动物细胞培养实验室构建方案
细胞学在生命科学科中起着至关重要的作用，近年来细胞学蓬勃发展，并取得了重大的进展，细胞实验室的构建也是各个院校生物学科必备的实验室。
细胞实验谨慎复杂，需要的实验设备种类繁多，下面就一些动物细胞实验室必备仪器进行简单介绍：
一、CO 2培养箱
CO 2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外
培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O 2浓度等。细
胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO 2
培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。
Thermo Scientific 8000系列CO 2培养箱具有专业的灭菌和抑菌
功能。如140℃，12Hour 干热灭菌，能有效杀死各种微生物；Hepa
过滤器，腔体内达到100级空气质量；不锈钢抛光内胆，有效抑制微生物附着；银离子消毒盒防止水盘中水染菌等，为您的细胞培养保驾护航。
二、纯水系统
细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8M Ω以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿
中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参
与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。
Thermo Scientific Barnstead 纯水机水质稳定有保证，耗材寿命长，运程成本低廉，是您实验室纯水系统优质的选择。
三、超净工作台/生物安全柜
细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。
新加坡ESCO 超净工作台和生物安全柜，为您提供更加安全的防护。
四、液氮罐
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。
图 1 Thermo Scientific 8000 CO 2培养箱 图2 Thermo Scientific Barnstead 纯水机
五、超低温冰箱
细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min ，转放-20℃
1 hour ，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就
必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不
需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。
Thermo Scientific Revco 超低温冰箱具有2台1HP 工业级压缩机，高效的
制冷能力；双风扇设计散热能力快，环境耐受32℃高温不报警；钥匙锁孔
开关，保证样品的安全可靠；以及内门、门锁等人性化设计。Revco 超低温
冰箱70年的历史打造专业和品质，不愧为世界一流品牌。
六、恒温水浴
从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。
七、离心机
细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的分离则需要高速冷冻离心机。
八、移液器和细胞培养的大量耗材
细胞实验中有大量频繁的移液操作，因此各种微量移液器、瓶口分配器、移
液管控制器是必不可少的。各类细胞培养板、细胞培养瓶、移液管等耗材更是不
可或缺的，而且一次性，用量极大。
Brand 是世界著名的移液产品、耗材生产厂家，是欧洲体积计量专家，德国
Brand 移液器是现今移液器市场三大品牌之一。
除上述仪器外，高压灭菌锅、倒置显微镜也是细胞培养的必备仪器，发酵罐、
转瓶机等也常常见于细胞培养实验室。 北京五洲东方科技发展有限公司代理20多个品牌，80多种进口实验室仪器，是实验室通用仪器专家。如Thermo Scientific Revco 超低温冰箱全国独家代理，美国Polyscience 循环水浴全国独家代理，Thermo Scientific 8000 CO2箱全国总代理，德国Brand 实验室移液产品全国总代理，还有德国Sigma 离心机、德国Christ 冻干机、新加坡ESCO 安全柜、超净台、德国Memmert 烘箱等等。
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图 3 Thermo Scientific Revco 超低温冰箱
图 4德国Brand 移液器
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
《制药工艺学》试卷 班级：学号：姓名： 得分： 一、单选题。（每题2分，共30分）是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于 （）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重 法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是 （）倍。 ~10 ~30 C.30~50 ~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半 透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称 为（）A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是 （） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸 11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
《制药工艺学》试卷(A卷) 班级：学号：姓名：得分： 一、单选题。（每题2分，共30分） 1.GMP是（）。 A.药品生产质量管理规范 B.药品经营质量管理规范 C.新药审批办法 D.标准操作规程 2.药品是特殊商品，特殊性在于（）。 A.按等次定价 B.根据质量分为一、二、三等 C.只有合格品和不合格品 D.清仓在甩卖 3.终点控制方法不包括（）。 A.显色法 B. 计算收率法 C.比重法 D. 沉淀法 4.温度对催化剂活性的影响是（）。 A.温度升高，活性增大 B.温度升高，活性降低 C.温度降低，活性增大 D.开始温度升高，活性增大，到最高速度后，温度升高，活性降低 5.中试一般比小试放大的位数是（）倍。 A.5~10 B.10~30 C.30~50 D.50~100 6.利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法是（）。 A.透析法 B.盐析法 C.离心法 D.萃取法 7.液体在一个大气压下进行的浓缩称为（） A. 高压浓缩 B.减压浓缩 C. 常压浓缩 D.真空浓缩 8.下列不属于氨基酸类药物的是（） A.天冬氨酸 B.多肽 C.半胱氨酸 D.赖氨酸 9.下列不属于多肽、蛋白质含量测定方法的是（） A.抽提法 B.凯氏定氮法 C.紫外分光光度法 D.福林-酚试剂法 10.下列属于脂类药物的是（）。 A.多肽 B. 胆酸类 C.胰脂酶 D 亮氨酸11.（）抗生素的急性毒性很低，但副作用较多，另外，对胎儿有致畸作用。 A.四环素类 B.大环内酯类 C.氨基糖苷类 D. β-内酰胺类 12.生产抗生素类药物发酵条件不包括（）。 A.培养基及种子 B.培养温度及时间 C.PH及通气量 D.萃取及过滤 13.下列不属于动物细胞培养方法的是（）。 A.贴壁培养 B.悬浮培养 C.直接培养 D.固定化培养 14.抗生素类药物生产菌种的主要来源是（）。 A.细菌 B.放线菌 C.霉菌 D.酵母菌 15.将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一定时间后产生的分生孢子称为（）。 A. 米孢子 B.种子罐 C.发酵 D. 试管斜面 二、多选题（每题3分，共45分） 1.世界化学制药工业发展趋向为（） A.高技术 B.高投入和高效率 C.高产量 D.高质量 E.高速度 2.下列属于化学制药生产工艺路线改革的有（） A.原料的改革 B.寻找反应薄弱环节 C.反应后处理方法的影响 D.新技术的应用 3.下列哪些是搅拌的作用（） A.加速传质 B.加速传热 C.加速反应速度 D.增加副反应 4.中试放大的基本方法包括（） A.经验放大法 B.相似放大法 C.数学模拟法 D.理论计算法 5.化学灭菌法有（）灭菌法。 A.环氧乙烷 B.湿热 C.表面 D.热空气 6.常用的分离方法有（）。 A.离心法 B.沉淀法 C.回流法 D.过滤法 7.生物药物的主要来源有（） A.动物脏器和植物 B.血液、分泌物和其他代谢产物 C.海洋生物 D.微生物
一．建设方案之动物细胞培养实验室（设备片） 在生命科学科领域中细胞学有着至关重要的地位，近年来细胞学发展迅速，并取得了相当大的进展，细胞学相关实验室的建设也是各个研究院及院校生物学科必备的实验室。 细胞相关实验所需仪器及耗材种类繁多，接下来就细胞培养实验室常用仪器作下简单介绍：一、纯水系统 细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。 二、液氮罐 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。 三、超净工作台/生物安全柜 细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。 四、CO2培养箱 CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。 五、恒温水浴 从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。 六、超低温冰箱 细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min，转放-20℃ 1 hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。 七、离心机 细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成
一、名词解释 1、基元反应：凡反应物分子在碰撞中一步转化为生成物分子的反应称为基元.反应30 2、助催化剂：在制备催化剂时，往往加入某种少量物质，这种物质对反应影响很小，但能显著的提高催化剂的活性、稳定性或选择性38 3、对映体过量：指在两个对映体的混合物中，其中一个对映体相对于另一个而过量的百分数，表征对映体的光学纯度48 4、细胞比生长速率：以单位细胞的生物量为基准，表示该参数的变化速率。是生长速率的标准化，反应了菌体活力的大小128 5、原生质体融合：用去壁酶处理将微生物细胞璧除去，制成原生质体，在高渗条件下用PEG促进原生质体风声融合，再生细胞壁，从而获得具有双亲性状的融合细胞，这一技术称为~ 136 6、化学半合成：由已知的具有一定基本结构的天然产物经化学结构改造和物理处理，生产药物的过程 3 7、化学全合成：由简单的化工原料经过一系列化学合成和物理处理，生产药物的过程 3 8、贴壁细胞培养：贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面。由细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖260 9、单层贴壁细胞培养：指把细胞贴附于一定的固体支持表面上，生长形成单层细胞的培养方法，适合于铁壁依赖性细胞培养262 10、无限细胞系：指寿命和活性都不受传代次数影响的细胞系，可连续培养，也称永久细胞系248 11、有限细胞系：指寿命有限制的细胞，经过若干传代培养后失去繁殖能力，衰老死亡248 12、化学需氧量：是在一定条件下，用强氧化剂使污染物氧化所需的氧量。354 13、类型反应法：指利用常见的典型有机化学反应与合成方法进行合成工艺路线设计的方法22 14、催化剂：在化学反应体系中能改变化学反应速率，而本身在反应前后化学性质并无变化的物质37 15、自然选育：在发酵生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，称为自然选育135 16、促进剂：促进产物生成、但不是营养物也不是前体的一类化合物141 17、穿梭载体：存在于质粒载体上的含有两个亲缘关系不同的复制子结构及其相应的标记基因，能在两种不同种属的宿主细胞中复制并存在的的基因200 18、微载体培养：是一种三维培养系统，有很大的比表面积，细胞贴附于微载体上增值，再悬浮于培养液中，兼有贴壁和悬浮培养的双重优点263 19、前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物，能直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生太大的变化141 二、问答题 1、以薯芋皂素为原料制备氢化可的松的化学合成中，如何控制环氧化、oppenauer 氧化？106 答：（1）控制温度在30℃以下，慢慢加入过氧化氢，保温8小时，当环氧化
姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX 实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX 动物细胞培养技术 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率； 【实验原理】 （一）. 动物细胞培养技术 动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于 单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用 细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离； (2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。 培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直 至第一次传代为止。2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法 细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察 悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代 单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期 培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型 （二）. 细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只
第3章动物细胞培养 内容回顾 重点：细胞分化和细胞全能性 重点：消毒与灭菌方法、细胞培养的基本方法、支原体污染的检测与控制 3.1 动物细胞的特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。 3.1.1动物细胞与微生物细胞的比较 （1）细胞大，无细胞壁； （2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染； （3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感； （4）以聚集体形式存在； （5）原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡。 3.1.2动物细胞与植物细胞比较 共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。 区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿体。 3.1.3动物细胞连接的5种形式： （1）紧密连接（常见） （2）间隙连接（常见） （3）隔壁连接（无脊椎动物细胞） （4）中间连接（脊椎动物细胞） （5）桥粒连接（常见） ***细胞连接（cell junction）： 细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, 协同作用的重要基础。 ***各类连接的比较
3.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 3.2.1定义：动物细胞与组织培养（animal cell and tissue culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 3.2.2分类 动物细胞与组织培养可以分为：细胞培养、组织培养和器官培养。 1. 细胞培养(cell culture):细胞培养是指细胞的体外培养,这是在无菌条件下,将机体内的组 织取出,分散(机械或酶消化)成单个细胞,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死亡等生命现象。细胞培养也包括单个细胞的培养。 2. 器官培养(organ culture):器官培养是指器官的原基(芽胚基)、整个器官或器官的一部分, 在体外条件下保存(维持)或生长,并能分化和保持结构和/或功能。 3. 组织培养(tissue culture):组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。此种方法可有 组织分化及保特组织的结构和/或功能的特点。这里需要说明的是,当我们做组织培养时,不论用什么方法和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长,发生变动的可能性越大。结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。 ***细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。 3.2.3细胞体外培养可分为原代培养与传代培养 原代培养(primary culture):是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 传代培养(subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异。 3.3 发展简史 1907（美）Harrison，用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成。动物细胞组织培养的奠基人） 1912（德）Carrel，用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1943Earle，培养C3H小鼠结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理，获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系，定名为L细胞系。 1548Sanfold，用预先处理的条件培养基成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”并繁殖成克隆株。 1951Gey，用人的宫颈癌组织建立在体外连续培养的人的肿瘤细胞系（HeLa细胞系）。L 与HeLa细胞系是最早建成的细胞系。 1955Eagle研制成人工合成的培养基。 20AD70sSato等人发展了无血清培养。
动物细胞培养·心得 在学习动物细胞培养的过程中，我了解到是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础点，细胞培养是生物医学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。在这次PPT 制作中，我对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的了解，并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问题以及未来的发展方向。为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据 我了解到历史上组织培养技术创建于 18 世纪末，之后于 1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。而动物细胞培养，在1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染；1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年，杜尔贝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。20世纪80年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用 我从资料查得根据细胞种类：原代细胞培养，传代细胞培养。原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养10代后不再增殖，死亡。传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。培