什么是脑缺血?脑的短暂性血液供应不足并出现症状就叫做短暂性脑缺血发作，是一种 常见的急性脑血管病。病人突然发病，类似脑出血或脑梗塞的表现，一般在24小时内完全 恢复正常，常使家人虚惊一场，但可以反复发作。短暂性脑缺血发作病人一般在1～5年内 可能发生脑梗塞。而脑梗塞的病人中的1/3～2/3曾经发生过短暂性脑缺血发作脑缺血 - 再 灌注也可造成脑功能严重受损。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一 定时间后再灌注，慢波持续并加重。颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢发生明显变化，即兴 奋性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)随缺血 - 再灌注时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸(丙 氨酸、γ- 氨基丁酸、牛黄酸和甘氨酸)在缺血 - 再灌注早期明显升高。缺血再灌注损伤 时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，有钙盐沉积， 并可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏、星型细胞肿胀， Nissl 体完整性破坏、胶质细胞、血管内皮细胞肿胀，周围间隙增大并有淡红色水肿液、白质纤维 间隙疏松，血管内由微血栓、髓鞘分层变性，呈现不可逆损伤。 多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemi-a-reperfusion injury)。 缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注，确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下（取决于缺血时间）再灌注反而引起更加严重的后果。这不仅见于临床，而且也为不同种属（兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等）的大量动物实验所证明。这是一种反常（paradox）现象，称之为再灌注损伤（reperfusion injury）。
BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定 发表时间：2016-06-01T16:50:22.310Z 来源：《河南中医》2015年8月作者：吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2 [导读] 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞。 吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2 （1.广州军区武汉总医院神经内科湖北武汉 430070） （2.华中科技大学协和医院神经内科湖北武汉 430022） 【摘要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。结果：小胶质细胞被LPS 经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。 【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4 【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02 The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 Microglia Wu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2 （1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070） （2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022) 【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins. 【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。目前研究证实小胶质细胞来源于单核吞噬细胞系统，因此能够表现出巨噬细胞的很多生物学特征，比如被各种内源性及外源性病理刺激所激活、具有特异性的巨噬细胞表面抗原等等。巨噬细胞的激活途径主要包括经典激活途径和替代激活途径[2], 经典激活的巨噬细胞为M1型巨噬细胞，主要分泌大量促炎因子参予对病原体清除及疾病的炎性损伤过程，而替代激活的巨噬细胞为M2型巨噬细胞，它主要干预炎症的进展、修复损伤组织等。小胶质细胞受到不同的刺激后亦可表现为促炎和抗炎的双重作用，在老年性痴呆、帕金森病、多发性硬化等等神经系统疾病免疫反应中即能分泌具有神经毒性的炎性因子，又能分泌神经营养因子及抗炎因子[3, 4]，它的也因些被区分为M1型或M2型小胶质细胞，但小胶质细胞极化后是否能通过鉴定巨噬细胞的方法来进行鉴别目前仍无明确阐述，研究小胶质细胞极化状态对于通过其干预神经系统免疫性疾病具有重要意义。 1 材料与方法 1.1材料与试剂 BV2小胶质细胞购北北京协和医院基础所细胞中心，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibcol公司，脂多糖及白介素-4购于Sigma公司、小鼠 TNF-α、IL-10、IL-12ELISA检测试剂盒购于Biolegend公司，FITC标记Anti-MMr抗体购于北京雅吉生物公司，Real-time PCR （实时荧光定量）相关试剂盒购买于大连TaKaRa公司。 1.2 RT-PCR引物设计 iNOS、Arg-1、IL-10引物南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下： 1.2 BV2细胞的培养 BV2小胶质细胞系作为研究载体，复苏后将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，以5%CO2、37℃培养箱内培养至细胞贴壁，每隔2－3天传代，当细胞贴壁生长且状态良好后按1×106/ml接种于6孔板。 1.3 BV2细胞分组及给药 细胞分组给药。A组为生理对照组（DMEM）、B组为经典激活组（100ng/ml的LPS诱导24小时）、C组为替代激活组（20ng/mL的IL-
关于脑缺血再灌注损伤机制及治疗 脑缺血再灌注损伤（CIRI）是一种复杂的病理、生理过程。它由多种机制共同参与，如炎性反应，钙离子超载，自由基的过度形成，兴奋性氨基酸的毒性作用等。各个环节，多种因素共同作用，促进CIRI后脑梗死灶的形成及神经功能的破坏。本文，我们将从CIRI发病机制及药物治疗两方面进行阐述。 标签：CIRI；发病机制；药物研究 脑血管疾病是中老年人常见的致残原因。缺血性脑血管病（ICVD），它在脑血管病中的发病概率最高。患者脑缺血持续一段时间后，虽然供血量恢复，但功能尚未恢复，且并发严重的脑机能障碍，称为CIRI。CIRI具有发病机制复杂，病因多样等特点。CIRI不仅危害患者生命及健康，还会给社会及患者家庭带来巨大的精神及经济负担。现今，该病尚缺乏有效的治疗药物[1，2]。故而，研究及探讨疾病的病因及药物治疗方法具有重要意义。本文将就此进行综述。 1疾病的发病机制 1.1自由基自由基损伤脑组织多发于缺血再灌注期[3]。①氧自由基氧自由基过多，可造成核酸、蛋白质及脂质的过氧化，破坏机体膜结构，增加膜结构的通透性，促进核酸断裂、线粒体变性及蛋白质降解。氧自由基过多，还可诱导RNA，DNA，氨基酸等物质交联，减低物质活性。缺血时，机体内源性的抗氧化系统常无显著改变，而脂质过氧化物将显著上升，致使机体氧化、过氧化失衡。再灌注时，产生大量氧自由基，促使脂质过氧化过程继续，加重细胞的损伤。②NO自由基它在CIRI发病中，具有神经保护作用及神经毒性。过量的NO自由基可与超氧阴离子结合，促进DNA氧化，抑制其修复，损伤线粒体，促进机体细胞凋亡。 1.2兴奋性氨基酸的毒性作用（EAA）EAA是重要的兴奋性神经递质[4，5]。脑缺血时，EAA对脑细胞产生毒性作用。EAA是CIRI的重要环节。EAA 包括天冬氨酸及谷氨酸等。脑缺血时，谷氨酸起主要作用。大量谷氨酸激活AMPA 谷氨酸受体，继而激活了磷脂酰肌醇（与Gq蛋白耦联）的信号转导系统，致使细胞的通透性改变，Cl-和Na+大量进入脑细胞，随之，水也被动性的进入细胞，造成脑水肿，最终诱导脑细胞凋亡。 1.3钙离子超载脑缺血时，脑细胞能量代谢障碍，细胞内缺乏ATP，钙离子泵功能失调，钙离子外流减低。谷氨酸大量释放，NMDA受体被激活，致使钙离子内流。细胞无氧代谢，使产H+增加，促进Na+内流，细胞内高浓度的Na+，激活Ca2+/ Na+交换蛋白，进一步加重钙离子内流。细胞内离子的不均衡分布，将破坏脑细胞防御体系[6，7]。①细胞内Ca2+浓度过高，Ca2+积聚于线粒体，损伤线粒体膜，抑制ATP的合成，继而导致能量合成障碍。②Ca2+可激活C和A2，促进磷脂分解，产生白三烯、前列腺素等，对脑细胞产生毒性作用。③Ca2+含量过高，使钙调蛋白含量增加，继而促进弹性蛋白酶、5-羟色胺释放，致使脑
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代 、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
论文题目LPS诱导小胶质细胞活化的模型建立专业（期队） 作者姓名 学号
独创性声明 本人声明所呈交的论文是本人进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同学对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日期：2011 年05 月22 日 论文使用授权 本论文作者完全了解沈阳药科大学有关保留、使用论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳药科大学可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编论文。 签名： 日期：2011 年06 月08 日
摘要 摘要 神经退行性疾病是影响人类健康的一类疾病的总称，包括阿尔茨海默病，帕金森病等。小胶质细胞在中枢神经系统的炎症进程中发挥重要作用。小胶质细胞的适度激活对神经元具有保护作用，然而过度激活的小胶质细胞释放大量的神经毒性因子，如一氧化氮（NO）,而神经毒性因子会导致神经退行性疾病的发生。因此小胶质细胞的活化是多种神经退行性疾病的根本原因。 小胶质细胞过度激活造成神经毒性主要通过两种机制。 1、促炎症刺激物如脂多糖（LPS）激活小胶质细胞，产生神经毒性因子，导致神经元损伤。 2、损伤的神经元释放基质金属蛋白酶 3、α-核突触蛋白和神经黑素等，导致小胶质细胞的活化，即“反应性小胶质细胞增生”过程，进一步造成周围神经元的损伤，形成一种恶性循环进一步加剧神经退行性疾病。 总的来说，不论何种原因引起的小胶质细胞活化都可以推动几种不同神经退行性疾病的发展，即小胶质细胞活化可能是神经退行性疾病的共同机制。抑制小胶质细胞的活化已经成为防治神经退行性疾病的一个重要策略。 优克那非（Y onkenafil）一种新型磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂, 与西地那非结构类似，是一种治疗勃起功能障碍（ED）的安全、有效的药物。 N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种抗氧化剂，能够进入细胞膜，降低细胞内的氧化应激水平。还原性谷胱甘肽（GSH）是细胞自身合成的细胞内主要的抗氧化物质，NAC可以作为合成GSH的前体。 病理模型的建立和药物的治疗都需要确定其最佳作用时间以及最佳作用计量，根据实验数据利用数学建模的思想建立数学模型解决实际问题，是一种精确高效的方法，具体模型的建立及应用见下文。 关键词：神经退行性疾病小胶质细胞NO优克那非N-乙酰半胱氨酸数学建模 I
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
小 小(microglia)是的一种，相当于脑和脊髓中的，是(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20%。小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如，和阿尔兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子(TNF)，，白介素等有神经毒性的物质 前言 小胶质细胞分布于整个中枢系统,是中枢神经系统最小的一种胶质细胞,约占整个胶质细胞的5~10%[1]。作为常驻中枢神经系统的免疫效应细胞,小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作用[2]。Notch信号通路在进化上高度保守,表达于胚胎及成年个体组织,在胚胎发育过程中决定细胞分化命运[3]。改变Notch通路的活性能调节小胶质细胞的活化状态,如激活Notch通路能使小胶质细胞活化并促进炎性细胞浸润从而损伤神经元[4]。因此,改良小胶质细胞的分离纯化及确定Notch信号通路在小胶质细胞中的表达情况,对于离体条件下深入研究小胶质细胞的功能特性及两者之间的联系不可或缺。前身 用碳酸银浸镀法显示的小是中最小的一种胶质细胞。细呈细长或椭圆，从胞体发出细长而有分支的突起，表面有许多小棘突。常规染色见核细长或三角形，染色较深。电镜下小胶质细胞染色深，核扁平或锯齿状，胞质
内较多。小胶质细胞数量少，约占全部胶质细胞的5%。此细胞是定居在脑内的吞噬细胞，在炎症刺激下，其抗原性增强，形态伸展，功能活跃。小胶质细胞在脑内各部分均有分布，在灰质中的数量比在白质中的多5倍。海马、和的小胶质细胞比和的多，而与中最少。对小胶质细胞的起源尚有争议，主要存在两方面的意见:①起源于，包括起源于脑膜中胚层，毛细血管壁的周细胞(pericyte)或血循环中的单核细胞;②起源于，认为脑室室管膜附近有一些幼稚且具有能力的细胞，称阿米巴样小胶质细胞(ameboidmicroglia)，是小胶质细胞的前身。 结构 都是胚胎时期神经管壁的结构部分，因此认为小起源于神经外胚层。Ling(1981年)的实验证明，小胶质细胞起源于血循环中的单核细胞，后者进入发育中的后转变成具有吞噬能力的阿米巴样小胶质细胞。阿米巴样小胶质细胞在吞噬中枢神经系统内一些自然退变的残余物，同时进行繁殖。至中枢神经系统发育完成后，它们变成静止小胶质细胞。当中枢神经系统损伤时，静止小胶质细胞被激活成，与血循环浸入的单核细胞一齐吞噬碎片和退化变性的髓鞘。当损伤痊愈后，它们又恢复为小胶质细胞。在尼氏法与HE染色切片中其形状常有变异，这主要与其进行运动及吞噬异物有关。 效应 小隶属族，被广泛认为是内的主要免疫效应器(Giulian，1987)，参与诸如HIV脑病，，阿尔兹海默病(老年痴呆症)，等人神经系统紊乱疾病(Dickson,1991;McGeer,1993)。小胶质细胞对中枢神经系统损伤反应灵敏，
小胶质细胞 小胶质细胞(microglia) 是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经 胶质细胞的 20%。小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物 质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起 到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿尔兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子(TNF)，一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质 前言 小胶质细胞分布于整个中枢系统,是中枢神经系统最小的一种胶质细 胞 ,约占整个胶质 细胞的5~10%[1]。作为常驻中枢神经系统的免疫效应细 胞 ,小胶质细胞及其介导的神经炎症 在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作 用 [2]。Notch 信号通路在进 化上高度保守,表达于胚胎及成年个体组 织 ,在胚胎发育过程中决定细胞分化 命运 [3]。改变 Notc h 通路的活性能调节小胶质细胞的活化 状态 ,如激 活 Notc h 通路能使小胶质细胞活化并 促进炎性细胞浸润从而损伤神经元[4]。因此,改良小胶质细胞的分离纯化及 确定 Notc h 信号 通路在小胶质细胞中的表达情况,对于离体条件下深入研究小胶质细胞的功能特性及两者之 间的联系不可或缺。 前身 用碳酸银浸镀法显示的小胶质细胞是中枢神经系统中最小的一种胶质细胞。细胞体呈细长或椭圆，从胞体发出细长而有分支的突起，表面有许多小棘突。常规染色见核细长或三角形，染色较深。电镜下小胶质细胞染色深，核扁平或锯齿状，胞质内溶酶体较多。小胶质细 胞数量少，约占全部胶质细胞的5%。此细胞是定居在脑内的吞噬细胞，在炎症刺激下，其 抗原性增强，形态伸展，功能活跃。小胶质细胞在脑内各部分均有分布，在灰质中的数量比 在白质中的多 5倍。海马、嗅叶和基底神经节的小胶质细胞比丘脑和下丘脑的多，而脑干与小脑中最少。对小胶质细胞的起源尚有争议，主要存在两方面的意见:①起源于中胚层，包括起源于脑膜中胚层，毛细血管壁的周细胞(pericyte) 或血循环中的单核细胞 ;②起源于外胚层，认为脑室室管膜附近有一些幼稚且具有变形运动能力的细胞，称阿米巴样小胶质细胞(ameboidmicroglia) ，是小胶质细胞的前身。
大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1.实验材料 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、 恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO 2 置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等 2.实验步骤 2.1小胶质细胞的混合培养 取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO 恒温细胞培养箱( 37 2 度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。 2.2小胶质细胞的分离和纯化 细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。离心管配
脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展 向军 同济大学医学院，上海（200433） E-mail: Chelsea_JX@https://www.doczj.com/doc/b15905302.html, 摘要：缺血性脑血管是现代社会致死致残的最主要疾病之一，其治疗原则及时恢复缺血区的血液再灌注，而随之而来的再灌注损伤又成为一大难题。笔者对近年来脑缺血再灌注损伤的治疗研究综述如下。 关键词：脑缺血再灌注损伤；治疗；进展 缺血性脑血管病是现代社会致死、致残的最主要疾病之一，其治疗原则是及时的恢复缺血区的血液灌注。然而在某些情况下缺血后再灌注不仅没有使组织功能恢复，反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury），抑制再灌注损伤已成为缺血性中风治疗的重要环节。近年来针对脑缺血再灌注损伤的治疗研究取得一定成果，现将其综述如下。 1．自由基研究 自由基（free radical）是外层轨道上有单个不配对价电子的原子、原子团和分子的总称，其化学性质极为活波，可与各种细胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）发生反应，导致细胞功能障碍和结构破坏。在脑缺血再灌注时，机体的自由基产生和清除系统遭到破坏，导致大量自由基的存在，造成脑组织损伤和功能障碍。由于再灌注治疗窗十分短暂(仅1-3小时)，因此清除自由基应在再灌注前或者再灌注早期即开始。 自由基的清除主要靠自由基清除剂，包括酶性自由基清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、Prion蛋白（PrPc）等;低分子自由基清除剂，如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等；其他如甘露醇、糖皮质激素等。 有研究表明，褪黑素（Melatonin MT）能够清除羟自由基、过氧亚氮阴离子、降低单线态氧毒性和自由基引起的脂质过氧化反应，是有效的自由基清除剂和间接抗氧化剂，具有较好的神经元保护作用[1-2]。Cesario等[3]通过体内外实验观察发现，褪黑素的减轻脑缺血再灌注损伤作用，还与其对胶质细胞的保护作用有关，且胶质细胞对治疗比神经元更敏感。别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过阻止次黄嘌领转化为黄嘌呤，进而阻断自由基的产生。Allport等[4]的实验证明别嘌呤醇能够减少大鼠脑缺血再灌注模型的梗死面积和比率，对脑缺血和再灌注引起的脑损伤都具有保护作用。EGB761是银杏叶提取物的标准制剂，其主要活性物质是24%黄酮苷和6%萜烯内酯，具有较好的抗氧化作用。A. Ur′?kov等[5]的实验证明EGB761能够抑制脑缺血再灌注时的脂质过氧化反应，减轻自由基氧化作用对大鼠前脑的损害。 2．钙超载研究 脑缺血再灌注时，ATP供应不足、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体过渡兴奋介导与其偶联的钙通道开放、细胞膜通透性增大以及Na- Ca2＋交换异常等因素导致细胞内游离钙（[Ca2＋]i）浓度升高。细胞内钙超载一方面使血管收缩，进一步加重脑缺血缺氧；另一方面引起细胞结构和功能的破坏，导致细胞死亡。[Ca2＋]i浓度升高既是脑损伤的后果，同时又是
小胶质细胞原代培养 时间：15天 试剂： 出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只 DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml 胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml 解剖液50ml 1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml 10mg/ml DNA酶70ul 75%酒精200ml 器材： 酒精棉球1杯（20个） 装有75%酒精的敞口容器1个 原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪） 洗净消毒后小瓶3个（带盖子） 小平皿4个（带盖子） 解剖镜+冷光源 消毒后卫生纸12张 1ml移液器1把+枪头1盒 10ml玻璃离心管3个 T75大培养瓶3个 消毒后吸管3根 紫外消毒白大褂1件 试剂配制： 中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。 步骤： 1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜 关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全 2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎 3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟 关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化 4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。 关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中
小胶质细胞与相关疾病的研究现状 摘要：大脑由神经胶质细胞和神经元两类细胞组成。胶质细胞占全部脑细胞的比例随着生物进化程度的升高而增高。在果蝇胶质细胞约占脑细胞的25%，而在人类则占90%，提示其对脑高级功能可能具有重要作用。神经胶质细胞广泛分布于周围和中枢神经系统中，数量远远超过神经元，约为神经元的数十倍[1]。小胶质细胞（miroglia，MG)是胶质细胞的一种，为中枢神经系统中的免疫细胞，是中枢神经系统抵抗病原体入侵的第一道防线。当病原微生物进入脑组织后，小胶质细胞迅速做出反应，识别、吞噬病原微生物，呈递抗原和分泌多种生物活性物质。目前对于小胶质细胞的功能及调节机制研究较多，但是在其对疾病的研究中还不系统。本文将对其在疾病中的功能的研究进展作一综述，为进一步的研究作参考。 关键字：小胶质细胞，神经退行性疾病，中枢神经系统病毒感染 中枢神经系统（central nervous system,CNS）由神经元和神经胶质细胞所组成。神经胶质细胞的数量为神经元数量的 10倍以上,小胶质细胞占神经胶质细胞总数的 5%～20%, 小胶质细胞的数量与神经元的数量相当。小胶质细胞在中枢神经系统内分布广泛, 在脑内各区均有分布。小胶质细胞是脑内固有的免疫效应细胞,被认为是中枢神经系统内的主要免疫效应器, 起免疫监视作用, 能对中枢神经系统损伤
做出级联反应。小胶质细胞的免疫效应功能及分布的广泛性,使其在中枢神经系统稳态的维持和损伤修复的实现中发挥极其重要的作用[2]。 1.生物学特性 小胶质细胞的形态具有高度可塑性，静止时它体小致密呈长形。核中染色质甚浓，核随细胞体的长轴亦呈长形。小胶质细胞在苏木精－伊红染色切片中别具特征；突起短，密布大量小枝形似棘刺[3]。小胶质细胞的数量虽不多,但在灰、白质中都有,有些吞噬的小胶质细胞来自血细胞的生成中的单核细胞干细胞，而不是神经起源的，在受伤后出现许多侵入的噬食细胞。在成年中枢神经系统（CNS）内至少有三种不同功能状态的小胶质细胞：存在于正常CNS内的静止小胶质细胞,病理情况下激活或反应性小胶质细胞,吞噬性小胶质细胞。MG 形态通常为分枝状的，较均匀地分布在各个区域，这种状态被称为静息状态。静息状态的 MG 胞体不运动, 很少表达表面标记，很少释放细胞因子、趋化因子，而且不涉及吞噬作用。静息状态的MG 通过分枝状的、可运动的大量突起完成对脑部微环境的监视作用。当脑部出现外伤、撞击等急性伤害，以及实验诱导的应激及神经退行性疾病模型中，MG的形态发生显著的改变，突起缩短、胞体肥大，被称为“变形虫样”形态，此形态的 MG 被认为处于活化状态。小胶质细胞能表达多种模式识别受体，包括Toll-like受体和“清道夫”受体等，这些受体能够识别入侵中枢神经系统的细菌、病毒和真菌等病原微生物[4]。小胶质细胞活化后释放少量ATP，刺激星形胶质细胞大量释放ATP，诱导自
大鼠四血管阻断全脑缺血模型探讨 作者：blue_snowlotus 近年来，利用啮齿类动物复制全脑缺血模型，在缺血性脑损伤的研究中，特别是在海马缺血选择性易损性的研究等方面应用较为广泛。该模型的共同特点是缺血能暂时广泛的影响各个脑区，但病理改变多发生在选择性易损区域，这在治疗药物的开发研究上应用较多。我做的是大鼠四血管阻断法全脑缺血模型，因此在此主要探讨大鼠四血管阻断全脑缺血模型。 大鼠四血管阻断全脑缺血模型：即双侧椎动脉和双侧颈总动脉阻断，方法有很多，比较公认的是Pulsinelli法，适用于脑缺血的急性和慢性实验研究。该方法需要做两步手术，具体方法是：大鼠10%水合氯醛（300mg/kg,ip）麻醉后，俯卧位固定，在枕骨后切开皮肤，暴露第一颈椎两侧的翼小孔，用尖端直径为0.5mm的电凝器插入翼孔，烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。待动物适应24h 后，在颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭阻断，10-15min后松开动脉夹可恢复血流，进行再灌注实验，以大脑皮层、纹状体和海马缺血最为明显。 模型制作的关键步骤是凝断双侧椎动脉，有些大鼠翼孔很小，电凝器根本插不进去，可以用牙科微型小磨钻，将翼孔扩大，直视下用电凝器凝断双侧椎动脉，用磨钻扩大翼孔也要注意，容易损伤椎动脉造成出血。另外，电凝针插入翼孔的角度也要掌握好，向外下（约于大鼠脊柱正中线呈50度角）插入翼孔，不然容易损伤脊髓。 高血糖可加重脑损伤，增加梗塞面积1.4倍，所以做手术前大鼠禁食12h.还可以防止麻醉过程中呕吐物窒息呼吸道。另外在实验过程中需注意控制脑温，因为脑温每降低10℃，大脑代谢率可降低50％。一般控制在37℃±0.3℃。 判断模型成功的标准很多，最客观的指标应该是多普勒血流检测仪，探头安置于右侧顶叶皮质，深度l mm，监测局部脑血流，一般夹闭颈总动脉后脑血流降低大于5O为模型成功。国内多用的指标是脑电图的检测，银制电极固定于前囟后，中线旁2mm，参考电极可置于对侧对称部位，夹闭颈总动脉30s后脑电图即有变化，逐渐变为等电位线，以脑电图变为等电位线为模型成功标准。另外还有行为学上的成功标准：1min后呼吸加快，动物无反应，意识丧失；翻正反射
胶质细胞原代培养及纯化 原代胶质细胞培养 1）于细胞培养前1d，用% PLL(or PLO)包被培养瓶，置5% CO2培养箱中6 h以上，使用前用HBSS液冲洗3次，备用； 2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中； 3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0. 25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7 min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀； 4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化； 5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多； 6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次； 7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块； 8）1000 r/min×5min，弃上清； 9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL； 10）接种24 h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片； 11）细胞每3 d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5 h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。一般使用17～30d内的星形胶质细胞。