86-23-65112674; E-mail: chenguoping@https://www.doczj.com/doc/b7174865.html, 国家自然科学基金(No. 30771464), 教育部“春晖计划”资助项目(No. Z2007-1-63006), 重庆市自然科学基金(No. 2007BB1196), 重庆三峡学院 资助项目(No. 2007-Sxxyyb-04)资助。
转化酶研究进展 摘要转化酶是生物体内糖代谢的关键酶,综述了转化酶多态性及其活性表达调控、转化酶基因等方面的研究;用分子生物学手段研究了转化酶基因对植物糖分积累的直接作用;研究了逆境下转化酶多态性表达及生理调节、调控。 关键词转化酶;多态性;糖代谢;基因;活性 ResearchAdvanceonPlantInvertase GAO Yun (Pingliang Medical College,Pingliang Gansu 744000) AbstractInvertase plays an important role during the sugar metabolism in higher plant. The varieties,distribution,invertase expression,gene expression of the invertase in higher plant were introduced in this paper. The research on the direct function about invertase gene to plant sugar accumulation by molecule biology means and the research on invertase expression,physiological regulation under adversity stress were summarized. Key wordsinvertase;polymorphism;sugar metabolism;gene;activity 转化酶(invertase),又称蔗糖酶或β-D-呋喃果糖苷酶,是生物体内糖代谢的关键酶,在蔗糖代谢中催化如下反应:蔗糖+H2O→果糖+葡萄糖。由于糖代谢是生物体内物质代谢的中心,蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是碳运输、“库代谢”、糖积累、果实品质形成中的重要因子,还是细胞代谢的调节因子,可能通过影响基因表达发挥作用。因此,与蔗糖代谢和积累密切相关的转化酶是近年来生理生化、生理生态及分子生物学研究的热点之一。 1转化酶的多态性及在蔗糖代谢中的作用 转化酶是高度多态的,包括酸性转化酶(Acid Invertase,AI)、中性转化酶(Neutral Invertase,NI)和碱性转化酶。许多报道将中性转化酶和碱性转化酶看作同一种转化酶。酸性转化酶主要存在于液泡或束缚于细胞壁上,其最适pH值在3.0~5.0;中性和碱性酶位于细胞质中,最适pH值在7.0左右。报道的转化酶的分子量大小为50~80 kD,为单体或二聚体。生殖器官中均有液泡转化酶表达。栽培番茄、野生番茄及转基因番茄研究表明,在果实成熟后期,液泡转化酶的表达与否决定着果实可溶性糖的组分[1]。原位杂交研究表明,胞壁转化酶可能存在于维管束
（序号：101A1044 ）北京化工大学 第十届“萌芽杯”参赛作品—A类 作品名称：反式脂肪酸的研究进展 类别（综述类/实验类）：综述类 指导教师：孙巍 负责人：裴丹钰 联系方式： 2014年6月8日
团队成员及指导老师介绍指导老师介绍： 团队成员介绍：
目录 摘要 (4) 关键词 (4) 第1章引言 (4) 第2章反式脂肪酸的研究进展 (5) 第2.1节反式脂肪酸的概况 (5) 2.1.1 反式脂肪酸的简要介绍 (5) 2.1.2反式脂肪酸的历史背景与发展 (7) 2.1.3反式脂肪酸的使用现状及对人体的危害 (8) 2.1.4各国对反式脂肪酸的规定与限制 (11) 第2.2节反式脂肪酸的检测方法 (14) 第2.3节反式脂肪酸的减少与替代方法 (15) 第2.4节反式脂肪酸知信度调查结果的讨论 (24) 第3章总结 (26) 参考文献 (27) 致谢 (28) 附录 (28)
反式脂肪酸的研究进展 裴丹钰，惠园园，吕博妮 摘要：反式脂肪酸存在于天然物质和加工食品中。随着生活水平的提高，人们越来越注重食品的营养价值和安全性，而含反式脂肪酸的食品对人类健康的危害越来越为大家所熟知。本论文通过阅读大量文献资料，介绍了反式脂肪酸历史背景与发展、危害、各国对反式脂肪酸的规定与限制、检测方法，归纳整理出反式脂肪酸减少与替代方法，并且在论文中对每一部分都进行讨论分析，提出思考与建议。 关键词：反式脂肪酸、危害、政策法规、减少与替代方法 第1章引言 日常生活中反式脂肪酸主要来自于氢化油。含反式脂肪酸的氢化油成本低廉，效果却可以与天然黄油相媲美。出于口味、工艺及成本等方面的考虑，一些食品生产企业在饼干、糕点、煎炸食品(薯条）、调味品(花生酱)等许多食品的生产中会使用含有反式脂肪酸的起酥油、氢化植物油，易使某些食品中会有较多的反式脂肪酸[1]。 随着科学技术的进步和经济的飞速发展，人们越来越多地食用含有反式脂肪酸的食品，但随之而来的是反式脂肪酸引起的一些食品安全问题，这引起了科研工作者的重视。近年来，国内外越来越多的研究发现，反式脂肪酸的摄入可能对人体健康造成多种不良影响，如导致心脑血管疾病、影响婴幼儿发育、导致糖尿病等，对于反式脂肪酸的有关知识，我们应该有所了解。 本文概述了反式脂肪酸的历史背景与发展、使用现状与危害、各国政策法规、检测方法，主要归纳整理了并介绍减少与替代方法，并对反式脂肪酸的知信度进行调查。 在查阅资料与调查过程中发现，关于食品中反式脂肪酸的研究在国外己比较系统，有关方面都做了较深入的研究，取得了一定的成果，但在反式脂肪酸在人体健康方面，如与某些疾病的发生是否具有直接相关性以及致病机理等的研究都还尚未取得突破性进展。而国内由于营养知识的缺乏，使得我国居民对反式脂肪酸的认识较为落后，牛羊肉、乳制品消费的不断增加以及人造奶油等氢化油的大量使用，反式脂肪酸
植物体内转化酶活性的测定 转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。 【原理】 转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。 通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH 在7.0以下的为酸性转化酶)。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。 【材料、仪器与试剂】 1．材料：植物组织 2．试剂： （1）提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含5 mmol/L MgCl 2 , 2 mmol/L EDTA-Na 2 ,2% 乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT 。 （2）透析缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含2.5 mmol/L MgCl 2 , 1 mmol/L EDTA-Na 2 ,1% 乙二醇，1 mmol/L DTT。 （3）酶反应液：80 mmol/L乙酸-K 3PO 4 (pH4.7和pH7.0)缓冲液，内含50 mmol/L 蔗糖。 （4）葡萄糖标准液：1 mg/mL。 （5）3，5-二硝基水杨酸试剂：精确秤取1g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 ml。盖紧瓶塞，勿让CO 2 进入。若有浑浊可过滤后使用。 材料：小麦叶片、籽粒。 3．设备 冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），1 mL 移液管5支，5 mL带塞试管10支。 【方法与步骤】 1．酶的提取：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml 提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml 装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲
脂肪氧合酶的作用机理及对谷物陈化的影响研究进展 摘要：脂肪氧合酶(LOX)广泛存在于生物中，并且具有不同种类的底物位置特异性，可以形成具有不同位置特异性的氢过氧化脂肪酸，进而生成具有不同生物活性的物质。本文综述了脂肪氧合酶的作用机理、对谷物陈化的影响及其抑制方法的研究进展，对谷物食品加工有一定的指导意义。 关键词：脂肪氧合酶；作用机理；谷物陈化；适口性 脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)，又称脂肪氧化酶(Lipoxidase)或胡萝卜素氧化酶(Carotene Oxidase)，分子量范围一般在9000~100000之间（汪晓明等，2013）。LOX是一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，它专门催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及其酯的氢过氧化作用，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物(Andreou A et al., 2009)。LOX广泛存在于各种动物、植物、真菌以及少数海生生物中，在豆类中具有较高的活力，尤其以大豆中的活力为最高，LOX占大豆总蛋白含量的1%-2%（S. Nanda et al,. 2003）。在植物中其底物主要是亚油酸(Linoleic acid)和亚麻酸(Lionlenic acid)，在动物体内其底物主要是花生四烯酸(arachidonic acid)。据脂肪氧合酶氧化花生四烯酸位置特异性，可将脂肪氧合酶分为5-LOX，8-LOX，12-LOX和l5-LOX。大豆脂肪氧合酶LOX-1属于15-LOX，它已被广泛应用于同类脂肪氧合酶功能和性质模型（何婷等，2008）。本文结合国内外文献资料综述了脂肪氧合酶的作用机理以及对食品品质的影响，对食品的加工贮藏有着重要的指导意义。 1 脂肪氧合酶的同工酶 1970年，Christopher等利用离子交换层析法将脂肪氧合酶分离成Ⅰ型和Ⅱ型两个组分，两组分在许多性质上都不同，如酶活最适pH、热稳定性、Ca2+相关性、等电点、底物专一性等。大豆脂肪氧合酶有四种电泳类型，LOX-1主要出现在层析法分离的Ⅰ型中，也正是最早被Theorell分离结晶的那一种。LOX-2和LOX-3出现在Ⅱ型中。层析法的不断改进又将LOX-3分离成3a和3b两种，这两者在许多性质上相似。LOX的几种同工酶的性质比较见表1（蔡琨，2004）。 表1 几种脂肪氧合酶同工酶性质比较 LOX-1LOX-2LOX-3a LOX-3b 最适pH 9 6.8 7 7 Ca2+相关性激活激活抑制抑制 热稳定性热稳定受热易失活受热易失活受热易失活 等电点 5.70 5.85 5.95 6.20 二硫键数 4 4 3 3 含巯基数 4 4.2 5.6或6 5.9 底物特性阴离子底 物 酯化底物单氧化物单氧化物 生成氢过氧化 物类型 13位9或13位9或13位9或13位2 脂肪氧合酶的作用机理
货号：QS1108-25 规格：25管/24样脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）活性试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。 测定原理： FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。 自备实验用品及仪器： 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体25mL×1瓶，－20℃保存。用前1 d取出置于4℃充分解冻后混匀。 试剂二：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入550 μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加入550 μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加入1050 μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约 0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心40min，取上 清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的 比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心40min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 FAS测定操作： 1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min。 3. 测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、20μL试剂二、20μL 试剂三、820μL试剂四和40μL试剂五，迅速混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A1-A2。
反式脂肪酸的危害研究进展 摘要:反式脂肪酸是一类包含一个或多个反式构型双键的不饱和脂类分子。膳食中的反式脂肪酸有2类: 微量的天然反式脂肪酸和可观的人造反式脂肪酸。过去的研究认为反式脂肪酸的摄入仅仅是一个营养问题, 但越来越多的毒理学和暴露评估的研究结果表明反式脂肪酸对人体健康有诸多不良影响。因此, 反式脂肪酸的摄入已成为一个食品安全问题。本文主要围绕膳食反式脂肪酸的来源、动物学实验、对人体产生健康危害等进行综述, 并讨论了反式脂肪酸的风险评估现状和未来展望。 关键词:膳食反式脂肪酸；氢化植物油；毒理学 1 引言 反式脂肪酸(Trans Fatty Acids，简称”TFAs”) 是分子中含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸。虽然TFA属于不饱和脂肪酸，但反式双键的存在使脂肪酸的空间构型产生了很大的变化．脂肪酸分子呈刚性结构，性质接近饱和脂肪酸。许多研究表明大量食用含TFA的食物会加速动脉硬化，易导致心脑血管疾病、冠心病、糖尿病和老年痴呆等疾病，已成为近年来相关领域关注的热点[1]。 日常膳食中的反式脂肪酸有2 类: 微量的天然反式脂肪酸(rTFA)和可观的人造反式脂肪酸(iTFA)。iTFA可以增加有害的低密度脂蛋白(LDL)，降低有益的高密度脂蛋白(HDL)水平，增加冠心病发病率的风险[2]。饮食中摄入2%的多不饱和脂肪酸被等量的氢化植物油反式脂肪酸取代, 患冠心病的几率会增加27%[3]。iTFA 可增加心血管疾病的风险, 这一结论已经达成共识。 膳食中人造脂肪酸的摄入会对身体产生不良影响，引发或诱发心血管疾病、II型糖尿病和代谢综合征等疾病[4]。因此, 通过总结现有的研究来加深人们对反式脂肪酸毒理学和流行病学的理解, 提高人们对反式脂肪酸的重视以及更好地维持身体健康具有重要意义。 2 反式脂肪酸的来源 2.1 反刍动物(如牛、羊)的脂肪和乳与乳制品 反刍动物中的脂肪经其体内微生物作用发生部分氢化反应而产生少量反式脂肪酸。例如，牛脂中含2.5％～4％，乳脂中含5％一9.7％反式脂肪酸[5]。 2.2 食用油的氢化产品 如人造奶油、起酥油等制成的食品。蛋糕、面包、曲奇饼、雪糕、西式快餐如炸鸡块和炸薯条等烘烤食品中的氢化油中含反式脂肪酸。其中，人造奶油为7.1％～17.7％(最高为31.9％)，起酥油为10.3％(最高为38.4％) [6]。 2.3 经高温加热处理的植物油 植物油在精练脱臭工艺中，通常需要2500C以上高温和2h的加热时问。由于高温及长时间加热，有可能产生一定量的反式脂肪酸。 人造反式脂肪酸的产生主要是植物油通过氢化过程变成固态脂肪, 比如人造黄油、奶油、起酥油等部分氢化的植物油, 用于食品加工可延长食品的保质期、增加食品的风味。日常膳食中添加氢化植物油制作的食品如焙烤食品、薄脆饼干、炸薯条、巧克力、冰淇淋、人造黄油等都含有反式脂肪酸[7-8]。一项调查表明, 所