应用方法开发报告：2013-RLC-SH-040 动物饲料中氨基酸分析
一、引言
蛋白质是生命过程的重要物质，是组成机体结构物质(细胞的组成)、体内代谢活性物质(激素、酶、免疫抗体)的主要成分，是组织更新、修补的原料。蛋白质占动物机体因形物总量的50％左右，肌肉、肝、脾、肾等实质器官的蛋白质含量可高达80％以上。由此可见。饲料中蛋白质的供应对畜禽生活和生产具有重要的作用，而蛋白质必须转化为氨基酸后才能为家畜和家禽等吸收利用。但目前少有对饲料中营养成分的研究报道。本研究采用酸性条件下水解饲料中蛋白质，柱前在线衍生与液相色谱紫外联用分析饲料中水解氨基酸。
二、实验部分
2.1 仪器与试剂
U3000液相色谱仪，恒温水浴锅，水解管（20ml）
甲醇、乙腈、水、三乙胺、四氢呋喃、乙酸钠、硼酸、氢氧化钠、邻苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯、3-巯基丙酸、硫代乙醇酸、苯酚、三氟乙酸、盐酸
17种氨基酸混标溶液（除胱氨酸浓度为1.25μmol/ml，其它氨基酸浓度为2.5μmol/ml）
表1 U3000液相色谱仪器配置信息
仪器型号UltiMate3000:
LPG-3400，SN:8014896
WPS-3000TSL, SN:8014671
TCC-3000, SN:801179
DAD，SN:8037084
变色龙?色谱管理软件（Chromeloeon?6.8 SR11）
色谱柱类型Hypersil GOLD C18色谱柱, 4.6×150mm, 5μm, PN:25005-154630，SN:11109020Q4
检测器工作参
数
检测波长：380nm，262nm, 3D扫描：190-400nm，采集频率：5Hz
流动相组成A: 20mM 乙酸钠（加0.018%三乙胺，调节pH值至7.2，再加入0.3%四氢呋喃），B：100mM乙酸钠（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）
进样参数自动进样器，1μl，温度：30o C
柱温设置35o C
表2 梯度洗脱程序
时间（min）B%
0 5
5 10
20 30
23 100
26 100
27 5
32 5
2.2 样品处理
7M盐酸：量取558ml盐酸，用水稀释至1000ml量瓶中，摇匀。
水解催化剂：称取1g苯酚置100ml量瓶中，加入7M盐酸50ml使溶解，再加入10ml 三氟乙酸和20ml硫代乙醇酸，用7M盐酸定容至刻度，摇匀，密封低温（4o C）保存。
饲料样品由第三方动物疾病预防机构提供，为不同类型（预混合、浓缩饲料）的动物配方饲料，含有不同种类的蛋白或氨基酸。
水解：称取0.5g样品转移至真空水解管中，加入1.0ml水解催化剂，充氮保护3分钟，密塞水解管并置于沸水浴上恒温加热8小时，冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调节pH值2-3范围内，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至10ml，摇匀并用微孔（0.22μm）滤膜过滤用于液相分析。
2.3 衍生程序
采用邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在碱性条件下分别与一级氨基酸和二级氨基酸发生反应，生成具有强烈紫外吸收的化合物。衍生过程在自动进样器中进行。
衍生试剂：
硼酸缓冲液（0.4M,pH=10.5）:称取2.48g硼酸和1.41g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100ml 量瓶中。
邻苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)
OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸缓冲液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巯基丙酸
氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）
稀释液：流动相A
衍生过程：0.4M 硼酸缓冲液（5μL）+样品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀释液（8μL）
三、结果
3.1方法专属性
取0.1N盐酸做为空白试剂考察方法专属性，结果见图1和2
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
32.0
-10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
d i l u
e n t
m A U
m i n
W V L :338 n m
图1 溶剂空白图谱
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
32.0
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
l e ve l 5
m A U
m i n A s p
G lu
H is
S e r
G ly T h r
A rg
A la
T y r
C y s
V a l M e
t P h e
Ile
L e u
L y s
P ro
W V L :338 n m
图2 标准品图谱
3.2 线性范围
取氨基酸混标溶液用1%盐酸（约0.1N ）稀释成浓度为0.02、0.05、0.10、0.25、0.50μmol/ml 的溶液，按照前述条件测定其响应值，并与浓度做线性回归，结果见表3。
表3 线性范围测试结果
编号 峰名称 校准类型 相关系数.(%) 截距 斜率 1
Glu
线性，有截距
98.589
0.0056
4.146
2 Asp 线性，有截距 99.225 0.0068 4.095
3 Ser 线性，有截距 98.886 0.0052 4.305
4 His 线性，有截距 99.116 0.0054 2.257
5 Gly 线性，有截距 99.215 0.0072 2.879
6 Thr 线性，有截距 99.256 0.0025 3.989
7 Arg 线性，有截距 99.56
8 0.0038 4.051 8 Ala 线性，有截距 99.322 0.0095 4.153
9 Tyr 线性，有截距 99.112 0.0092 4.051 10 Cys-cys 线性，有截距 98.253 0.0765 1.371 11 Val 线性，有截距 99.236 0.0084 4.246 12 Met 线性，有截距 99.588 0.0053 4.181 13 Phe 线性，有截距 99.322 0.0085 4.088 14 Ile 线性，有截距 99.259 0.0022 4.382 15 Leu 线性，有截距 99.865 0.0003 4.236 16 Lys 线性，有截距 99.982 0.0058 4.869 17
Pro
线性，有截距
98.526
0.0447
1.192
3.3 方法精密度
取对照品溶液，连续进样5针，结果见图3
0.0
5.0
10.0
15.0
20.025.0
32.0
-1020
40
60
80
1001le v e l 52le v e l 53le v e l 54le v e l 55
le v e l 5
m A U
m i n
543211 - 2.052 - 2.37
3 - 6.75
4 - 9.68
5 - 10.56
6 - 11.30
7 - 13.998 - 14.27
9 - 17.63
10 - 21.1711 - 21.7112 - 22.23
13 - 25.1614 - 25.50
15 - 26.93
16 - 28.18
17 - 29.61
W V L :338
图3 标准品重复进样图谱
3.4 方法准确度
按前述方法平行测定饲料样品与加标样品，计算其含量与加标回收率。结果见图4与表4
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
32.0
-10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1
c o n c e n tra t e
d f
e e d
2c o n c e n tra t e d fe e d (s p i k e d )
m A U
m i n 2
1
1 - 10.133
2 - 17.430
3 - 24.957
4 - L e u - 26.600
5 - 28.317
W V L :338 n m
图4 样品图谱（1. 未加标样品 2. 加标样品）
表4 加标回收率（样品名称：鸡浓缩饲料，n=3）
峰名称 含量(μg/ml)
加标量(μg/ml)
测定量(μg/ml)
平均回收率（%）
Glu 0.22 0.25 0.478 103.2 Asp 0.35 0.25 0.603 101.4 Ser 0.12 0.25 0.372 100.6 His ND 0.25 0.251 100.2 Gly 0.25 0.25 0.503 100.4 Thr 0.12 0.25 0.375 102.6 Arg 0.12 0.25 0.372 105.2 Ala 0.08 0.25 0.329 98.6 Tyr ND 0.25 0.248 101.6 Cys ND 0.125 0.123 98.4 Val ND 0.25 0.246 96.4 Met ND 0.25 0.252 101.8 Phe ND 0.25 0.251 100.6 Ile ND 0.25 0.248 99.2 Leu ND 0.25 0.247 98.6 Lys 0.11 0.25 0.362 101.4 Pro
ND
0.25
0.255
102.8
3.5 样品分析
按照2.2项下进行饲料样品处理并分析其中水解氨基酸的含量，结果见表5 表5 样品分析结果 峰名称 浓缩饲料(μg/ml) 鸡预混合饲料(μg/ml)
猪预混合饲料(μg/ml)
猪前期浓缩饲料（μg/ml ）
Glu 0.22 0.16 0.18 0.12 Asp
0.35
0.22
0.18
0.13
Ser 0.12 ND ND ND
His ND ND ND ND
Gly 0.25 0.13 ND 0.12
Thr 0.12 ND ND ND
Arg 0.12 0.21 0.36 ND
Ala 0.08 ND ND ND
Tyr ND ND ND ND
Cys ND ND ND ND
Val ND ND ND ND
Met ND ND ND ND
Phe ND ND ND ND
Ile ND ND ND ND
Leu ND ND ND ND
Lys 0.11 ND 0.12 ND
Pro ND ND ND ND
四、说明
通过上述方法学考察结果分析，本方法具有线性范围宽、专属性强、结果准确，可用于饲料中测定氨基酸含量。
附录
氨基酸溶液响应值比较
来源一：贝因美实验室，17种氨基酸混合标准溶液（胱氨酸为1.25μM/ml，其他氨基酸浓度为2.5μM/ml）
来源二：上海应用中心实验室，外购17种氨基酸混合标准溶液（标称值：胱氨酸为1.25μM/ml，其他氨基酸浓度为2.5μM/ml）
按照正文中衍生方法及色谱条件进行测试峰面积（响应值），结果见下表
表1 不同标液的氨基酸衍生物峰面积比较
峰名称上海实验室贝因美实验室差异（%）
Glu 9.2458 9.5745 3.56
Asp 9.7106 10.7935 11.15
Ser 11.5874 12.2666 5.86
His 8.1287 8.887 9.33
Gly 12.445 13.1737 5.86
Thr 9.5186 10.2456 7.64
Arg 11.0393 12.408 12.40
Ala 10.0249 11.294 12.66
Tyr 9.2907 10.0871 8.57
Cys 0.7822 0.8241 5.36
Val 9.1545 9.7012 5.97
Met 10.01 11.1409 11.30
Phe 9.6037 10.4405 8.71
Ile 9.3926 10.2093 8.70
Leu 10.4085 11.8269 13.63
Lys 19.6506 22.2261 13.11
Pro 0.5674 0.5898 3.95
注：差异（%）=（贝因美实验室-上海实验室）×100/上海实验室
1) 天平一台（精度0.1mg）2) 恒温水浴锅一台3) 容量瓶 4) 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）5) 微量进样器（5μL或10μL）一支 6) 微量可调移液枪（1000μL，200μL）一支、吸头多个。7) 旋涡混匀器一台 8) HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm 5μm） 一. 仪器及试剂 二. 流动相的配制 三. 衍生化反应 1. 对照品溶液浓度值 18种氨基酸分析方法 仪 器： 流动相 A：0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93.0：7.0 流动相 B：水：乙腈＝20.0：80.0 配制方法：准确量取水200mL和乙腈800mL，混合均匀，抽滤过0.22μm滤膜1) 超纯水（≥18MΩ·cm）2) 乙腈（HPLC级）3) 三水合醋酸钠（分析纯）4) 冰醋酸（分析纯） 5) 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）6) 正己烷（HPLC级） 7) 0.1mol/L盐酸溶液：量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。 8) 正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L 盐酸溶液 10mL溶解，混匀。 试 剂： 配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000mL水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50；准确量取配制好的三 水合醋酸钠溶液930mL和乙腈70mL，混合均匀，抽滤过0.22μm滤膜。。
月旭科技（上海）股份有限公司 公司官网：https://www.doczj.com/doc/b410770734.html, 服务热线：400-808-6760 2. 注意事项： 1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液；2）缓冲溶液，隔天需重新配制；3）防止缓冲盐析出。 5）运行一次空白梯度； 6）进样分析；7) 分析完成后： I）用乙腈：水＝20：80代替流动相A ，进水样（清洗自动进样器）， 进行梯度洗脱； II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上。 波 长：254nm 进样量：10μL ｍｉｎ ５1015202530100 80 60 40 20 12 3 45 6 78 9 10 11 12 14 13 1516 17 18 19 色谱图：
蛋白质 ▲蛋白质的化学知识 历史 1.1838, Mulder发现了组成生物体的复杂含氮物。 2.1902, Fischer, Hofmeister同时提出肽键理论。(Nobel，1902) 3.1950, Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：α-螺旋和β-折叠，肽键6个原子在同一平面。(Nobel， 1954) 4.1953, Sanger确定了牛胰岛素一级结构。(Nobel，1958) 5.1961, Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其三级结构, 利用核糖核酸酶的变性和复性 20种氨基酸–一级氨基酸， Primary amino acid ?缩写 丙氨酸（Ala），缬氨酸（Val），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile），脯氨酸（Pro），苯丙氨酸（Phe），色氨酸（Trp），蛋氨酸/甲硫氨酸（Met），甘氨酸（Gly），丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr），半胱氨酸（Cys），酪氨酸（Tyr），天冬酰胺（Asn），谷氨酰胺（Gln），赖氨酸（Lys），精氨酸（Arg），组氨酸（His），天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu） 口诀： ?分类及特性： ?非极性，通过疏水作用稳定蛋白质的结构, Met, Val, Ala, Gly, Ile, Leu ?芳香族氨基酸，相对非极性，都能参与疏水作用。Trp, Try, Phe ?极性不带电：水中溶解度较大或更加亲水，可以与水形成氢键。Ser, Thr, Cry, Asn, Gln, Pro ?植物受到逆境条件的危害，积累Pro。积累一定量的溶质降低水势。Pro主要以游离状态广泛存在于植物中，水溶性最大的氨基酸，具有较强的水和能力。Pro大量积累，含量甚至高达百倍以上。 ?带正电和的三个碱性氨基酸，最为亲水，侧链上有第二个氨基，Arg有带正电的胍基，His有可带电的咪唑基。Lys ?旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。 ?氨基酸的理化性质 ?一般物理性质：无色晶体，熔点较高，溶解度各不同，在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe。测定280nm处的紫外吸收值。 ?两性电解质：同一氨基酸分子上可以同时解离携带正电荷和负电荷，被称为两性电解质ampholyte。氨基和羧基在不同的PH条件下表现出不同的解离状态。电荷总量为零时（净电荷为零），溶液的PH值为等电点 isoelectric point, pI. ? -氨基参与的反应 ?与亚硝酸反应（Van Slyke 定氮） ?与甲醛发生羟甲基化反应，直接测定氨基酸浓度。 ?烃基化反应（DNFB）法，二硝基氟苯法，桑格反应，Sanger reaction, 鉴定多肽N端氨基酸的重要方法 ?烃基化反应（PITC）法。Edman氨基酸顺序分析法。N端测序，苯异硫氰酸酯。能够不断重复循环，将肽链N端氨基酸逐一进行标记和解离。 ?酰基化反应（丹磺酰氯法），N端测序，丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，DNS-Cl
竭诚为您提供优质文档/双击可除氨基酸纸上层析实验报告 篇一：实验六氨基酸的纸层析法 氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、ph 值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=
原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中
一、蛋白质与氨基酸的关系 一般认为，动物蛋白质的营养实质上是氨基酸的营养。只有当组成蛋白质的各种氨基酸同时存在且按需求比例供给时，动物才能有效地合成蛋白质。饲粮中缺乏任何一种氨基酸，即使其他必需氨基酸含量充足, 体蛋白质合成也不能正常进行。同样，体蛋白合成潜力越大的动物（如高瘦肉型猪），对氨基酸的需求量就越高。 畜禽饲粮中必需氨基酸的需要量取决于饲粮中的粗蛋白水平。例如, 仔猪饲粮中蛋白质含量由10%增至22%时, 饲粮赖氨酸的需要量则从0.6 % 增至1.2 % 。另一方面，饲粮粗蛋白质需要量取决于氨基酸的平衡状况。一般而言，依次平衡第一至第四限制性氨基酸后，饲粮的粗蛋白质需要量可降低2-4个百分点。 二、氨基酸间的相互关系 组成蛋白质的各种氨基酸在机体代谢过程中, 亦存在协同、转化、替代和拮抗等关系。 蛋氨酸可转化为胱氨酸,也可能转化为半胱氨酸, 但其逆反应均不能进行。因此, 蛋氨酸能满足总含硫氨基酸的需要, 但是蛋氨酸本身的需要量只能由蛋氨酸满足。半胱氨酸和胱氨酸间则可以互变。苯丙氨酸能满足酪氨酸的需要, 因为它能转化为酪氨酸, 但酪氨酸不能转化为苯丙氨酸。由于上述关系,在考虑必需氨基酸的需要时, 可将蛋氨酸与胱氨酸、苯丙氨酸与酪氨酸合并计算。 氨基酸间的拮抗作用发生在结构相似的氨基酸间, 因为它们在吸收过程中共用同一转移系统, 存在相互竞争。最典型的具有拮抗作用的氨基酸是赖氨酸和精氨酸。饲粮中赖氨酸过量会增加精氨酸的需要量。当雏鸡饲粮中赖氨酸过量时, 添加精氨酸可缓解由于赖氨酸过量所引起的失衡现象。亮氨酸与异亮氨酸因化学结构相似, 也有拮抗作用。亮氨酸过多可降低异亮氨酸的吸收率, 使尿中异亮氨酸排出量增加。此外, 精氨酸和甘氨酸可消除由于其他氨基酸过量所造成的有害作用, 这种作用可能与它们参加尿酸的形成有关。 一、蛋白质与氨基酸的关系 一般认为，动物蛋白质的营养实质上是氨基酸的营养。只有当组成蛋白质的各种氨基酸同时存在且按需求比例供给时，动物才能有效地合成蛋白质。饲粮中缺乏任何一种氨基酸，即使其他必需氨基酸含量充足, 体蛋白质合成也不能正常进行。同样，体蛋白合成潜力越大的动物（如高瘦肉型猪），对氨基酸的需求量就越高。 畜禽饲粮中必需氨基酸的需要量取决于饲粮中的粗蛋白水平。例如, 仔猪饲粮中蛋白质含量由10%增至22%时, 饲粮赖氨酸的需要量则从0.6 % 增至1.2 % 。另一方面，饲粮粗蛋白质需要量取决于氨基酸的平衡状况。一般而言，依次平衡第一至第四限制性氨基酸后，饲粮的粗蛋白质需要量可降低2-4个百分点。 二、氨基酸间的相互关系 组成蛋白质的各种氨基酸在机体代谢过程中, 亦存在协同、转化、替代和拮抗等关系。 蛋氨酸可转化为胱氨酸,也可能转化为半胱氨酸, 但其逆反应均不能进行。因此, 蛋氨酸能满足总含硫氨基酸的需要, 但是蛋氨酸本身的需要量只能由蛋氨酸满足。半胱氨酸和胱氨酸间则可以互变。苯丙氨酸能满足酪氨酸的需要, 因为它能转化为酪氨酸, 但酪氨酸不能转化为苯丙氨酸。由于上述关系,在考虑必需氨基酸的需要时, 可将蛋氨酸与胱氨酸、苯丙氨酸与酪氨酸合并计算。 氨基酸间的拮抗作用发生在结构相似的氨基酸间, 因为它们在吸收过程中共用同一转移系统, 存在相互竞争。最典型的具有拮抗作用的氨基酸是赖氨酸和精氨酸。饲粮中赖氨酸过量会增加精氨酸的需要量。当雏鸡饲粮中赖氨酸过量时, 添加精氨酸可缓解由于赖氨酸过量所引起的失衡现象。亮氨酸与异亮氨酸因化学结构相似, 也有拮抗作用。亮氨酸过多可降
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用
考点一组成蛋白质的氨基酸及其种类（5年6考） 组成蛋白质的氨基酸的结构及种类 观察下列几种氨基酸的结构 (1)写出图中结构的名称 a.氨基； b.羧基。 (2)通过比较图中三种氨基酸，写出氨基酸的结构通式 (3)氨基酸的不同取决于R基的不同，图中三种氨基酸的R基依次为 (4)氨基酸的种类：约20种 ■助学巧记 巧记“8种必需氨基酸” 甲(甲硫氨酸)来(赖氨酸)写(缬氨酸)一(异亮氨酸)本(苯丙氨酸)亮(亮氨酸)色(色氨酸)书(苏氨酸) 注：评价蛋白质食品营养价值主要依据其必需氨基酸的种类和含量。
组成蛋白质的氨基酸的种类与结构 1.(海南卷)关于生物体内组成蛋白质的氨基酸的叙述，错误的是() A.分子量最大的氨基酸是甘氨酸 B.有些氨基酸不能在人体细胞中合成 C.氨基酸分子之间通过脱水缩合形成肽键 D.不同氨基酸之间的差异是由R基引起的 解析甘氨酸应是分子量最小的氨基酸，它的R基是最简单的氢。 答案 A 2.下图为氨基酸分子的结构通式，下列叙述正确的是() A.结构④在生物体内约有20种 B.氨基酸脱水缩合产生水，水中的氢来自于②和③ C.结构④中含有的氨基或羧基全部都参与脱水缩合 D.生物体内n个氨基酸形成一条多肽链需要n种密码子 解析①为氨基，③为羧基，④为侧链基团(R基)。构成人体氨基酸的种类约有20种，A正确；脱水缩合形成水，水中氢来自①③，B错误；R基中的氨基或羧基不参与脱水缩合，C错误；生物体内n个氨基酸形成一条多肽链需要n个密码子而不是需要n种密码子，D错误。 答案 A 解答本类题目的关键是熟记氨基酸的结构通式，如下图所示
找出氨基酸的共同体，即图中“不变部分”(连接在同一碳原子上的—NH2、—COOH和—H)，剩下的部分即为R基。倘若找不到上述“不变部分”，则不属于构成蛋白质的氨基酸。
第2节 生命活动的主要承担者——蛋白质 第1课时 氨基酸及蛋白质的形成 学习目标 1．能写出氨基酸的结构通式并说出其特点(重难点)。2.据图说出氨基酸的脱水缩合及蛋白质空间结构的形成过程(重难点)。 |基础知识| 一、氨基酸及其种类 1．氨基酸的作用 组成蛋白质的基本单位。 2．氨基酸 (1)结构通式： ①写出字母所代表的结构： a ．氨基； b ．羧基。 ②氨基酸的种类、性质不同取决于R 基不同。 (2)氨基酸的种类及分类： ①种类：组成生物体蛋白质的氨基酸约有20种。 二、蛋白质的形成过程 1．蛋白质的结构层次 氨基酸――→脱水缩合 二肽―→三肽―→多肽――→盘曲、折叠 蛋白质 2．蛋白质的形成过程
(1)过程：脱水缩合。 (2)写出序号代表的物质或结构： 产物①：水。 产物②：二肽。 结构③：肽键。 |自查自纠| 1．组成蛋白质的氨基酸都只含有一个氨基与一个羧基，并且连接在同一个碳原子上；每一条肽链至少含有一个游离的氨基与一个游离的羧基。() 2．生物体内组成蛋白质的氨基酸中，有些氨基酸不能在人体细胞中合成。() 3.脱水缩合发生在相邻氨基酸的氨基和羧基之间，H2O中的H来自于—COOH和—NH2，O来自于—COOH。() 4．连接两个氨基酸分子的化学键叫做磷酸键，表示式为NH—CO。() 5．蛋白质由C、H、O、N、P元素组成，只有一条肽链。() 6．组成蛋白质的氨基酸之间可按不同的方式脱水缩合。() 7．生物体内组成蛋白质的氨基酸中，不同氨基酸之间的差异是由R基引起的。() 8．含有两个肽键的化合物称为二肽。() 答案 1.× 2.√ 3.√ 4.× 5.× 6.×7.√8.× |图解图说| ★把氨基酸分子比喻成人，两只手分别代表氨基和羧基，两条腿代表氢，头代表R基，躯干代表中心碳原子 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ★三个同学手牵手连在一起，牵在一起的手代表“肽键”。两端同学的没牵在一起的手分别代表肽链两端游离的氨基和羧基。 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________
20种氨基酸 脂肪侧链aliphatic side 较大的氨基酸是疏水的氨基酸，它们在水中将簇合而不与水接触，可溶，但水溶性较差，脂溶性好。水溶性蛋白质三维结构的稳定性来自于蛋白质疏水氨基酸侧链簇合，即疏水效应。 名称 英文 结构 特性 甘氨酸 glycine /?ɡla??sin,/ 无手性C 丙氨酸 alanine /??l??nin/ 颉氨酸 valine /?v?l?in/ 大脂肪侧链 亮氨酸 leucine /?lu?sin/ 大脂肪侧链 异亮氨酸 isoleucine /?a?s ??lu?sin/ 大脂肪侧链 甲硫氨酸 methionine /me?θai?ni:n/ 大脂肪侧链 脯氨酸 proline /?pro?lin/
苯丙氨酸 phenylalanine/?f?n ?l??l??nin/ 侧链有芳香环,疏水氨基酸 络氨酸 tyrosine/?ta?r ??sin/ 色氨酸 tryptophan/?tr?pt ??f?n/ 丝氨酸 serine/?s?r?in/ 苏氨酸 threonine/?θri??nin/ 天冬酰胺 asparagine/??sp?r ?? d ?in/ 谷氨酰胺 glutamine/?ɡlut??min/ 半胱氨酸 cysteine/ s ?st ??in/ 胱氨酸 cystine/?s?s?tin/ 赖氨酸 lysine/?la??sin/ 精氨酸 arginine/?ɑrd???nin/ 酪氨酸的芳香环有一个羟基。与其他氨基酸侧链呈化学惰性相比，酪氨酸的羟基有化学反应性，疏水性弱。 极性但不带电荷。含酰胺的极性氨基酸 带电荷的氨基酸，高度亲水，侧链长，末端是氨基，在中性pH 时侧链末端带正电荷。 带电荷，高度亲水，侧链长，末端是胍基，在中性pH 时侧链末端带正电荷。
构成蛋白质的氨基酸种类、分子量、功能和作用（一） 序号分类名称 缩写及 分子量 生理功能 必需氨基酸 1 赖氨酸Lys 146.13 促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化； 2 蛋氨酸 （甲硫氨酸） Met 149.15 参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能； 3 色氨酸 Trp 204.11 促进胃液及胰液的产生； 4 苯丙氨酸 Phe 165.09 参与消除肾及膀胱功能的损耗； 5 苏氨酸 Thr 119.18 有转变某些氨基酸达到平衡的功能； 6 异亮氨酸 Ile 131.11 参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；脑下腺属总司令部作用于甲状腺、性腺； 7 亮氨酸Leu 131.11 作用平衡异亮氨酸； 8 缬氨酸 Val 117.09 作用于黄体、乳腺及卵巢； 指人体（或其它脊椎动物）不能合成或合成速度远不适应机体的需要，必需由食物蛋白供给，这些氨基酸称为必需氨基酸。成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的20%～37%。 条件必需氨基酸 9 精氨酸Arg 174.4 它能促使氨转变成为尿素，从而降低血氨含量。它也是精子蛋白的主要成分，有促进精子生成，提供精子运动 能量的作用。 10 组氨酸 His 155.09 在组氨酸脱羧酶的作用下，组氨酸脱羧形成组胺。组胺具有很强的血管舒张作用，并与多种变态反应及发炎有 关。
人体虽能够合成，但通常不能满足正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。人体对必需氨基酸的需要量随着年龄的增加而下降，成人比婴儿显著下降。（近年很多资料和教科书将组氨酸划入成人必需氨基酸） 构成蛋白质的氨基酸种类、分子量、功能和作用（二） 序号分类名称 分子量及缩 写 生理功能和作用 非必需氨基酸 11 丙氨酸Ala 89.06 预防肾结石、协助葡萄糖的代谢，有助缓和低血糖，改善身体能量。 12 脯氨酸Pro 115.08 脯氨酸是身体生产胶原蛋白和软骨所需的氨基酸。它保持肌肉和关节灵活，并有减少紫外线暴露和正常老化造 成皮肤下垂和起皱的作用。 13 甘氨酸Gly 75.05 在中枢神经系统，尤其是在脊椎里，甘氨酸是一个抑制性神经递质。 14 丝氨酸Ser 105.06 是脑等组织中的丝氨酸磷脂的组成部分，降低血液中的胆固醇浓度，防治高血压 15 半胱氨酸Cys 121.12 异物侵入时可强化生物体自身的防卫能力、调整生物体的防御机构。 16 酪氨酸 Tyr 181.09 是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。 17 天冬酰胺Asn 132.6 天冬酰胺有帮助神经系统维持适当情绪的作用，有时还有助于预防对声音和触觉的过度敏感，还有助于抵御疲 劳。 18 谷氨酰胺Gln 146.08 平衡体内氨的含量，谷酰胺的作用还包括建立免疫系统，加强大脑健康和消化功能 19 天冬氨酸Asp 133.6 它可作为K+、Mg+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环 障碍缺氧时，对心肌有保护作用。它参与鸟氨酸循环，促进氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳 的量，增强肝脏功能，消除疲劳。 20 谷氨酸 Glu 147.08 参与脑的蛋白和塘代谢，促进氧化，改善中枢神经活动，有维持和促进脑细 胞功能的作用，促进智力的增加 指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨基酸。 备注：以上简单阐述了各种氨基酸在体内发挥的生理作用，没有阐述其药理和保健作用。以上分类是从营养学角度区分。
氨基酸形成蛋白质的相关数量关系总结 1．链状肽 (1)多肽中各原子数的计算： ①碳原子数＝氨基酸的分子数×2＋R基上的碳原子数。 ②氢原子数＝各氨基酸中氢原子的总数－脱去的水分子数×2＋二硫键数×2。 ③氧原子数＝各氨基酸中氧原子的总数－脱去的水分子数。 ④氮原子数＝肽链数＋肽键数＋R基上的氮原子数＝各氨基酸中氮原子的总数。 ⑤由于R基上的碳原子数不好确定，且氢原子数较多，因此以氮原子数或氧原子数的计算为突破口，计算氨基酸的分子式或氨基酸个数最为简便。 ⑥含2个氨基的氨基酸数＝N原子数－肽键数－1。 ⑦含2个羧基的氨基酸数为：O原子数－肽键数－2 2。 (2)基团数和相对分子质量的计算： ①脱水数＝肽键数＝氨基酸数－肽链数。 ②氨基数＝肽链数＋R基上的氨基数＝各氨基酸中氨基的总数－肽键数。 ③羧基数＝肽链数＋R基上的羧基数＝各氨基酸中羧基的总数－肽键数。 ④蛋白质相对分子质量＝氨基酸平均相对分子质量×氨基酸数－18×脱水数。 2．环状肽 环状多肽主链中无氨基和羧基，环状肽中氨基或羧基数目取决于构成环状肽的氨基酸R基中的氨基和羧基的数目，如下图所示。(Aa表示氨基酸) 由图示可知：肽键数＝脱去的水分子数＝氨基酸数。
1．现有氨基酸800个，其中氨基总数为810个，羧基总数为808个，则由这些氨基酸合成的含有2条肽链的蛋白质共有肽键、氨基和羧基的数目依次为() A．798、2和2 B．798、12和10 C．799、1和1 D．799、11和9 【解析】800个氨基酸中有氨基810个和羧基808个，则说明10个氨基和8个羧基在R基中。800个氨基酸合成的含有2条肽链的蛋白质，其肽键数目＝800－2＝798，氨基数目＝10＋2＝12，羧基数目＝8＋2＝10。 【答案】 B 2．已知天冬酰胺的R基为—C2H4ON，现有分子式为C63H103O31N17S2的多肽，其中含有2个天冬酰胺，那么，此多肽中的肽键数最多是() A．17个B．16个 C．15个D．14个 【解析】由分子式可知，该多肽中含17个N，因所含的2个天冬酰胺的R基中都含有1个N，故该多肽最多由15氨基酸脱水缩合而成，若是链状多肽，应含有14个肽键；若是环状多肽，则含有15个肽键。 【答案】 C 3．某蛋白质由m条肽链、n个氨基酸组成，则该蛋白质至少含有氧原子的个数是() 【导学号：36500023】A．n－m B．n＋m C．n－2m D．n＋2m 【解析】肽键中含有一个氧原子，肽链一端的羧基中含有2个氧原子，每条肽链的氧原子数是氨基酸数＋1，因此n个氨基酸组成的m条肽链至少含有氧原子的个数为n＋m。 【答案】 B 4．如图是由n个氨基酸组成的某蛋白质的结构图，其中二硫键“—S—S—”是一种连接蛋白质中两条肽链之间的化学键(—SH＋—SH→—S—S—＋2H)。则()
20种天然氨基酸 名 称 全 称 缩 写 分 子 量 结 构 丙氨酸 Alanine Ala (A) 89.09 OH O H NH 2 精氨酸 Arginine Arg (R) 174.20 OH O H NH 2 N H H 2N NH 天冬酰胺 Asparagine Asn (N) 132.12 OH O H NH 2 H 2N O 天冬氨酸 Aspartic acid Asp (D) 133.10 OH O H NH 2HO O 半胱氨酸 Cysteine Cys (C) 121.16 SH OH O H NH 2 谷氨酰胺 Glutamine Gln (Q) 146.15 OH O H NH 2H 2N O 谷氨酸 Glutamic acid Glu (E) 147.13 OH O H NH 2 HO O 甘氨酸 Glycine Gly (G) 75.07 H 2N OH O 组氨酸 Histidine His (H) 155.16 OH O H NH 2 HN N 异亮氨酸 Isoleucine Ile (I) 131.17 OH O H H NH 2
亮氨酸Leucine Leu (L) 131.17 OH O H NH2 赖氨酸Lysine Lys (K) 146.19 OH O H NH2 H2N 甲硫氨酸(蛋氨酸) Methionine Met (M) 149.21 OH O H NH2 S 苯丙氨酸Phenylalanine Phe (F) 165.19 OH O H NH2 脯氨酸Proline Pro (P) 115.13 N H OH O H 丝氨酸Serine Ser (S) 105.09 HO OH O H NH2 苏氨酸Threonine Thr (T) 119.12 OH O H NH2 H OH 色氨酸Tryptophan Trp (W) 204.23 OH O H NH2 HN 酪氨酸Tyrosine Tyr (Y) 181.19 OH O H NH2 HO 缬氨酸Valine Val (V) 117.15 OH O H NH2
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解） 氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。 设备 用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。 一般预防策施 在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。 实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。仪器应放置在实验室的空旷区域。保持实验室的卫生干净。根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。限制测试样品瓶开启和关闭的次数，因为飞灰可以提高甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸的浓度。 良好的仪器状态是氨基酸分析结果可接受的一个关键步骤。在日常使
【实验报告第一部分（预习报告内容） ：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：】 一、预习报告 实验原理：
根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。薄层层析是在玻 璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。 薄层层析（ ，）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。 本次实验： ● 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不 一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。 ● 吸附剂（固定相）：硅胶（.）。为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维 素钠（）作黏合剂。 ● 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10）。 ● 展层-显色剂：按照10:1比例（）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。 ● 活化（）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。可使硅胶的活性提高， 吸附能力加强。 ● 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原， 此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 ● 值： 点的距离 对应溶剂前沿到样品原距离 斑点中心到样品原点的 Rf 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（值）也是恒定的，因
红花中槲皮素的含量测定及氨基酸的成 分分析 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 摘要：目的：探讨红花中槲皮素的含量测定及氨基酸的成分，为红花合理利用提供参考。方法：采用高效液相色谱法测定红花中槲皮素的含量；采用萃取分离法分析氨基酸的成分。结果：红花中槲皮素含量平均为0.49mg/g，高效液相色谱法测定在370nm有最大吸收波长，测定精密度与稳定性比较好。从含量上看，谷氨酸的含量5%最高，其次是天冬氨酸、精氨酸，含量最低的是蛋氨酸，缬氨酸、赖氨酸的含量中。结论：高效液相色谱法测定红花中槲皮素具有准确率高、回收率与精密度好等特点，可推广成为中药样品的测定含量方法。而红花中含有多种氨基酸，可提取应用。 关键词：红花；槲皮素；氨基酸；高效液相色谱 红花原名为红兰花，别名为草红花、刺红花、金红花等。具有活血通经、散瘀止痛、降血压和降血脂的功效，用于治疗痛经、跌打损伤、冠心病、心绞痛和高血压等疾病【1】。其主要的化学成分由黄酮类、有机酸类、烷基二醇类、聚乙炔类、吲哚类化合物，还包括
含有查耳酮骨架的色素类成分。药理研究表明，红花能轻度兴奋心脏，降低冠脉阻力，增加冠脉流量和心肌营养性流量【2】。对抗心率失常，抑制血小板聚集，对神经元变性具有强力保护作用。目前红花在临床上已广泛用于预防和治疗冠心病，心肌梗塞，脑血栓等心脑血管疾病【3】。现代药理学实验表明红花中的主要成分槲皮素与一些氨基酸在抗凝血和抗脑缺血方面都具有很好活性【4】。目前，许多国家都在致力于天然药物的研究、开发和利用，我国的传统中药不仅在与国外天然药物的竞争中传统优势地位受到冲击，而且中药在国内市场的生存空间也受到了挑战【5】。为了使我国的传统中药能成功应对国外医药产业的挑战，就必须依靠现代科学技术的方法和手段。本文为此具体详细探讨了红花中槲皮素的含量测定及氨基酸的成分分析，现报告如下。 1 仪器与试剂 红花药材：2011年2月购自四川峨嵋基地，由药物所生药室鉴定。采收季节为七月。经成都中医药大学鉴定教研室鉴定，均符合《中国药典》2000版规定。11OO高效液相色谱仪(G1310A IsoPump)，配套有chemstation数据处理软件的紫外检测器梅特勒-托利多AE240电子天平，上海生工超声波清洗器(中国)。甲醇为色谱纯(天津)，水为重蒸馏水(自制)，其它试剂均为分析纯。槲皮素对照品：中国药品生物制品检定所提供(批号：20090584)，供含量测定用。 2 红花中槲皮素的含量测定 2.1 色谱条件
18种天然氨基酸分析 迪马科技摘要 氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。本文分别以异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯作为衍生剂对蛋白质水解液和游离氨基酸注射液进行衍生，使用Diamonsil AAA柱250×4.6 mm，5 μm，梯度洗脱进行分离，能够满足19种天然氨基酸的分析，各组分分离度较高、定量结果准确而稳定。 Abstract The amino acid determination is an important analysis project in proteomics, food and drug quality testing.The method determination of 19 nature amino acid in protein hydrolyzed solution and free amino acid injection, the derived reagent is phenyl isothiocyanate (PITC) and 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene. The column is Diamonsil AAA (250 × 4.6 mm, 5 μm), gradient elution, the results are accurate and stable. 引言 从化学角度讲，同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪酸均可称为氨基酸。自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生和柱前衍生-反相色谱法分离。后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸，PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。此外，DNFB还能对半胱氨酸进行衍生，对PITC衍生法是一个重要的补充，能够满足氨基酸注射液中涉及的19种氨基酸分析。 1 分析原理 对于含蛋白样品(饲料、动物组织等)，先对样品进行酸水解或碱水解处理，得到游离氨基酸
蛋白质氨基酸分析测试 一、实验课程： 组成蛋白质的氨基酸的定量分析 二、实验项目： 三、主要仪器设备 日立L-8900高速氨基酸分析仪 1 实验目的 用于检测样品中蛋白水解氨基酸、游离氨基酸的种类及含量，广泛应用于食品、纺织等领域检测。 2 仪器用具和材料 L-8900高速氨基酸分析仪、氮吹仪、真空泵、水解瓶等。 3 基本知识 用水解的方法将蛋白质的肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸 在低PH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度 不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸 结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲 液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液 在加热的条件下反应（135度），生成可在分光光度计中检测到的蓝紫色物质外标 法定量。 4 实验步骤： 1水解样品 （1）药液 0.02 N HCI稀释3倍以上（根据氨基酸的浓度）作样品。
（2）蛋白质固体 a 6N-HCI，110℃水解样品24小时。 b 减压干燥，除去HCI。 c 0.02NHCI容量, 0.22um的滤膜过滤（最终浓度以200ug/ml为宜）。 2打开工作站主画面，点击control——instrument status键进入 3 单击connect联机，大约两分钟后初始化完成。 4点击File——Sequence，建立样品表。 5依次输入未知样品顺序、样品号、数据路径、文件名称、样品个数、重复次数。 6 点击下一步，输入样品瓶号、标准瓶号、进样体积、样品间隔数。 7点击下一步，标准品号、路径、文件名、标准品个数、重复次数。 8点击完成，生成的样品表。 9点击File-Method-Open，调用方的。 10点击单一运行(Single Run)，及序列运行(Sequence Run)。 11采样结束后进行数据处理。
氨基酸分析仪实验 测试中心吕雪娟 一、实验目的 了解氨基酸分析仪的主要结构及工作原理，掌握氨基酸分析的过程，前处理方法。 二、原理 氨基酸分析仪的分析原理是基于各种a一氨基酸的酸碱性、极性及分子大小的差异，用阳离子交换树脂在柱上进行层析分离，用几种不同pH值和离子强度的缓冲溶液依次将它们洗脱，从柱子上分离和洗脱下来的各种氨基酸在反应柱中与茚三酮进行加热反应，反应产物用可见光分光光度计进行检测，根据检测信号的大小计算出各种氨基酸的含量。 氨基酸和茚三酮反应
氨基酸分析仪结构示意图 二、操作步骤 1.准备工作 1.1缓冲液和茚三酮溶液的配制及正确放置 1.2氮气压力调整 1.2.1打开氮气钢瓶阀，调节其压力至50－100KPa（0．5－1.0Kgf／cm2）。 1.2.2顺时针轻轻旋转氮气调节器，使压力读数为34-40KPa（0.35－0.4Kgf ／cm2）。 1.2.3脱气瓶中液体的更换 1.3放置自动进样器清洗瓶，向清洗瓶（C-1，1L）中盛上蒸馏水，放置于指定的位置并拧上盖子。 2.开稳压器 3.启动L－8800ASM应用程序 3.1系统初始化，OK 3.2打开Module Operation界面
3.3泵1流速设定----缓冲液的清洗，打开泵1的排液阀；清洗完毕，关闭泵1； 3.4泵2流速设定—一缓冲液的清洗，打开泵2的排液阀；清洗完毕关闭泵2； 3.5自动进样器流路和针头清洗,除气泡，重复此过程三次。 3.6泵的压力归零 4.分析程序 4.1选择应用程序 4.2选择分析方法 4.3输入待测样品的信息，编辑样品表，保存； 4.4打开数据采集监控画面 4.5选择样品表 4.6打开泵1和泵2 4.7按样品表顺序放置样品。 4.8单击监控屏幕下方的Start Series按钮，开始样品测试。 4.9开始结束后，关闭采集监控画面 4.10关闭L－8800ASM应用程序 4.11关电源 三、实验报告要求 1.实验原理及分析条件； 2.实验结果。
蛋白质结构与功能——氨基酸 2010遗传学 Chapter 1 氨基酸 I 蛋白质的天然组成 天然蛋白质几乎都是由18种普通的氨基酸组成：L-氨基酸，L-亚氨基酸(脯氨酸)和甘氨酸。 一些稀有的氨基酸在少量的蛋白质中结合了L-硒代胱氨酸。 II 氨基酸的结果 每种氨基酸（除了脯氨酸）：都有一个羧基，一个氨基，一个特异性的侧链（R基）连接在α碳原子上。 在蛋白质中，这些羧基和氨基几乎全部都结合成肽键。在一般情况下，除了氢键的构成以外，是不会发生化学反应的。 氨基酸的侧链残基（R基）提供了多种多样的功能基团，这些基团赋予蛋白质分子独特的性质，导致： A.一种独特的折叠构象 B.溶解性的差异 C.聚集态 D.和配基或其他大分子构成复合物的能力，酶 活性等等。 蛋白质的功能是与蛋白质氨基酸排列顺序和每个氨基酸残基的特征有关。那些残基赋予蛋白质独一无二的功能。 氨基酸的分类是依照它的侧链性质的 A．非极性侧链的氨基酸 B．不带电的极性侧链氨基酸 C．酸性侧链的氨基酸
D ． 碱性侧链的氨基酸 A.非极性侧链氨基酸 非极性氨基酸在蛋白质中的位置： 在可溶性蛋白质中，非极性氨基酸链趋向于集中在蛋白质内部。 甘氨酸 (Gly G ) 结构：最简单的氨基酸，在蛋白质氨基酸当中，是唯一缺乏非对称结构的氨基酸。 特征：甘氨酸在蛋白质结构中起到一个很重要的作用，与其它氨基酸残基相比，由于缺少β-碳原子，它在蛋白质的构象上有很大的灵活性和更容易达到它的空间结构。 功能和位置： 1. 甘氨酸经常位于紧密转角；和出现在大分子侧链产生空间位阻影响螺旋的紧密包装处（如胶原） 和结合底物的地方。 2. 由于缺乏空间位阻侧链，所以甘氨酸在邻近的肽键的位置有更强化学反应活性。例如：Asn-Gly 3. 甘氨酸也出现在酶催化蛋白质特异性修饰的识别位点，例如N 端的十四酰基化（CH2(CH2)12CO －)和精氨酸甲基化的信号序列。 丙氨酸 (Ala A ) 结构：是20种氨基酸中最没有“个性”的氨基酸，没有长侧链，没有特别的构象性质，可以出现在蛋白质结构的任何部位。 特征： 1、 丙氨酸是蛋白质中含量最丰富的氨基酸残基 之一，弱疏水性。 2、 化学活性非常弱。 缬氨酸 (Val V) 特征：中度疏水的脂肪族侧链残基。 功能： 3、 这个中度疏水残基β碳原子上的甲基降低了 蛋白质的构象的灵活性。 2、使邻近的肽键的化学反应产生空间位阻，特别是相邻残基具有β-分支的侧链（缬氨酸或异亮氨酸）。 异亮氨酸 （Ile I ） 特征：疏水的脂肪族残基侧链 功能： 1. β-分支链在空间上阻碍邻近的肽键反应。 2. 疏水侧链趋向在折叠蛋白的内部，比起α螺 旋这种侧链在二级结构中更容易形成β折叠。