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辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立
作者：曾泉满益龙陈岳张鑫张卓李成刚杜娇张德咏刘勇谭新球
来源：《植物保护》2019年第04期
苹果与炭疽菌的相互作用及病害机制研究综述 （杜友伟，西北农林科技大学，陕西，咸阳，712100） 摘要 炭疽病是世界范围内普遍存在的一种真菌植物病害，尤其在热带、亚热带地区，寄主范围广泛，可危害各种农作物、林木、经济作物、瓜果蔬菜等，造成严重的经济损失。果实采后腐烂是一个全球性问题,已引起世界范围的极大关注。苹果炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是苹果上的主要病害,引致苹果采后腐烂严重。木文从从保护生态环境和农业可持续发展的角度出发，以苹果采后炭疽病为研究对象，利用物理的、化学的、生物的和农业的无污染防除技术及分子鉴定诊断技术，逐步组建苹果采后炭疽病可持续控制的病害防御体系。 关键字：刺盘孢属；苹果；炭疽病；机制；综述 The review of the disease mechanism and the interaction between apple and Colletotrichum gloeosporioides (Youwei Du, North-west A&F University, Yangling, Shaanxi, 712100, China) Abstract Anthracnose is an important pathogenic fungus with a wide range of hosts, especially, which happened in tropical and subtropical regions, and can damage a variety of crops, trees, cash crops and vegetables to modern agricultural production caused serious economic losses. Postharvest fruits rot is a global problem. Apple is an important fruit worldwide. Apple postharvest authrancnose(bitter rot) caused by Colletotrichum gloeosporioides is a destructive disease of apple fruit in production areas; it can cause serious yield loss. Currently, it is important that the techniques of physical, chemical, biological, cultural control and molecular diagnosis for apple authrancnose were used to assembly a sustainable apple bitter rot control system, with aim at ecological environment protection and sustainable agriculture development. Key words: Colletotrichum, Apple, Apple bitter rot, Mechanism, Review 果实采后腐烂是一个全球性问题，已引起世界范围的极大关注。在国内相当长时间内没有得到相应的重视,但随着人民生活水平的提高，我国果业的发展及采后腐烂损失的加剧，对果实采后的病害问题已日益受到重视，果实采后腐烂原因主要是果实在采后、加工、运输、贮存、销售过程中，病原菌侵染所致（张维一和毕阳1995）。 苹果是我省主要水果之一，苹果炭疽病是苹果上的主要病害，又名苦腐病，是导致苹果果实腐烂的重要病害，引起炭疽病的病原菌主要是Colletotrichum gloeosporioides（束怀瑞1999）。苹果炭疽病具有潜伏侵染的特性，果实在幼果期就可被感染，但在近成熟时才开始发病，采收后在贮藏期继续发生，致使采前大量落果和贮藏期中的果实腐烂（董金皋2001）。苹果炭疽病发生的范围极广，中国则以华北以西北、黄淮、西南等地区为主。1856年，苹果炭疽病首次被英国学者Berkeley报道，并对其进行了描述（Southworth 1891）。到1992年以后，苹果炭疽病相继在各国苹果产区（热带，亚热带以及温带）大范围发生，包括韩国、加拿大、日本、北欧等，目前已成为影响世界苹果产量的重要病害之一（álvarez 2005; Lee et al. 2006; Martin 1999）。 苹果炭疽病研究进展 病原菌分类 苹果炭疽病菌的无性阶段为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），属半知菌亚门，
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究 HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae) 的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。 这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。 产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。 我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素, 传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。 利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高 产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。 为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规 优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果：1.选用了生产上广泛应用的
一、炭疽病是园艺植物常见而重要的病害。主要危害叶片、果实，也可危害枝梢。 二、病原属真菌半知菌亚门炭疽菌属 分生孢子盘、分生孢子梗（无色）、分生孢子（单孢，无色，长椭圆形或新月形）、刚毛（褐色、具分隔）。有性阶段为小丛壳属。自然条件下少见。 病状：叶片发病初期出现针头状大小的斑点，周围有黄色晕圈带。病菌多从叶尖或叶缘侵入，病斑扩大后可形成圆形、椭圆形或不规则形的斑块。病斑呈深褐色至灰白色，有轮状斑纹，边缘黑褐色，稍隆起，病部中央散生或轮生褐黑色小点，潮湿的天气出现粉红色胶状物，此即为病菌的分生孢子盘和分生孢子。最后病叶黄病化脱落. 病状简述：引起叶斑、落叶，果实腐烂（病斑多凹陷），枝梢枯死等。 病征简述：病部易长黑色小点（分生孢子盘），典型的排成同心轮纹状，有的散生，潮湿条件下溢出粉红色黏孢子团。 瓜类炭疽病 主要危害黄瓜、西瓜、甜瓜，也可危害其他瓜类，南瓜、丝瓜比较抗病。 症状以黄瓜为例，在幼苗和成株期都可危害。 幼苗子叶产生圆形或半圆形稍凹陷、褐色病斑；茎基缢缩、猝到。 成株期叶片黄褐色至红褐色近圆形病斑，边缘有黄晕，有不明显的小黑点，粉红色黏质团，叶枯焦。茎蔓、叶柄病斑梭形或长圆形，灰白色至黄褐色，凹陷或纵裂，有时生粉红色小点，造成叶萎垂，茎蔓枯死。瓜条病班凹陷、小黑点、粉红色黏质团、变形。 瓜类炭疽病发病规律 发病条件 气候在10-30℃可发病，当温度22～24℃，空气湿度大，相对湿度87%-98%时易发病，潜育期3天。湿度是诱发该病的主要因素，相对湿度95%以上发病重。南方5-6月，北方7-9月易发病。 栽培管理连作地，氮肥过多，大水漫灌，保护地通风不良，湿度过大，光照不足等。 生育期植株生长中后期危害较重，瓜果随着成熟度抗性降低。 瓜类炭疽病防治措施 1.选用抗病品种 2.苗床和棚室消毒苗床用40%五氯硝基苯与50%多菌灵1：1混合，按8克／平方米拌细土作垫土和盖种。棚室消毒用硫黄粉熏蒸一夜。 3.种子处理（温汤浸种、药液浸泡）从无病株采种；55℃温水浸种15min，降温后催芽；或50%多菌灵浸种30分钟。 4.加强栽培管理与非瓜类实行3年以上轮作，防止地面渍水，深沟高畦，施足底肥，增施磷、钾肥。 5.药剂防治①喷雾法用喷克、百菌清、炭疽福美、安克锰锌、施保功、武夷霉素等。②熏烟法保护地用百菌清烟剂熏蒸。 园林植物发病规律 1.病菌以菌丝或分生孢子盘在病组织或落叶上越冬。 2.每年3月上旬分生孢子成熟，随风雨溅散、漂移传播,从伤口侵入。 3.病菌大多为害植株下部叶片。缺肥、缺水、叶片失绿时，最易感病。 园林植物炭疽病防治方法 1. 适时施肥、淋水，促使植株健壮，增强抗病能力。 2. 随时清除地上、地下病叶，集中烧毁，以减少侵染来源。 3. 发病前喷1%波尔多液保护，发病期间可喷洒50%炭疽福美可湿性粉剂500~600倍液、25%炭特灵可湿性粉剂500倍液或30%氧氯化铜悬浮剂+80%代森锰锌可湿性粉剂等量混合物的1000倍液。 上述药剂最好交替喷洒，连续多次，效果最好
农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系 Steve Millam 摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。 1．介绍 马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。 目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。
炭疽病 一、概况 炭疽（Anthrax）是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的一种人与动物共患传染病，主要存在于食草动物和牲畜群落之中，并能造成环境的广泛污染。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，造成这种污染常持续存在。 二、流行病学 炭疽的传染源主要是食草动物，如牛、马、羊、驴、骡，其次是猪、犬、猫等，人是次要的传染源。病畜主要经尿和粪便排菌，病畜死亡后其皮毛、血液及肉中含有大量炭疽杆菌。人的炭疽往往在畜疫发生后随之出现，传播途径有三：1、直接或间接接触病畜及其染菌的皮毛等，引起皮肤炭疽；2、吸入含有芽孢的尘埃引起肺炭疽；3、进食病畜的肉、乳及带菌的水引起肠炭疽。在牧区及特殊情况下（如水灾时），应特别警惕炭疽的传播与流行。 该菌主要从皮肤侵入引起皮肤炭疽，使皮肤坏死形成焦痂溃疡与周围肿胀和毒血症，也可引起肺炭疽或肠炭疽，均可并发败血症。传播途径：直接或间接接触病畜和染菌的皮、毛、肉、骨粉等可引起皮肤炭疽；吸入带芽孢的尘沫可引起肺炭疽；进食带菌肉类可引起肠炭疽。（一）传染源主要为患病的食草动物，如牛、羊、马、骆驼等，其次是猪和狗，它们可因吞食染菌食物而得病。人直接或间接接触其分泌物及排泄物可感染。炭疽病人的痰、粪便及病灶渗出物具有传染性。 （二）传播途径 1．经皮肤粘膜由于伤口直接接触病菌而致病。病菌毒力强可直接侵袭完整皮肤。 2．经呼吸道吸入带炭疽芽胞的尘埃、飞沫等而致病。 3．经消化道摄入被污染的食物或饮用水等而感染。 （三）人群易感性人群普遍易感，但多见于农牧民、屠宰、皮毛加工，兽医及实验室人员。发病与否与人体的抵抗力有密切关系。 （四）流行特征在动物和人群间发病有一定关系，造成家畜流行的诸因素也与人群中流行的因素有关。本病世界各地均有发生，夏秋发病多。 三、临床表现 由于感染途径不同，炭疽的临床表现多样。炭疽的潜伏期一般为1-3天。 1．体表感染型（皮肤）炭疽： 主要经皮肤破伤感染，偶有被昆虫叮咬或经黏膜感染者，约占90%以上炭疽病例为体表感染型（皮肤）炭疽。在面、颈、手或前臂等暴露部位的皮肤出现红斑、丘疹、水疱，周围组织肿胀及浸润，水泡破裂形成溃殇，有黏性渗出液但无化脓，继而中央坏死形成溃疡性黑色焦痂，焦痂周围皮肤发红，肿胀，有痒无痛，即典型的炭疽痈。常伴有局部淋巴腺炎，体温可升高，有不适、厌食、烦躁、一般尚可活动。及时治疗15-20天即可痊愈，严重者可迁延1月以上，少数发展为败血症，皮肤炭疽病死率不超过3%。 2、经口感染型（肠）炭疽： 主要因摄入染菌食物而感染，与饮食习惯和食品加工有关，如吃羊肉水饺、吃生牛羊肉、嚼风干生肉等均有感染病例报道肠炭疽急性起病，发热，早期可有恶心、呕吐、呕吐物中含血丝及胆汁、腹痛、腹泻，晚期可有血尿或便血。常有颌下淋巴肿大，亦可在空肠形成炭疽痈。全身反应明显，可有不适、烦躁、不安。治疗不及时常因败血症死亡。可累及消化道以外系统。约占3%-6%炭疽病例为经口感染型（肠）炭疽；
十三种杀菌剂对草莓胶孢炭疽菌的室内毒力测定 摘要：在实验室条件下，采用菌丝生长速率法测定了13种杀菌剂对发生在湖北的草莓胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的生物活性。结果表明，供试杀菌剂对草莓炭疽病菌菌丝抑制作用存在明显差异，对草莓胶孢炭疽病病菌毒力最强的是好立克、丙环·咪鲜胺和施保功，其EC50值分别为0.002 2、0.005 6和0.009 3 mg/L，福星、施保克、百泰、世高、凯特、溴菌腈和凯润的EC50值均相对很低，这10种杀菌剂均可作为防治草莓胶孢炭疽病的首选杀菌剂；腈菌唑、翠贝和二氰蒽醌的抑制活性较差，EC50值分别为12.12、17.58和106.99 mg/L。 关键词：草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；毒力测定；杀菌剂；筛选 Toxicity Test of 13 Types of Fungicides for Strawberry Anthracnose in Laboratory Abstract：The bioassay of 13 fungicides against Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.，which caused strawberry anthracnose in Hubei province，was carried out by means of mycelium growth rate method. The results showed that there were big differences in inhibition effects on C. gloeosporioides by various fungicides，among which tebuconazole，the mix of Propiconazol and Prochloraz showed the best effects to strawberry anthracnose with the EC50 value of 0.002 2，0.005 6 and 0.009 3 mg/L respectively，followed by Flusilazole，sporgon，60% Pyraclostrobin Carbatene，Score，Cahrio and Bromothalonil. These 10 fungicides were the first choices to control C. gloeosporioides. And Myclobutanil，50% Stroby WG，dithianon had the least effects with the EC50 value of 12.12，17.58 and 106.99 mg/L respectively. Key words：Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.；toxicity test；fungicide；screening 草莓（Fragaria ananassa Duchesne）有“果中皇后”之称，营养丰富，经济价值很高。自1931年首次报道草莓炭疽病以来，已有多国报道该病的发生，其广泛的传播性和潜在危害已被广泛关注[1]。高温湿润的气候条件适宜该病发生。因此，其对7～8月份草莓生产苗繁育造成的损失尤为严重。我国于1997年由叶正文等[2]首次发现草莓炭疽病，湖北省该病发生越来越重，严重阻碍了草莓产业的发展，尤其是在高温多湿的育苗季节更为严重。目前对该病害的研究主要有叶正文等[2]对抗病品种筛选、龙军等[3-9]对该病原菌生物学特性的研究等，针对防治该病害的农药筛选研究很少。作者力求筛选出对草莓胶孢炭疽病病菌毒力大、抑菌效果好的杀菌剂供生产上使用。因此试验选用13种杀菌剂作为供试药剂，采用菌丝体生长速率法对草莓胶孢炭疽病病菌进行室内毒力测定，以期筛选出对草莓胶孢炭疽病病菌毒力强的杀菌剂，为防治草莓炭疽病提供参考。 1 材料与方法 1.1 供试菌株
禾谷炭疽菌（GLRG）的遗传转化 1、禾谷炭疽菌的分生孢子的准备 1）取活化的禾谷炭疽菌野生型菌丝于PDA培养基， 25℃黑暗培养7d，菌丝长满平板后用于产孢。 2）对禾谷炭疽菌进行产孢，吸取1mL的无菌水于长满炭疽菌菌丝的PDA 培养基中，用提前灭菌的棉签刮断平板上的菌丝，将刮断菌丝的培养皿盖上一 层灭菌的纱布，置于室温中在光照的条件下培养 3-6 d。 3）确认其产孢后，用预先配好的 IM 液体培养基配置孢子悬浮液于 1.5mLEP管中，悬浮液用4 层擦镜纸叠成的小漏斗来过滤。 4）用血球计数板调整孢子浓度，把收集的炭疽菌孢子进行稀释，调整浓度至 1×104个/毫升，孢子悬浮液需要现配现用。 2、农杆菌 AGL-1的诱导转化 1）从-80℃超低温冰箱中取出已经构建好的含有敲除载体的PXEH2.0-GLRG-L1L2菌株进行平板划线，平板中需要加入50μg/mL 利福平和50μg/mL 卡那霉素，在25℃黑暗培养箱中培养2d至长出单菌落。 2）用1μL的微量移液器挑取单菌落于25mL液体LB培养基中，液体LB 培养基中需要加入50μg/mL的卡那霉素和50μg/mL的利福平，将LB培养基放 在28℃摇床中震荡培养48h至OD600为0.1-0.2。 3）吸取800μL已经达到OD值的菌悬液，接种到10mL IM 液体培养基中。
4）将农杆菌的菌悬液和液体IM培养基的混合液放在28℃摇床中，180 rpm，黑暗摇培 6 h至OD600为0.4左右。 3、根瘤农杆菌与禾谷炭疽菌孢子共培养 1）配制IM固体培养基，将90mL的水琼脂用微波炉溶化后，依次加入IM 培养基的各种成分。 2）将IM固体培养基表面铺一层灭过菌的孔径为0.45μm的玻璃纸。 3）将禾谷炭疽菌孢子悬浮液与上述的农杆菌的菌悬液按1:1的比例混合，用微量移液器吸取混合液100μL于玻璃纸的表面，用灭菌涂棒将混合液涂干。 4）在 25℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养 2d。 4、禾谷炭疽菌转化子的筛选与纯化 1）将涂有混合液的玻璃纸从共培养的IM固体培养基上揭下，反向贴于PDA培养基上，PDA中加入潮霉素100 μg/mL，头孢霉素200 μg/mL用于转化 子的初筛。置于25℃恒温培养箱，倒置培养 48h。 2）将玻璃纸从PDA培养基上揭下，在25℃培养箱中黑暗倒置继续培养2d。 3）将长出有扩展的菌丝挑到新的PDA培养基上进行复筛，培养基中潮霉 素100 μg/mL，头孢霉素200 μg/mL，并用微波炉法提取DNA进行PCR验证。4）将验证正确的转化子用滤纸片保存，存于-20℃，用于下一步实验。 各培养基配方：
水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻
实验十目的基因的遗传转化 一、目的基因的表达载体构建 1. 实验目的 本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。 通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。 2. 实验原理 利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。 Gateway技术构建植物表达载体原理 3. 仪器设备 微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。 4. 实验试剂 克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，
侯 瑞，金巧军．禾谷镰刀菌真菌毒素ＤＯＮ生物合成途径及调控机制研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１７）：９－１３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１７．００２ 禾谷镰刀菌真菌毒素ＤＯＮ生物合成途径及调控机制研究进展 侯 瑞１，金巧军２ （１．贵州大学林学院，贵州贵阳５５００２５；２．西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌７１２１００） 摘要：禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要病原菌，其侵染小麦主要产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，简称ＤＯＮ）及其乙酰化衍生物（３Ａｃ－ＤＯＮ／１５Ａｃ－ＤＯＮ）和玉米烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，简称ＺＥＮ）等真菌毒素。综述国内外对禾谷镰刀菌真菌毒素ＤＯＮ生物合成途径及调控机制的研究进展，对能够调控真菌毒素ＤＯＮ生物合成途径的ｐＨ值、碳源、氮源、过氧化物、信号通路等主要机制进行阐述，为控制禾谷镰刀菌真菌毒素提供参考，并为防治小麦赤霉病提供理论基础。 关键词：禾谷镰刀菌；真菌毒素ＤＯＮ；环境因子；信号通路；调控机制 中图分类号：Ｓ４３２．１；Ｓ４３５．１２１．４＋ ５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１７－０００９－０４ 收稿日期：２０１７－０３－１４ 基金项目：贵州省留学人员科技创新项目（编号：黔人项目资助合同［２０１６］２３号）；贵州大学引进人才项目（编号：贵大人基合字［２０１５］６５号）；贵州省科技支撑计划（编号：黔科合支撑［２０１７］２５６７）。 作者简介：侯 瑞（１９８８—），女，陕西延安人，博士，讲师，主要从事植物病害防治研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｙｏｕｈｏｕｒｕｉ１２３＠１６３．ｃｏｍ。 小麦赤霉病是世界性病害，在亚洲、欧洲、北美洲等均有 大流行的报道［ １］ 。在我国，该病主要流行于长江中下游冬麦区、华南冬麦区、黄淮流域冬麦区、东北三江平原春麦区等，能够造成全国范围的大面积减产，是我国小麦的主要病害和重点防治对象。小麦赤霉病不但会造成小麦的严重减产，而且可在感病麦粒中产生大量的真菌毒素，不仅影响小麦的品质 和质量，而且严重危害人、畜的健康［ ２］ 。真菌在生长极其缓慢、完全停止或遇到外界压力的情况下可产生次生代谢产 物———真菌毒素［３］ 。禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌［ ４］ ，其产生的真菌毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，简称ＤＯＮ）和玉米烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，ＺＥＮ）。单端孢霉烯族化合物（ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ，简称ＴＣＴＣｓ）分为类型Ａ和类型Ｂ。类型Ａ包含毒素Ｔ－２、ＨＴ－２、二乙酰蔗草镰刀菌烯醇（ ｄｉａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ，简称ＤＡＳ）等；类型Ｂ包含ＤＯＮ及其乙酰化衍生物（３Ａｃ－ＤＯＮ／１５Ａｃ－ＤＯＮ）和雪腐镰刀菌烯 醇（ １４－Ｏ－ａｃｅｔｙｌＤＯＮ－４－ｎｉｖａｌｅｎｏｌ，简称ＮＩＶ）等［５］ 。Ｂ型单端孢霉烯化合物类毒素能够延缓或终止蛋白的生物合 成［３］ 。ＺＥＮ是在禾谷镰刀菌侵染玉米时检测到的毒素，是唯一对人类来说比较温和的真菌毒素［６］。单端孢霉烯族化合 物和玉米烯酮的化学式见图１ 。１ 禾谷镰刀菌真菌毒素ＤＯＮ生物合成途径 禾谷镰刀菌中单端孢霉烯前体合成酶基因ＴＲＩ５是ＤＯＮ生物合成第１步的关键酶。ｔｒｉ５基因敲除突变体致病力显著 下降，病害症状仅在接种的小穗处发生［７］ ，表明ＤＯＮ毒素的 产生并不是初侵染所必须的，但对病原菌在穗部的扩展却非常重要。在过去十多年中，参与ＤＯＮ生物合成的ＴＲＩ基因都已被鉴定出。除了Ｔ ＲＩ１０１和ＴＲＩ１～ＴＲＩ１６外，主要的ＴＲＩ基因全都在一个ＴＲＩ基因簇上（图２）。其中，ＴＲＩ６和ＴＲＩ１０基因调控所有Ｔ ＲＩ基因的转录，ＴＲＩ６基因是主要的转录因子，ＴＲＩ１０基因起次要作用。ＴＲＩ６可与ＴＲＩ１０的启动子相结合并 控制其表达，ＴＲＩ６的表达是自我调控的［８］。ＴＲＩ１、ＴＲＩ４、ＴＲＩ１１基因都能编码Ｐ４５０单氧合酶［９－１１］；ＴＲＩ３基因能够进行Ｃ－１５的乙酰化［１２］；ＴＲＩ７基因能编码４－Ｏ－乙酰基转移酶［１３］；ＴＲＩ８基因能够进行Ｃ－３的脱乙酰化作用［１４］；ＴＲＩ１２ — ９—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１７期
植物病害炭疽病研究概述 [摘要]本文阐述了能引起植物严重病害的炭疽病及病原菌。详细介绍了此病害的危害严重程度、症状及危害我国植物的主要病原菌属：简单介绍了此病原茵的分类地位及其检测方法。 [关键词]炭疽病；研究进展 植物炭疽病(Anthrancnose)在中国现多指由半知菌炭疽属真菌引起的植物病害。炭疽病是一种杂食性和多变性的弱寄生或腐生真菌。其分布广泛，寄主繁多，是植物病害中重要病原之一。它是针阔叶树上一类很普遍的病害，通常出现在春季和夏季，主要危害木本植物地上部分的叶片和果实，引起早期落叶落果。有些炭疽菌同时也能直接侵害小枝或嫩梢，致使枝梢枯死，有些树木同时出现几种症状。同时它还危害果树、蔬菜、药用植物、花卉和大田作物等的果实、茎、叶和幼苗，引起烂果、枝枯、叶斑、死苗等。炭疽病一般可直接在寄主上产生无性阶段，有性阶段很少见到，但也有例外，譬如杉木炭疽病就易产生有性阶段，将杉木针叶置于潮湿的环境下，可产生子囊壳：另外山矾炭疽病菌在寄主上也存在很好的有性型。据Arx的研究结果，炭疽菌无性阶段是炭疽菌属Colletotrichum Corda，它是Glomerella Spauld，Et Sehrenk的唯一分生孢子时期。 炭疽菌的分类研究已有200多年的历史，随着真菌学的研究进展，炭疽菌类真菌在属和种的命名上以及分类方法上都曾经发生过重大变更，尤其是在1970年以前。Colletotrichum是由Corda根据模式种C.lineola描述的。Saccardo把该属归人黑盘孢目(Melaneoniales)，认为C.1ineola是Vermicularia的一个发育时期。Vermicularia是由Tode根据3个种建立的属，其中只有一种具有炭疽菌的特征。据后来研究，Fries当时的含义Vermicularia是一个庞杂属。 Gloeosporium是Desmazieres和Monta~ne依据模式种G，eastagnei Desm，et Mon在1849年建立的无色单胞属，SaccardoP.A通过研究发现，G.castagnei的分生孢子不是单胞而是双胞，因此，又以这个种作为模式种建立了盘二孢属MarssoniaSacc，。因此，炭疽菌增加到上千种，主要以寄主作为划分种的依据，这种分类方法是从实用的观点出发，不能反映炭疽菌种间的亲缘关系。而且，往往在同一寄主植物属或种上出现数种炭疽菌，从而一度造成混乱。Arx对这2个属的属名及种名进行了考证，废弃了Gloeosoorium，将ColletotrichumCorda作为一合法的炭疽菌属名，并且通过种的重新鉴定，将炭疽菌属划分为13个种和12个专化型，同时查证和列举了大量异名。从而，Arx建立了第1个以形态学为基础的炭疽菌分类系统。经过30多年的实践检验，证明他的分类系统基本上是正确的，并得到世界真菌学界的公认。 Sutton以A分类系统为基础，并在自己的研究实践基础上，提出了以培养特征为主，寄主范围为辅的分类方法其培养特征是指在一般培养条件下，纯培养物的形态学特征和培养特征。以此，Sutton将炭疽菌属划分为19个种和3个种群。国内王晓鸣、李建义根据Arx和Sutton的分类系统，提出了以自然形态特征为
本科生毕业设计（论文） （ 2015届） 农业与食品科学学院 题目：烟草遗传转化体系的建立 学号： 姓名： 专业班级： 2015 年 5 月18 日
本科生毕业设计（论文）诚信承诺书 我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年月日
目录 本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1) 1.1 农杆菌介导法 (1) 1.2 基因枪法 (2) 1.3 PEG法 (2) 1.4 显微注射法 (2) 2 材料与方法 (3) 2.1 试验材料 (3) 2.1.1 植物材料 (3) 2.1.2 菌株和质粒 (3) 2.2 试验方法 (3) 2.2.1 农杆菌的制备 (3) 2.2.2 叶片表面消毒 (3) 2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4) 2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4) 2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4) 2.2.6 根分化 (5) 2.2.7 炼苗-移栽 (5) 2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5) 3 结果与分析 (6) 3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6) 3.2 共培养时间对转化率的影响 (7) 3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7) 3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8) 3.5 转基因植株的分子鉴定 (8) 4 讨论 (9) 参考文献 (9) 致谢 (11)
培养基配方 种子萌发（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入琼脂粉3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl 共培养（1/10×B5） B5 basal salts：0.124g；溶解定容至400ml; 用NaOH调PH至5.5，分装成两个200ml； 121℃灭菌20min；4℃保存； 使用前加： 1000× B5 vitamin stock: 20 μl 6-BA（1 mg/ml）: 40 μl NAA（1 mg/ml）：10 μl MES(1M PH5.2): 1 ml AS(20mg/ml): 200 μl 愈伤组织诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 芽诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却之前，加入4M (NH4)2SO4 625 μl 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 根诱导（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 蔗糖：5g，溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶2.5g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl NAA: 25 μl YEB培养基（农杆菌用可能效果会好些）牛肉膏：2.5g 蛋白胨：2.5g 酵母粉：0.5g 蔗糖：2.5g MgSO4·7H2O: 0.25g 溶解定容至500ml，调PH至7.0； 试剂： 1M MES PH5.2 4M (NH4)2SO4 1 mg/ml 6-BA 1 mg/ml NAA 20mg/ml AS 250mg/ml Cefotaxime 100mg/ml Hygromycin B 以上试剂配好好过滤除菌 B5 B5 Basal salts 3.1 g/l (sigma) B5 vitamine (sigma) 1000×（无菌）
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验 实验目的 烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。