项目名称：肿瘤发生发展中关键蛋白的功能与调控首席科学家：肖智雄四川大学
起止年限：2012.1至2016.8
依托部门：教育部四川省科技厅
一、关键科学问题及研究内容
本项目拟解决的关键科学问题是：原癌蛋白和抑癌蛋白通路相互作用和信号网络互动调控肿瘤发生发展的分子机制。恶性肿瘤作为细胞生长的疾病，与细胞生长、凋亡、细胞周期、肿瘤细胞迁移和侵袭等最基本的生命过程紧密相关。因此，以原癌-抑癌蛋白信号网络互动为主要切入点，发现及鉴定重要蛋白的关键新靶点及信号通路新调控机制，深入探讨原癌-抑癌蛋白信号网络信号通路的动态变化，阐明其在肿瘤发生发展过程中的关键作用，是本课题拟解决的关键科学问题。
本项目将以原癌蛋白（EGFR，Ras/Rho家族，PI3K）、抑癌蛋白(p53家族、BRCA1、PTEN)以及PI3K/Akt、MAPK、GSK3b等关键信号通路为出发点，研究这些原癌蛋白-抑癌蛋白的关键上游新调控因子、下游关键新靶点及其信号网络互动在肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期、细胞迁移、侵袭过程以及免疫球蛋白受体从免疫防御向EMT恶性转化转变中的功能和分子调控机制。本项目的实施不仅能够完善基本生命科学理论与细胞癌变理论体系，而且为肿瘤诊断治疗提供理论指导意义和潜在的药物新靶点，并对小分子干扰和药物筛选提供新的思路和方法。
围绕上述科学问题，我们将利用细胞生物学、分子生物学、生物物理学、遗传学、系统生物学及蛋白组学等交叉科学技术方法，发挥多学科团队作战的优势，结合动物肿瘤模型以及临床标本，阐明原癌-抑癌蛋白网络互动及其调控在肿瘤细胞生长、细胞周期、EMT、细胞迁移及侵袭过程中的作用。主要研究内容包括：
1．解析原癌蛋白Ras/Rho家族上游调控新蛋白和下游作用新靶点在肿瘤细胞迁移的分子作用机制
1）深入阐明Gankyrin等关键调控蛋白以及Hippo/MST1-YAP2信号转导通路在肿瘤迁移过程中的作用。
2）鉴定恶性肿瘤迁移过程中关键调节重要信号通路中的蛋白质复合体。发现新的信号通路调控分子并揭示其作用机制。
3）解析Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2蛋白质结构及其相关调控蛋白的溶液结构，研究蛋白的相互作用机制，揭示其功能的结构基础。
4）研究PIK3CA对p63的功能调控，解析PIK3CA突变体蛋白调控p63蛋白表达的分子机制，阐明PI3K通路与p63调控细胞迁移和侵袭的功能相关性。
5）应用常见肿瘤标本，对Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2、TAp63和ΔNp63基因等的表达进行定性、定量和定位分析，揭示其在肿瘤中表达的动态时空关系。
2．阐明抑癌蛋白p53家族的下游关键新靶点以及上游调控新蛋白对肿瘤发生发展的分子调控机制
1）研究p53下游新靶点Killin对S期监控点的调控，阐明Killin抑制DNA合成、激活CHK1/2的分子途径及凋亡机理，确定Killin/N8-50多肽与DNA结合前后的结构。
2）解析p53选择性调控的分子机制，从KRAB锌指蛋白家族中筛选p53调控分子，确定其调控的细胞学效应。
3）解析SIRT1-p53复合体的晶体结构。
4）阐明p63-CD82通路调控细胞迁移和侵袭的机理，研究p63调控MAPK的机制，阐明p63-MAPK通路与细胞迁移和侵袭的相关性。
3．揭示细胞周期中关键蛋白调控有丝分裂和染色体稳定性及在肿瘤发生发展中的功能和调控
1）建立微管动态不稳定性的检测分析体系，阐明微管相关蛋白(e.g. PRC1)对微管动态不稳定性的直接调控机制。
2）揭示微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰对有丝分裂的调控机制。
3）应用动物模型并结合人类肿瘤标本检测，明确微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰与恶性肿瘤发生发展及转移的关系。
4）解析微管相关蛋白(PRC1，Nlp及其截短体)的三维结构。
4．探究p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制在pIgR诱导EMT 恶性转化中的影响
选择有深厚研究背景的、与EMT恶性转化密切相关的pIgR为主攻研究对象，以免疫球蛋白转运调控与恶性转化调控系统为核心研究内容，构建工程细胞株、工程动物模型等研究系统，探究pIgR EMT恶性转化的分子机制，重点从免疫防御向免疫背叛转变的分子开关以及受体酪氨酸激酶家族和p53对其调控机制两个研究视角出发，研究pIgR功能逆转的动态调控机制，阐明p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化调控网络的关键节点分子；在此基础上，引入“基因敲除”与“化学干预”平行研究策略，利用国家化合物库，筛选发现小分子调控探针，从外源性干预角度入手，佐证内源性调控的本质。
四个子课题研究内容相互关联，从点到面，将深入探讨原癌-抑癌蛋白信号网络互动在肿瘤发生发展过程中的重要作用和分子机制。
二、预期目标
本课题总体目标是以恶性肿瘤细胞为研究对象，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白通路相互作用和信号网络互动在细胞生长、凋亡、细胞周期和肿瘤细胞迁移等最基本生命过程中的功能和调控，发现和鉴定肿瘤发生发展中新的关键调控蛋白。我们的研究将进一步完善现有生命科学基础理论以及细胞癌变理论体系，同时以这些信号通路网络和重要蛋白质的分子作用机制为突破点，为癌症治疗提供新策略和新靶点。力求在肿瘤发生发展领域中取得原创性、前瞻性、突破性研究进展，提升我国癌症研究水平，保持国际先进行列。
本项目的五年预期目标：
1．建立一系列适合于肿瘤生长凋亡、迁移和侵袭研究的抑癌蛋白相互作用研究体系，筛选、发现和鉴定一批选择性p53家族上游调控蛋白、全新性下游作用靶点及其相互作用，阐明p53-p63信号网络在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用机制。
2．建立一系列适合肿瘤迁移和侵袭研究的原癌蛋白通路的研究体系，揭示恶性肿瘤迁移过程中GTPase Ras/Rho家族蛋白的关键重要信号通路及网络互动的功能特点。
3．研究细胞周期调控关键蛋白对有丝分裂调控的分子作用机制，揭示该类蛋白及其网络互动在恶性肿瘤发生发展过程中的关键作用。
4．明确免疫球蛋白受体pIgR在EMT恶性转化中的重要作用，揭示免疫球蛋白受体pIgR诱导EMT恶性转化的分子机制。
5．人才培养及基地建设：
人才培养：为我国培养一批研究肿瘤发生发展机制的创新性人才，打造一支颇具国际竞争力的优秀创新群体，重点培养2-3名国际知名领衔学科带头人、2-3名国家杰出青年获得者、2-3名中国科学院百人计划入选者和一批博士后、博士生、硕士生。
希望通过本项目的实施，取得具有国际影响力并原创性科研成果。在国际重
要学术刊物上发表高水平论文50篇以上，其中在影响因子大于10的刊物上发表10-15篇，申请专利10-15项。
基地建设：综合应用基因差异筛选技术、蛋白质组学技术、细胞内蛋白质三维结构成像技术、活细胞与活体成像技术、肿瘤细胞迁移研究技术、体外微管动态不稳定性分析技术、遗传操作与模式动物技术、X射线单晶衍射分析结合二维和多维核磁共振（NMR）技术，建立体内外多参数同步化、时空定量可视化的原癌蛋白与抑癌蛋白结构与功能研究体系，打造国际同行瞩目的代表中国原创水平的从事原癌蛋白与抑癌蛋白之间网络互动与肿瘤发生发展机制研究的平台基地。
课题设臵：
1．课题设臵的总体思路
课题的设臵主要考虑当前癌症研究领域的研究重点和发展趋势，并结合我国常见恶性肿瘤诊治水平提高的重大需求。以研究原癌蛋白-抑癌蛋白网络通路及其调控在细胞生长增殖、细胞周期调控、肿瘤细胞迁移和炎癌转化等方面的分子机制为出发点，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白信号网络互动，以原癌蛋白Ras/Rho 家族、PI3K/Akt、GSK3b等以及抑癌蛋白p53家族、BRCA1、PTEN及其网络互动为切入点，研究新的上下游调控蛋白的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用。并以这些关键蛋白为靶点，筛选可调控其功能的小分子化合物，为临床肿瘤诊疗奠定分子生物学基础。
2．各课题研究内容及其与项目预期目标的关系
本项目的设臵以上述思路为基础，分为四个课题：（1）研究原癌蛋白Ras/Rho家族新的上游调控蛋白和下游作用靶点在EMT、肿瘤转移的分子作用机制；（2）研究抑癌蛋白p53家族下游关键新靶点、上游调控新蛋白、以及相关信号通路对细胞生长、凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭的功能和调控；（3）研究细胞周期中关键新蛋白调控有丝分裂、染色体组稳定性以及在肿瘤发生发展中的作用；（4）研究免疫蛋白和小分子化合物在EMT和肿瘤转移的调控与干预的分子机制。
本项目以正常细胞癌变过程中最基本的生物学过程，包括细胞周期、细胞增殖与凋亡、EMT和细胞迁移和侵袭为中心，以调控这些基本生物学过程的关键蛋白和信号通路为主线。前两个课题分别从原癌蛋白Ras/Rho家族和抑癌蛋白p53家族的功能、信号通路和调控机制进行并行和相互交叉的研究；课题三着重研究生命现象中最基本的细胞周期中调控有丝分裂的关键蛋白，及其与前两个课题所涉及的原癌蛋白－抑癌蛋白信号网络中关键蛋白的互动；课题四研究免疫球蛋白受体以及受体酪氨酸激酶家族对EMT和肿瘤转移的调控网络。同时研究小分子化合物对这些过程的干扰，为肿瘤诊断治疗提供新方法和新靶点。
本项目的主要目标是深入研究原癌-抑癌蛋白的相互作用。课题一和课题二以原癌蛋白PIK3CA、Apak、Gankyrin、调控抑制癌蛋白p53、p63为主线。同时研究p53、p63对PI3K和MAPK等关键生长信号通路的反馈调控。课题三以细胞有丝分裂调控关键蛋白PRC1、Nlp为切入点，研究微管相关蛋白网络对细胞有丝分裂过程中纺锤体形成以及中心体、染色体分离的调控，同时研究p53对这些蛋白分子及其网络互动的上游调控。课题四以免疫球蛋白受体EMT恶性转化的分子机制研究为切入点，研究免疫球蛋白受体功能逆转的动态调控机制以及p53、RTK 及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化中新的关键节点蛋白的结构组成，阐明其动态变化的网络调控机制。
四个子课题研究平台相互交叉、研究内容相互关联，从点到面，课题一和课题二中已建立的蛋白组学、蛋白质结构解析平台、和课题四已建立的小分子化合物筛选平台为整个项目研究关键蛋白的功能、调控及分子机制提供技术平台和支持。其相互关系如下图所示：
三、研究方案
课题一：研究原癌蛋白Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点在肿瘤细胞迁移的分子作用机制
基于原癌蛋白Ras等诱导肿瘤的小鼠模型，利用ORIS系统，应用高通量基因沉默技术和高内涵技术等手段鉴定恶性肿瘤迁移过程中关键蛋白质，并探讨这些蛋白质在肿瘤发生发展过程中的功能与调控；深入研究Gankyrin等癌基因以及Hippo/MST1-YAP2信号转导通路在肿瘤迁移中的作用；人肿瘤中Gankyrin等关键调控蛋白的表达水平与肿瘤细胞的转移程度的相关性分析；利用NMR解析Gankyrin等关键蛋白质及其复合体的结构，我们将利用已建立的稳定表达各种PIK3CA突变体的细胞株分析PI3K信号通路调控ΔNp63蛋白表达的分子机制。利用特异性磷酸化抗体重点探索Akt蛋白激酶激活状态对ΔNp63蛋白表达调控的影响。验证p63是否是介导PI3K信号通路调控肿瘤转移的关键因素。研究并评估p63信号通路在肿瘤细胞迁移和侵袭中的临床相关性。
承担单位：四川大学，军事医学科学院，中科院生物物理所
课题负责人：肖智雄教授
主要学术骨干：李慧艳副研究员，袁增强研究员
经费比例：27%
课题二：研究抑癌蛋白p53家族及新的上游调控蛋白和下游作用靶点对肿瘤发生发展的分子调控机制
研究p53下游新靶点蛋白Killin对细胞周期S期监控点的功能和调控。明确Killin在S期染色质上的定位、及其与DNA复制蛋白RPA和PCNA之间相互关系，阐明Killin抑制DNA合成的分子机理。揭示Killin在DNA损伤应答过程中的功能，阐明Killin 激活DNA监测点蛋白CHK1和CHK2的分子途径及细胞凋亡机理，为肿瘤化疗放疗提供进一步的理论基础。通过NMR溶液结构分析，确定Killin/N8-50多肽
与DNA结合前后的结构及抑制DNA合成的分子机理。解析对p53蛋白功能选择性调控的分子机制。以我们新发现的选择性调控p53下游细胞凋亡活性的KRAB型锌指蛋白Apak为切入点，从KRAB锌指蛋白家族400多个成员中筛选鉴定新的p53选择性调控分子，确定它们所调控的细胞学效应及与肿瘤发生发展的关系，探索Apak 对p53靶基因转录调控区的表观遗传学调节机制。解析SIRT1-p53蛋白复合体的晶体结构。以我们发现的p63下游新靶点CD82/KAI1为切入点，阐明p63-CD82通路调控细胞迁移和侵袭的分子机理。同时研究p63调控MAPK的分子机制，阐明p63-MAPK信号通路与细胞迁移和侵袭的功能相关性。
承担单位：四川大学，军事医学科学院，中科院生物物理所
课题负责人：梁朋教授
主要学术骨干：李沁桐副教授，李力副研究员，杨娜副研究员
经费比例：26.5%
课题三：研究有丝分裂关键调控蛋白在肿瘤发生发展中的作用及分子机制
研究有丝分裂调控关键蛋白PRC1和Nlp的分子作用机制及其网络互动对细胞周期及有丝分裂的调控，并揭示这些蛋白及其作用网络对恶性肿瘤发生发展及转移的作用机制，最终明确以这些蛋白为核心的网络互动、信号传导及蛋白修饰在恶性肿瘤发生发展及转移，甚至治疗过程中的重要意义。建立微管动态不稳定性的检测分析体系，阐明微管相关蛋白(e.g. PRC1)对微管动态不稳定性的直接调控机制。揭示微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰对有丝分裂的调控机制。应用动物模型并结合人类肿瘤标本检测，明确微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰与恶性肿瘤发生发展及转移的关系。解析微管相关蛋白(PRC1，Nlp 及其截短体)的三维结构。
承担单位：中国医学科学院，北京大学
课题负责人：姜伟教授
主要学术骨干：童彤研究员, 夏斌教授
经费比例：26.5%
课题四：研究免疫蛋白和小分子化合物在肿瘤发生发展中的调控与干预的分子机制
选择有深厚研究背景的、与EMT恶性转化密切相关的pIgR为主攻研究对象，以免疫球蛋白转运调控与恶性转化调控系统为核心研究内容，构建工程细胞株、工程动物模型等研究系统，探究pIgR在EMT恶性转化中的分子机制，重点从免疫防御向免疫背叛转变的分子开关以及受体酪氨酸激酶家族和p53对其调控机制两个研究视角出发，研究pIgR功能逆转的动态调控机制，阐明p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化调控网络的关键节点分子；在此基础上，引入“基因敲除”与“化学干预”平行研究策略，利用国家化合物库，筛选发现小分子调控探针，从外源性干预角度入手，佐证内源性调控的本质。
承担单位：中科院上海药物所
课题负责人：耿美玉研究员
主要学术骨干：俞强研究员，黄敏副研究员
经费比例：20%
四、年度计划
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G 琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原2体的使用有助于避免污染的产生。（． 的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的。这需要进行蛋白质的定位来确定。免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白。例如E1A与p60的共沉淀就是间接的相互作用。其实际上是E1A与p107直接相互作用，而p107与p60直接相互作用的结果。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀试验的灵敏度不够高。这与抗原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏相互作用的天然状态。 免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法，也是较常用的方法。它的优点是：与蛋白亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应；蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在。Schaerer与他的同事们利用
1，基因组：一个细胞或病毒所包含的全部基因。 2，蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定义：蛋白质组是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。 3，蛋白质组学：是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾 病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以 3，等电聚焦：分离两性分子，特别是分离蛋白质的一种技术。根据在一个电场的影响下这些两性分子在ph梯度上的分布情况进行分离 等电聚焦技术：在一个pH梯度和外加电场下，蛋白质有移向pH梯度中使其净电荷为零的点的倾向。（带正电荷移向阴极，带负电荷移向阳极）。IEF可以基于极微小的电荷差异而分离蛋白，具有高分辨率。4，负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果（图2-15），分辨力可达1.5nm左右 5，质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。 质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 7，分子离子峰：子受电子束轰击后失去一个电子而生成的离子M+成为分子离子。在质谱图中，由M+所形成的峰称为分子离子峰。 7.碎片离子峰当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量（50~70eV）时，可能使分子离子的化 学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。 碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。 8.软电离技术在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子， 生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。 9.源内衰变技术（insource-decay，ISD）源内衰变发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后几 百纳秒之内，是离子的“即可片段化”。这些片段离子通过衰减离子取出，能在线性飞行时间质谱中被发现，许多蛋白质和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的离子源区域内变成肽离子片段。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子，通过分析这些片段离子谱可鉴定蛋白质。 10.肽质量指纹图谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于 每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数据也具特征性，这种特征就像指纹一样，所以称为指纹谱。肽质量指纹图谱可用于蛋白质的鉴定，用实验测得的PMF与蛋白数据库中的蛋白质理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质 肽序列标签是由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。
基金项目：国家863高技术研究发展计划项目（2006AA02A309） 收稿日期：2011－10－14；修回日期：2012－02－13作者简介：凌孙彬（1989－），男，浙江杭州人，大连医科大学七年制学生。E －mail ：lsb0330@126．com 通信作者：王立明，教授，博士生导师。E －mail ：Wangbcc259@yahoo．com．cn 第34卷第2期2012年4月 大连医科大学学报 Journal of Dalian Medical University Vol．34No．2Apr．2012 线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中的进展 凌孙彬1 ，唐 博2，王立明 2 （1．大连医科大学七年制2007级，辽宁大连116044；2．大连医科大学附属第二医院普外三科，辽宁大连116027） 摘要：线粒体DNA 的突变和蛋白表达谱的异常，将严重影响细胞的凋亡和能量代谢过程，这一变化可能是恶性肿瘤细胞代谢及功能异常的重要组成部分。蛋白质组学技术可以分析肿瘤细胞或组织在某一时间点内全蛋白的表达情况及活性，而基于亚细胞水平研究的线粒体蛋白质组学较传统蛋白质组学研究有更高的分辨率。线粒体蛋白质组的改变与多种肿瘤相关，随着亚细胞分离技术和蛋白质鉴定技术的发展，线粒体蛋白质组学在寻找新的肿瘤相关特性蛋白研究中显示出越来越重要的意义。关键词：肿瘤；线粒体；蛋白质组学中图分类号：R34 文献标志码：A 文章编号：1671－7295（2012）02－0179－03 Advance of mitochondrial proteomics in cancer research LING Sun －bin 1，TANG Bo 2，WANG Li －ming 2 （1．Grade 2007，Department of Seven －year Curriculum ，Dalian Medical University ，Dalian 116044，China ；2．Department of General Surgery ，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University ，Dalian 116027，China ） Abstract ：The mutational mitochondrial DNA and abnormally expressed mitochondrial proteins ，inducing a severe impact on apoptosis and energy metabolism of cells ，may serve as a significant composition of overall metabolic and functional dis-order in malignant cells．Proteomics displayed the capability on analysis of entire proteins expression in certain period in cells or tissues．Furthermore ，mitochondrial proteomics ，focusing on phenotype on subcellular level ，has higher resolution．Numbers of researches have shown the correlation between changes in mitochondrial proteome and tumors．Along with the progress of subcellular isolation and proteins identification technics ，mitochondrial proteomics plays an increasingly signifi-cant role in finding cancer －related specific molecules．Key words ：tumor ；mitochondria ；proteomics 近年来，蛋白质组学的发展为肿瘤研究提供了 全新的方法和思路，细胞水平的肿瘤蛋白质组学研究得到了广泛的开展，但是，现有分离技术下往往难以一步到位地获得细胞的全蛋白质组，大量的低丰度蛋白质未能得到显现和分析。因此，亚细胞蛋白质组学的开展可以作为传统蛋白质组学的重要补充，同时也极大地降低了针对全细胞蛋白质组学研 究的复杂性。线粒体（mitochondria ， Mt ）是真核细胞中一种重要的细胞器，除作为能量产生的场所外，已发现其参与包括肿瘤细胞发生发展在内的多种病理 生理过程［1］ 。线粒体蛋白质组学已被运用于部分 肿瘤的研究中， 进一步阐明线粒体蛋白质与肿瘤的关系，有助于寻找新的肿瘤相关特异性蛋白。本文就线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中的进展进行综
项目名称：代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过 程中的作用及机制 首席科学家：赵世民复旦大学 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：教育部上海市科委
一、关键科学问题及研究内容 关键科学问题 本课题将以代谢相关的蛋白质翻译后修饰为切入点，系统挖掘参与代谢酶修饰调控的乙酰化和磷酸化等修饰酶及其修饰底物，系统挖掘被代谢物调控的下游被甲基化和羟基化等修饰的蛋白；在此基础上研究其对细胞代谢的作用，作用的分子机理以及在肿瘤发生中的变化规律和生理病理意义；并通过结构生物学方法寻找通过干预修饰进而干预代谢的小分子化合物。具体地，将就如下关键科学问题开展研究： 1. 发展相关技术和研究体系，系统地挖掘代谢相关翻译后修饰的修饰酶及其底物；探索相关蛋白质修饰酶类和底物通过何种网络及分子机制进行调控。 2. 在肿瘤发生、发展过程中，代谢相关翻译后修饰如何变化，以及这些变化对于肿瘤发生发展有何病理意义。 3. 研究能否通过活性小分子化合物干预代谢相关翻译后修饰，进而干预代谢来实现肿瘤的预防与干预。 主要研究内容 我们将以项目组成员前期在代谢相关的蛋白质翻译后修饰研究为基础，从广度与深度上扩展对代谢失调引发肿瘤机理的研究。在广度方面主要系统地发现参与细胞代谢调控的翻译后修饰的修饰酶，以及被代谢物调控的下游底物蛋白和信号通路。在深度方面主要研究各种翻译后修饰调节代谢的分子机理，重点研究乙酰化
修饰参与代谢调控的机制；在代谢物调控下游翻译后修饰和信号通路的分子机理方面，我们将重点研究对组蛋白甲基化和DNA去甲基化酶的调控机理；同时，用结构生物学的策略寻找针对上述具有治疗潜力的靶分子的活性小分子化合物。 1. 代谢相关的蛋白质的修饰谱及其在肿瘤发生发展过程中的变化规律以肝癌和神经胶质瘤等癌症为模型，建立全细胞的与代谢相关的蛋白质乙酰化、磷酸化、羟基化、甲基化修饰鉴定的技术方法与平台。探讨这些肿瘤发病过程中代谢酶的乙酰化、磷酸化修饰的动态变化，以及被代谢中间物调控的下游羟基化、甲基化等蛋白底物与动态变化。 2.肿瘤发生发展过程中代谢组的变化规律及其与代谢相关修饰变化的对应关系与调控机制通过代谢组学、遗传学以及生物化学策略，比较肿瘤细胞与正常细胞中的代谢物组成特点，重点探讨代谢相关修饰改变与代谢组改变的内在联系；建立能反应肿瘤特征的代谢组谱，力争发现肿瘤特异性代谢标志物（群）。 3. 肿瘤发生发展过程中一些代谢产物作用的信号通路及对肿瘤发生发展的意义 系统地研究与肿瘤发生密切相关的糖酵解通路与三羧酸循环通路相关代谢中产物在肿瘤发生发展过程中的作用机理。重点研究 酮戊二酸（ KG）及其结构类似的等代谢中间物影响各种 KG依赖的系列双加氧酶功能的分子生化机理及其对细胞信号通路的影响，包括 KG对PHD、系列组蛋白去甲基化酶以及DNA
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
摘要：表观遗传调节异常逐渐被认为是癌症的标志。尤其是翻译后的组蛋白修修饰，被认为在癌症发展过程中起到关键作用。后翻译组蛋白修饰参与致癌作用的各个阶段。组蛋白修饰也被探索为疾病发生发展的可能标志物。这篇文章讨论了组蛋白修饰在癌症生物学中扮演的角色以及探索他们预后的可能性。 癌症一直被公认为多效性和多方面的疾病，和发展的起始，是由无数的因素的影响。由于其显著的错综复杂性，癌症的概念作为表观遗传疾病，以及遗传，改变已经获得了相当大的势头，在科学界，[ 1 ]。表观遗传学是研究遗传的表型，这是不是由DNA序列编码[ 2，3 ]。对于癌症，“表观遗传学”通常是指在DNA 甲基化变化微小，组蛋白翻译后修饰，和其他染色质元素，可以改变基因的表达。 组蛋白修饰和癌症 组蛋白是高度保守的碱性蛋白质，可以成为氨基酸残基位于N-末端 C-末端的翻译后修饰。有四个核心组蛋白：蛋白2个（H2A），B组蛋白2（H2B）、组蛋白3（H3），和组蛋白4（H4），和一个连接组蛋白，组蛋白1（H1）。约146个碱基对的DNA缠绕在组蛋白八聚物，组成每个核心组蛋白的两个副本，在左手超螺旋圈。H1，这是不包括在核小体的“珠”，作为一个连接有助于安全的DNA 缠绕在核小体。 组蛋白残基磷酸化，乙酰化，甲基化可以成为，，sumolyated，泛素化和ADP-核糖基化。不像其他的修饰。氨基酸的甲基化，如赖氨酸和精氨酸，可以改变量。赖氨酸残基（K）可以是单，双，或三甲基化，而精氨酸残基（R）可以是单甲基化和对称或不对称的二甲基化。值得注意的是，无论是乙酰化（AC）和精确的（me）的赖氨酸甲基化（即单-，二-，和三甲基化）都可以影响染色质的活性和失活的状态和随后的基因的转录状态。 浓缩的乙酰化组蛋白尾巴是具有代表性的与转录激活有关的基因。而甲基化的功能性结果取决于甲基基团的数目，残基本身，其位置在组蛋白尾部。例如，组蛋白3赖氨酸4二和三甲基化（H3K4me2和H3K4me3）和组蛋白3赖氨酸 9（H3K9me1）化与开放的染色质和活性相关的基因表达，而组蛋白3赖氨酸27二和三甲基化（H3K27me2和H3K27me3）和组蛋白3赖氨酸9二和三甲基化
蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法 XX 化工与制药专业化药XX班学号XXX 指导老师XX老师 摘要 蛋白质棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式，对象主要是胞质蛋白质，对蛋白质功能产生多重影响。近年来由于相关新技术引入，对蛋白质棕榈酰化主要修饰酶及其对靶蛋白功能调节方面的研究已渐成为新热点。本文主要对近几年来蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法作了综述。 关键词：棕榈酰化修饰蛋白质酰基转移酶 DHHC 蛋白
前言 人类基因组计划揭示了基因组的结构,但对多数基因功能仍知之甚少。基因功能通常通过蛋白质实现，因此蛋白质组研究成为近年来生命科学研究的重点领域。蛋白质具有生物活性之前要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程。其中脂质化修饰是一种重要的翻译后修饰形式，目前已知约有5种脂质共价修饰形式，其中100多种蛋白质发生棕榈酰化修饰，赋予蛋白质极其复杂的生理功能[1]。
1．蛋白质棕榈酰化修饰及其相关蛋白质 1．1蛋白质棕榈酰化修饰 30年前蛋白质棕榈酰化修饰形式被发现，然而对其修饰酶的研究最近十年才有所进展。在酿酒酵母中首次发现蛋白质酰基转移(PAT)， 由5O 个氨基酸残基组成，其序列特征为锌指样DHHC-CRD(半胱氨酸残基聚集域)，类似Cys2His2锌指模体，常位于跨膜域TM2和TM3之间。但是至今仍未明确棕榈酰基团修饰识别模体， 推测其保守序列为C-x 2 C-x 9-H-Cx 2-C-x 4-DH-H-C-x 5 C-x 4-N-x 3一F(x 为 任意氨基酸)[2] 。 根据介导和连接方式不同， 棕榈酰化修饰有三种方式和两种类型[2,3,4]。三种修饰方式包括：(1)PAT 介导棕榈酰基转移，为目前主要研究方式；(2)棕榈酰辅酶A 介导转移；(3)棕榈酰辅酶A 为辅酶的转移蛋白质介导转移。两种类型包括：(1)N 型，通过酰胺键连接半胱氨酸(Cys)，(2)S 型，通过硫脂键连接Cys 。S 型较为多见，可分为四个亚类：修饰位点位于或临近跨膜域；修饰位点为N-或C-端Cys ；酰化依赖C-端CAAX 盒异戊烯化修饰；酰化依赖N ．端SH4结构域豆蔻酰化修饰。与异戊烯化、豆蔻酰化、胆固醇脂化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI)四种修饰形式不同，棕榈酰化由PAT 、硫酯酶(PPT)动态调节蛋白质酰化和脱酰化， 具有可逆性， 该修饰还常常与其他修饰形式共同修饰蛋白质[5,6]近几年， 相关蛋白质陆续被识别发现。 1．2 DHHC 蛋白 目前将富含DHHC 结构域的蛋白质称为DHHC 蛋白， 它们组成DHHC 蛋白质家族。多数家族成员具有PAT 活性，而且棕榈酰化主要修饰具有DHHC —CRD 的蛋白质，所以多种DHHC 蛋白既是酶又是底物[2]。0hno 等[7]荧光观察发现，人类和酵母DHHC 蛋白主要位于细胞内质网和／或高尔基体，其中少数蛋白质如Pfa5、DHHC-5位于细胞膜，还有少数如Vac8、Pfa3位于酵母液泡。人类DHHC 蛋白普遍存在，其中许多蛋白质呈组织特异性分布，在器官发生晚期合成，发育组织表达高，而成熟组织表达低[2]。 1．3酵母的棕榈酰化蛋白质 最早在酵母中发现j 个促进棕榈酰化修饰的蛋白质是Ras 功能效应子 (Erf2)，锚蛋白重复域蛋白(Akr1)和 SNARE 家族成员Ykt6，但没有确定它们具有PAT 功能；随后经证实Erf2-Erf4/Shr5蛋白质复合体，Akrl 和Swfl 具有PAT
项目名称：肿瘤和神经系统疾病的表观遗传机制首席科学家：裴钢中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2005.12至2010.11 依托部门：中国科学院
一、研究内容 关键科学问题 本项目将探索和回答：细胞内DNA甲基化和染色质修饰的表观遗传谱式的建立及其动态平衡的维持机制；表观遗传信息对基因的选择性表达和对生命活动的调控机制；表观遗传失调在肿瘤和神经退行性疾病发生、发展中的作用机制。 研究内容 本项目组织了国内优秀团队，分四个部分八个课题，开展从基础到临床，临床到基础两个方向的研究，将细胞增生性疾病（肿瘤）和（神经）细胞退行性疾病与正常生命活动过程的表观遗传学研究有机结合起来。 第一部分采用模拟正常生理状态的细胞、动物模型，从分离筛选调控染色质修饰的因子出发，研究细胞如何建立和维持表观遗传谱式的机制，阐明负责细胞增殖、分化与功能特化的关键基因在染色质水平上的转录调控规律。 第二部分从基础和病理两个方面研究肿瘤细胞去分化及无节制增殖的表观遗传学基础，揭示肿瘤发展的不同阶段DNA甲基化和染色质重塑的异常及其动态变化。 第三部分研究神经细胞生长、分化和死亡过程的表观遗传调控机制，揭示神经退行性疾病发生、发展各阶段中重要功能基因DNA甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑的动态变化特征，研究引起神经细胞定向分化及病变的环境因素对表观遗传网络的影响。 第四部分针对正常细胞生长分化与疾病状态下基因组甲基化谱式重编的普遍性和重要性，以表观基因组平台和生物信息学分析为手段，结合基础和临床研究资料，规模化系统鉴定发生表观遗传调控异常的疾病相关基因，确定这些基因在药物筛选与诊断治疗方面的意义。 本项目四个部分，分别侧重于表观遗传学基础问题、肿瘤细胞去分化与增生、神经退行性疾病中神经元的分化与死亡和高通量生物信息学分析，进行较系统的表观遗传学研究，既突出重点，又相互促进。 二、预期目标 总体目标： 本项目瞄准肿瘤与神经退行性疾病的表观遗传学基本问题，整合国内优秀团队，通过从基础到临床，临床到基础二个方向的研究，从染色质水平上揭示表观遗传调控缺陷及其动态变化与胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤及以老年痴呆症为代表的神经退行性疾病发生、发展的关系；阐明引起相关功能基因发生表观遗传调控紊乱的关键信号分子、途径及网络；绘制一个正常生长分化过程中细胞响应内外因子变化而发生分化、功能特化及死亡，连接受体、转录因子、转录调控顺式元件及染色质修饰酶的运行通路，从而建立研究病理变化的参照系统；获得一批
蛋白质组学在肿瘤研究的应用 姓名：学号 专业：病理学与病理生理学导师： 摘要随着人类全基因组计划（HGP）测序工作的完成, 对基因功能即基因表达产物蛋白的研究已经拉开了序幕。蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平, 大规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰以及蛋白质间相互作用, 是后基因组计划的重要组成部分。肿瘤的发生涉及一系列复杂的分子事件, 蛋白质组学研究手段可以大规模地定量分析细胞内的蛋白质表达水平、翻译后修饰等性质以及定义信号网络中的蛋白质间相互作用, 从而有希望发现控制肿瘤进程的关键分子, 为肿瘤的诊断、分型、药物研制带来新的思路和途径。蛋白质组学为肿瘤的研究提供了新的平台。本文就蛋白质组学研究的技术方法和在肿瘤研究方面的应用做一个综述。 关键词蛋白质组学肿瘤应用 蛋白质组学（Proteomics）是研究一种细胞或一种生物中全部蛋白质的表达、结构、功能等的新兴学科，与基因组学、代谢组学等一起构成了当代生命科学的组学( -omics) 系列。蛋白质组学一般分为表达蛋白质组学( expression proteomics)、结构蛋白质组学( structural proteomics) 和功能蛋白质组学( functional proteomics) 3 个方面。表达蛋白质组学也叫差异蛋白质组学，主要对正常、疾病或药物处理细胞或亚细胞中的所有蛋白质进行定性或定量的研究; 结构蛋白质组学主要研究特定细胞或细胞器中蛋白质及蛋白质复合体的组成，确定其定位并了解蛋白质间相互作用; 功能蛋白质组学是一个较为广义的概念，主要研究蛋白质转录后修饰，为细胞信号转导、疾病机制等提供重要信息。恶性肿瘤的发生是一个涉及多因素、多基因的多阶段病理过程. 以往的研究主要集中在基因组和转录组分析. 随着人类基因组计划的完成, 肿瘤研究开始进入“后基因组时代”, 肿瘤蛋白质组学应运而生. 蛋白质作为基因功能的主要执行者, 一方面在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色, 另一方面在很大程度上决定正常细胞和肿瘤细胞之间的差异(如异型性、恶性特征等).李国庆[1]等参考了他人的研究成果，通过对肿瘤发生与蛋白质表达（谱）的改变、肿瘤与翻译后修饰蛋白质
项目名称：恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机 制 首席科学家：尚永丰北京大学 起止年限：2011.1至2015.8 依托部门：教育部
二、预期目标 总体目标： 本项目瞄准表观遗传学研究的前沿，整合国内优秀研究人员，系统深入地开展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。本项目的总体目标如下：阐明表观遗传关键机制即DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA对基因表达调控的影响；明确表观遗传调控在乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移中的作用；揭示EMT过程中的表观遗传学变化及细胞重编程机制；阐明细胞微环境在肿瘤转移中的作用及机制；整合各种信息数据，描绘乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。通过本项目的实施，建立和完善表观遗传学研究的新的技术体系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新思路、新途径和新靶标，发现几个潜在的可以用于乳腺癌、肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标，并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队。 五年预期目标： 1、发现一批新的组蛋白修饰因子，探明组蛋白修饰与DNA甲基化之间相互作 用的分子机制，筛选一批肿瘤相关ncRNA，鉴定一批具有潜在临床应用价值的肿瘤诊断及治疗的新的ncRNA分子靶标；鉴定一批新的EMT关键调控因子；发现针对转移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。 2、建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术平台和技术体系。 3、培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50名以上、 博士后12名以上。 4、在国际一流杂志（IF>10）发表论文8篇以上，在有影响力的杂志（IF>5）上 发表论文25篇以上。
蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用 摘要：前言随着人类基因组测序工作的顺利完成，人们逐渐意识到仅靠基因组的测序来揭示生命现象是远远不够的。蛋白质是基因编码的最终产物，是生命活动的真正执行者，只有从蛋白质水平来研究生命现象，才能从根本上把握生命本质，找到生命活动规律。目前，生命科学的重点己经从转录组学转移到蛋白质整体水平的研究上来。蛋白组学在提供蛋白质动态信息方面具有独特的优越性，其中涉及了蛋白质全面综合的结构和数量变化，而这些变化信息是不能通过基因组学和转录组学获得的。 关键词：蛋白质组学技术；肿瘤特异性分子标记； 转录组学和蛋白质表达之间极其微弱的联系也支持这一观点。尽管人类已经在肿瘤分子水平方面取得了一些成绩，但在其发病机制及早期诊断方面仍不理想，因此寻找准确、无创、有效的肿瘤特异性标记物具有重要的临床意义。蛋白质组学的发展为肿瘤标记物的检测及肿瘤早期正确的诊断提供了新的技术手段。各种疾病的发展过程中往往有蛋白质的动态变化。肿瘤在其不同的发病阶段，即使在没有任何临床症状的早期，在蛋白质水平方面就已经发生了变化，而这些被确认在早期发生的蛋白质变化都有可能发展成为临床早期诊断指标。肿瘤蛋白组学是蛋白组学技术在肿瘤学上的应用，主要就是通过肿瘤发生发展过程中微观的蛋白质改变去寻找理想的生物学标记。 本文着重就蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用予以简要综述。蛋白质组学主要研究技术“蛋白质组”最早是在1995年由MarcWilkinS和KeithWilliamS 在澳大利蛋白质组学技术及其在肿瘤特异性分子标记物中的应用亚Macquarie大学的分析生物技术中心所提出，旨在研究一种个体、一个器官、一个组织、一个细胞或者血清及体液等生理或病理条件下含有的全部蛋白质[3]。由于同一基因组在不同组织、细胞中的表达情况不同，即使是同一细胞，在不同的生理状态、不同的发育阶段甚至不同的生长环境下，蛋白质的表达也各不相同。此外，由于基因组内重组或转录过程中不同的剪接可翻译成不同的蛋白质，且在蛋白质合成之后又会进行一系列翻译后修饰，比如甲基化、硫基化、磷酸化、糖基化及酞基化等[4]。因此，蛋白质组是一个在时间和空间上不断变化的整体。蛋白质组学就是从整体角度出发，利用不同领域的技术工具，探索和实现对各种蛋白质的分离、纯化和鉴定，并且融合这些有价值的信息去分析机体、组织、细胞等动态变化的蛋白质成分、修饰状态、表达水平以及这些蛋白质之间的相互关系，从而揭示和阐明生命活动的基本规律。蛋白质组学研究主要涉及到两个方面:蛋白质表达模式的研究和蛋白质组功能模式的研究[51。目前主要集中在蛋白质表达模式也即是蛋白质组组分的研究，主要涉及到的技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、生物信息学。蛋白质分离技术主要由双向凝胶电泳、色谱分离技术及蛋白质芯片技术等。蛋白质鉴定技术主要包括氨基酸分析法、Edman降解法、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI一TOF一MS立、液相色谱电喷雾电离串联质谱(LC一ESI- MS/MS)等。 蛋白质组学分离技术 双向凝胶电泳系统双向凝胶电泳(2一DE)技术是较为传统的蛋白质组学研究方法，可以完成对蛋白质的有效分离和半定量分析脸。2一DE中，第一相是根据蛋白质的等电点差异，通过等电位聚焦来实现分离的。随后，其第二相则是根据蛋白质相对分子量的不同，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离。2一DE是目前最常用的蛋白质分离技术，通常伴随着质谱分析技术共同运用，选取兴趣点之后进行消化，然后运用质谱技术进行分析。尽管其具有高通量、高分辨率及高灵敏度等优点，且图像比较容易分析，但该项技术还存
组蛋白修饰的研究方法 一、背景 许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM （即甲基化，乙酰化，泛素化和SUM 化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域却是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/ 或核小体改构复合体来实现。 组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下 也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此, 组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响PTM特异性结合蛋白的相 互作用将继续成为重大的研究领域。 确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴侣。这里所描述的方法将对这些方面进行总结，其中包括了详述组蛋白纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的PTM结合蛋 白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总结。二、组蛋白修饰的研究方法 ①细胞裂解 通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDSLaem m样品缓冲液提取
得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言，离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样；然而需要注意的是，一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。然而, 如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分，将可溶性的全细胞提取物留在上 清中。 ②组蛋白富集 在一些实际应用中，有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白；富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细胞或者酵母中提取细胞核十分简单，基本上只需要三个步骤：低渗膨胀（酵母要先将细胞壁消化掉以后）、利用机械力剪切进行细胞膜裂解（例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡）和通过离心分离细胞核（图1A）。染色质粗分离也是很简单的，只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可（图1B）。 ③组蛋白纯化 一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的，并且易于遵循。在这里介绍的方法中，组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的，然后通过柱层析纯化（图1C）。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的，可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有 组蛋白的组分就可以用三氯乙酸（TCA来沉淀，并且如果需要的话，可以通
锐·聚焦 随着生物医学科学技术 的进步和人们对健康 期望的提高，人类开始步入精准医疗时代。 何为精准治疗 精准医疗是在现代医学的基础上，随着对核酸、蛋白质等生物大分子进行深入研究，开始在基因组学和蛋白质组学的水平上把握疾病的发生、发展规律，从而建立起来的个体化精准诊断、精准治疗和精准预防的技术体系。精准医疗类似于个体化医疗，又不同于个体化医疗。个体化医疗只强调不同个体需要不同治疗方案，但其治疗靶标和有效物质等 都可以是模糊综合的，如中医的药方虽然是因人而异的，是个体化的，但这不是精准医疗。而精准医疗是建立在对个体基因组信息和病变细胞体细胞突变信息以及相应的蛋白质组信息基础上的，强调个体、疾病、靶标和药物有效成分的精准性。它是在分子水平上全面把握控制疾病的发生、发展与转归的一系列精准预防、精准诊断和精准治疗的技术体系；是建立在对人、病、药物深度认识基础上采取的高水平医疗技术。这就比个体化医疗更重视“病”的深度特征和“药”的高度精准性。人类期待精准医疗能够推动难治性疾病，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等的治疗水平，进一 10
科学24小时Science in24hours 步提高人类生活质量，延长人类预期寿命。有专家预测精准医疗有可能让人类健康生活到120岁。 精准医疗研究是一个巨大的工程，不仅需要强大的生物化学与分子生物学技术，而且还需要强大的计算技术和大数据处理技术。设想一下：平均每个成人拥有几十万亿个细胞，每个细胞平均拥有几百到几万种蛋白质，蛋白质分子个数成千上万。每一个细胞都有“喜怒哀乐”，每一个分子都有生老病死，都会“谈情说爱”。因此，从微观上看，我们的体内存在着细胞“社会”和分子“社会”。每一个细胞都是一个分子王国，各种各样的分子在这个王国里扮演着各自的角色。DNA就像王国的图书馆，它编码了所有的蛋白质分子。蛋白质是王国的功能执行者，就像具有不同职 业的“臣民”，“工人”、“农民”、“教 师”、“医生”、“律师”等等，根据需要 都有一定的数量要求。如一个细胞 最基本的需要是物质代谢和能量代 谢，葡萄糖分子进入细胞被代谢成二 氧化碳和水，同时释放细胞所需要的 能量。这个过程需要一系列蛋白质 分子催化反应，如葡萄糖激酶等，这 些蛋白质就像细胞内的农民，他们的 职业是生产细胞需要的能量。另一 些蛋白质催化合成核酸和蛋白质的 反应，他们像工人，在消耗能量的同 时，为细胞生存生长（分裂）制造必要 的配件，如DNA聚合酶等。所有蛋 白质分子都是由基因编码的，是在信 使RNA指导下合成的。只是，它们刚 合成出来时只是一条多肽链，这条多 肽链还需要进一步折叠成熟而形成 高级结构才能表现功能。这个过程 中需要一种蛋白质帮助其折叠成熟， 这类蛋白质分子就像教师，如热休克 蛋白。类似于律师的蛋白质如转录 因子，则调控着基因的表达。为保持 王国有秩序地运转，其实还需要一个 “国王”，几十个“大臣”，以及大量行 使各种职能的“公务员”。而这类蛋 白质分子是最难被研究和监测的，因 为我们目前的监测技术还不够灵敏。 何为蛋白质组学 那什么是蛋白质组学呢？蛋白 质组学就是能够分析一个样本里面 的所有蛋白质成分的技术，这个样本 可以是器官的一部分，如心肌、肝脏 等，也可以是一群细胞，如肿瘤细胞 等，也可以是单个细胞。只要分析技 术足够灵敏，我们不仅能够像宏观经 济学一样分析各行各业的就业状况， 甚至能够监测到“大臣”和“国王”是 否在认真工作！人体有2.6万个基 因，按照一个基因可以表达2-10种 蛋白质计算，人体约有20-30万种蛋 白质。这些蛋白质分布在几百条信 号通路的各个节点上，有条不紊地工 作，实现正常的生理过程。人体的疾 病本质上是蛋白质的疾病，是由蛋白 质的结构、活性，蛋白质的数量、比 例，蛋白质的运动等发生错误造成 的。少数蛋白质的变化可以用常规 的生化分析方法测定，如体检中可通 过白蛋白、球蛋白检测肝脏功能，而 碱性磷酸酶与肝癌、甲状腺功能亢进 有关，肌酸激酶与急性心肌梗塞、病 毒性心肌炎、脑炎等有关。因为人体 2016年第11期11
项目名称：恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制首席科学家：尚永丰北京大学 起止年限：2011.1至2015.8 依托部门：教育部
二、预期目标 总体目标： 本项目瞄准表观遗传学研究的前沿，整合国内优秀研究人员，系统深入地开展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。本项目的总体目标如下：阐明表观遗传关键机制即DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA对基因表达调控的影响；明确表观遗传调控在乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移中的作用；揭示EMT过程中的表观遗传学变化及细胞重编程机制；阐明细胞微环境在肿瘤转移中的作用及机制；整合各种信息数据，描绘乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。通过本项目的实施，建立和完善表观遗传学研究的新的技术体系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新思路、新途径和新靶标，发现几个潜在的可以用于乳腺癌、肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标，并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队。 五年预期目标： 1、发现一批新的组蛋白修饰因子，探明组蛋白修饰与DNA甲基化之间相互作 用的分子机制，筛选一批肿瘤相关ncRNA，鉴定一批具有潜在临床应用价值的肿瘤诊断及治疗的新的ncRNA分子靶标；鉴定一批新的EMT关键调控因子；发现针对转移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。 2、建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术平台和技术体系。 3、培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50名以上、 博士后12名以上。 4、在国际一流杂志（IF>10）发表论文8篇以上，在有影响力的杂志（IF>5）上 发表论文25篇以上。
蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向，以聚乙二醇(PEG)为修饰剂和以蛋白质为修饰剂是该技术的两个主要类型。 PEG修饰技术发展成熟，已经有几种PEG-蛋白质药物经过FDA认证。为了有效地检测和分离修饰产物，本论文首先用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效凝胶过滤、高效反相层析方法检测PEG修饰蛋白的组成。随着PEG分子量的减少和被修饰蛋白分子量的增大，这三种常用方法的分辨率都相应降低。重点考察了PEG修饰蛋白的SDS-PAGE 电泳过程，发现不带电的PEG分子在SDS胶束的作用下参与了电场运动，从而导致分辨率下降。改用没有SDS的非变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)后分辨率显著提高，未与白蛋白连接的PEG不参与电场运动，未修饰HSA和不同修饰程度的PEG-HSA偶联物得到有效的检测和分离。 进行了膜分离PEG修饰和未修饰蛋白质(和多肽)的考察。被修饰物质的分子量和结构对分离效果有影响，低分子量的小肽可以通过膜分离与PEG-小肽偶联物完全分开。传统的PEG反应方法中，产物是未修饰小肽(5％)、单修饰产物(42％)、二修饰和多修饰产物(53％)的混合物，而将膜分离与PEG修饰反应耦合，及时将PEG修饰产物移除，小肽100％转化成为单修饰的目标偶联物。说明反应和分离耦合是提高PEG修饰反应产量和降低成本的有效途径。 从理论上讲，与PEG修饰相比，蛋白质类修饰剂具有代谢途径明确、可以提供靶向性和其他的生物活性的优点。但是，蛋白质-蛋白质偶联反应的产物不均一、产物评价困难限制了其发展。本文以戊二醛为交联剂采用人血清白蛋白(HSA)修饰血红蛋白，对修饰过程进行了探索。 考察了人血清白蛋白和血红蛋白的戊二醛一步交联反应，发现pH是影响反应的关键因素。在蛋白质的等电点附近发生蛋白质自身的聚合反应，而在两种蛋白质的等电点的平均值附近，两种蛋白质的偶联反应被促进。并且，参与反应的蛋白质的结构和相互作用对产物组成有很大影响。据此，建立了四种方法制备人血清白蛋白和血红蛋白的偶联物。分别是：(1)分步法偶联血红蛋白和人血清白蛋白：基于血红蛋白的结构特点，先用戊二醛分子内交联血红蛋白，转化率95％，效果接近于使用专一的血红蛋白分子内交联试剂DBBF；然后，分子内交联血红蛋白与人血清白蛋白偶联，血红蛋白和人血清白蛋白1∶1目标偶联物产率34.5％，副反应产物占4％。反应时间为11个小时。(2)拥挤效应辅助偶联血红蛋白和人血清白蛋白：采用聚乙二醇作为拥挤试剂，空间上分布和间隔参与反应的蛋白，提高蛋白的局部浓度。血红蛋白和人血清白蛋白1∶1目标偶联物产率35％，副反应产物占4％。反应时间2个小时。(3)凝胶过滤层析柱上偶联血红蛋白和人血清白蛋白：采用凝胶过滤柱动态分离形成的目标偶联物，反应时间和产物组成均与层析速度有关。(4)甘露醇-硼酸-硼砂缓冲液络合体系偶联血红蛋白和人血清白蛋白：络合体系起到切换反应pH和促进反应的作用，血红蛋白和人血清白蛋白的偶联物产率45％，血红蛋白和人血清白蛋白各自的聚合副反应被抑制。反应时间为5个小时。与已有的价格昂贵的异型双功能交联剂偶联和耗时的二步偶联方法相比，以上四种策略都可以达到低成本、高效率制备人血清白蛋白和血红蛋白偶联物的目的，为这种人血清白蛋白-血红蛋白新型血液代用品的发展打下基础。 另外，还研究了使用乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)偶联人血清白蛋白和胰岛素。由于分子链长，EGDE在活化人血清白蛋白的时候没有二聚体和多聚体形成。利用该性质简化了人血清白蛋白的活化工艺，制备了均一的人血清白蛋白-胰岛素偶联物，在稳定性等方面明显优于天然胰岛素。